芥藍(lán)BoaBKI1基因的克隆及表達(dá)分析

梁 莎，黃文莉，李香香，王依霖，張晨璐，張 芬，孫 勃

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，成都 611130）

芥藍(lán)（Brassica oleracea var.alboglabra）是十字花科蕓薹屬一、二年生草本植物[1]，原產(chǎn)于中國南部[2]，是我國的特色蔬菜之一，以花薹和嫩葉供食用，兼?zhèn)錉I養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。芥藍(lán)富含維生素C、類胡蘿卜素、多酚和芥子油苷等多種生物活性物質(zhì)，在抗氧化及抗癌等方面作用顯著[3-4]。

油菜素甾醇（brassinosteroids，BRs）是一類植物激素，存在于植物大部分器官中。它們在植物的生長發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)性過程中占據(jù)著重要地位[5-6]，包括促進(jìn)細(xì)胞的伸長、分裂和衰老、促進(jìn)維管束的分化、調(diào)節(jié)雄性育性和抗逆性以及影響光形態(tài)的建成等[7-9]。1979年，人們首次在油菜的花粉中得到純化的油菜素甾醇，迄今為止分離出的BR類化合物已經(jīng)超過70種[10]。

從發(fā)現(xiàn)BR開始，科研人員一直在鑒定其各種組分，并不斷探索它的合成途徑，在1997年成功克隆了第一個BR不敏感突變體，意味著BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究進(jìn)入了新階段[11]。此后，人們通過遺傳學(xué)和生物化學(xué)等方法，探索出BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一部分，并初步研究了BR對植物生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)制。BR在細(xì)胞膜上首先被富含亮氨酸的受體激酶BRI1（brassinosteroid-insensitive 1）所感知，隨后BRI1和BAK1（BRI1-associated receptor kinase 1）受體復(fù)合物被激活并啟動多重激酶和磷酸酶的級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致 BES1（BRI1-EMS-suppressor 1）和 BZR1（brassinazole resistant 1）等相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的去磷酸化和活化，實(shí)現(xiàn)信號向下游的傳遞，調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)[12]。在整個信號傳導(dǎo)過程中，BRI1及其他多個組分的突變均會使BR信號減弱，從而導(dǎo)致植物生長異常，例如植株矮小、延遲開花以及雄性不育等，而增強(qiáng)BR信號可以促進(jìn)植物生長和纖維素的生物合成[13]。

BKI1（BRI1 kinase inhibitor 1）是BR信號通路中的一種重要調(diào)節(jié)因子。在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，BKI1是一種受體激酶抑制劑，是缺少BR時(shí)使BRI1處于基礎(chǔ)水平所必需的。它通過阻斷BRI1與BAK1結(jié)合，阻止活性受體復(fù)合物的產(chǎn)生來負(fù)調(diào)節(jié)質(zhì)膜上的BRI1[14]。當(dāng)用BR處理后，磷酸化的BKI1能夠與14-3-3蛋白作用，競爭性抑制后者與BES1的結(jié)合，促進(jìn)BES1的去磷酸化，行使對BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)控功能。因此，BKI1在BR信號通路中起到正負(fù)調(diào)控的雙重作用[5]，但具體作用機(jī)制還不清楚。

蔬菜作物的生長發(fā)育和抗逆與BR途徑密切相關(guān)。一直以來，關(guān)于BR的信號傳導(dǎo)途徑的研究大多是圍繞于擬南芥和煙草等模式植物[15]，而在芥藍(lán)等蕓薹屬蔬菜中的研究還鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)克隆芥藍(lán)BoaBKI1基因的全長，并對其進(jìn)行序列分析和時(shí)空表達(dá)分析，以期豐富對芥藍(lán)油菜素甾醇研究的認(rèn)知，為進(jìn)一步研究芥藍(lán)中油菜素甾醇的信號傳導(dǎo)機(jī)制奠定一定分子基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)以白花芥藍(lán)品種‘四季粗條’為材料。芥藍(lán)種子浸濕于25℃培養(yǎng)箱放置2 d，取萌動種子材料，其余種子繼續(xù)培養(yǎng)成植株至成熟結(jié)莢。在生長過程中，分別對其不同時(shí)期（子葉期、真葉期和成熟葉期）、成熟期不同器官（幼果、果莢、葉片、葉柄、花序、根系和花薹）、花蕾期花器官（花瓣、花萼、雄蕊、雌蕊）和盛開期花器官（花瓣、花萼、雄蕊和雌蕊）進(jìn)行取樣[16]，每個樣品取3個重復(fù)，每個重復(fù)各2 g，經(jīng)液氮速凍后置于-80℃冰箱保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒、載體T-vector pMD19購于大連寶生物公司，Taq酶購于北京全式金生物技術(shù)股份有限公司，DNA膠回收試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 DNA提取

以芥藍(lán)葉片為材料，采用CTAB法進(jìn)行DNA的提取，將產(chǎn)物置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 總RNA提取及cDNA合成

以芥藍(lán)分別以芥藍(lán)不同時(shí)期葉片、成熟期不同器官以及花蕾期和盛開期的花器官為材料，使用改良CTAB法提取對應(yīng)的總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量。取用質(zhì)量合格的總RNA參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成，將產(chǎn)物置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 BoaBKI1基因克隆

根據(jù)NCBI網(wǎng)站已公開的近源物種甘藍(lán)、白菜等BKI1基因的序列設(shè)計(jì)引物（表1），并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以DNA和cDNA分別為模板，使用全式金TranStart FastPfu Fly DNA PolymeraseTaq酶進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：模板2 μL，上下游引物10 μmol/L各2 μL，10×PCR Buffer 10 μL，2.5 mmol/LdNTP 4 μL，Taq酶 1 μL，DEPC處理水29 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，循環(huán)數(shù)40；最后72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用DNA膠回收試劑盒純化回收目的基因BoaBKI1條帶。

表1 芥藍(lán)BoaBKI1克隆和表達(dá)所用引物Table 1 Primer sequences for cloning and expression of BoaBKI1 genes in Chinese kale

連接目的基因片段至T-vector pMD19，16℃下過夜。將連接產(chǎn)物加入大腸桿菌感受態(tài)中，涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)過夜。挑取培養(yǎng)基的單克隆菌落，于LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，菌液PCR后篩選陽性克隆，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析。

1.6 生物信息學(xué)分析

利用NCBI-ORF、ProtParam、DNAStar、SignaIP、softberry-ProtComp、TMHMM、NCBI-CDD、DNA-man和MEGA 6.0等軟件，對得到的BoaBKI1基因核苷酸序列進(jìn)行開放閱讀框?qū)ふ襕17]、計(jì)算分子量、等電點(diǎn)和不穩(wěn)定系數(shù)，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，信號肽預(yù)測、亞細(xì)胞定位預(yù)測、跨膜區(qū)預(yù)測和保守結(jié)構(gòu)域分析，氨基酸多重序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建[18]。

1.7 基因表達(dá)半定量分析

根據(jù)已克隆得出的芥藍(lán)BoaBKI1基因序列，設(shè)計(jì)半定量引物BKI1semiRT，內(nèi)參基因β-actin參考引用Yi D.X.等的引物（表1）[19]。以芥藍(lán)不同時(shí)期、不同組織器官的cDNA為模板，進(jìn)行半定量PCR分析。使用2×Easy TaqPCR SuperMix for PAGE進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：cDNA模板1 μL，上下游引物10 μmol/L各 1 μL，2×Easy TaqPCR SuperMix 10 μL，DEPC 處理水 7 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，BoaBKI157 ℃ 30 s，β-actin55℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，采用Gel-Pro軟件對電泳結(jié)果進(jìn)行光密度定量分析，基因表達(dá)水平用相對于β-actin基因表達(dá)量的百分?jǐn)?shù)值表示，3次重復(fù)，所得數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2013和SPSS 18.0軟件進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 芥藍(lán)BoaBKI1基因克隆

分別以芥藍(lán)DNA和cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測發(fā)現(xiàn)條帶均約1 000 bp，與預(yù)測片段的大小相符（圖1），然后分別進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收、連接至載體、轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆進(jìn)行測序，兩者的測序結(jié)果完全一致，測序所得序列為1 026 bp，將該基因命名為BoaBKI1，其在GenBank中的登錄號為：KX426041。

圖1 BoaBKI1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Figure 1 PCR amplification product of BoaBKI1

2.2 序列分析

利用NCBI、DNA-man軟件對芥藍(lán)BoaBKI1基因進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)該基因只有一個外顯子，并無內(nèi)含子。進(jìn)一步通過NCBI-ORF、ExPASy軟件對芥藍(lán)BoaBKI1基因所編碼的氨基酸進(jìn)行理化分析，結(jié)果表明BoaBKI1由20種氨基酸共341個氨基酸殘基組成，其理論分子量為37.30 kD，等電點(diǎn)為9.67，分子式為C1603H2586N476O534S7，不穩(wěn)定指數(shù)為54.20，是不穩(wěn)定蛋白。

利用DNAstar軟件對芥藍(lán)BoaBKI1蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析（圖2），依據(jù)Chou-Fasman法，發(fā)現(xiàn)BoaBKI1蛋白的α螺旋結(jié)構(gòu)有8個，β折疊結(jié)構(gòu)有7個，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)有31個；KarplusSchultz法預(yù)測BoaBKI1柔性結(jié)構(gòu)區(qū)段有12個；KyteDoolittle法預(yù)測BoaBKI1蛋白大多數(shù)氨基酸為親水性氨基酸。

圖2 BoaBKI1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Figure 2 Secondary structure prediction of BoaBKI1 protein

SignaIP軟件預(yù)測顯示，BoaBKI1蛋白不存在明顯的信號肽，屬于非分泌性蛋白；softberry-ProtComp軟件對其進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示BoaBKI1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜。所得氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，沒有推定的保守結(jié)構(gòu)域被檢測到。

使用NCBI-BLASTp程序進(jìn)行芥藍(lán)BoaBKI1氨基酸序列（圖3）的同源性比對，結(jié)合DNA-man軟件進(jìn)行分析（圖4），多重序列比對結(jié)果顯示：芥藍(lán)BKI1蛋白與甘藍(lán)的序列一致性達(dá)到100%，與同屬植物歐洲油菜、蕪菁的一致性超過97%，與同為十字花科植物的擬南芥、亞麻芥和薺菜的一致性超過75%，與葡萄、菜豆、陸地棉和毛果楊等植物的一致性不低于30%。

圖3 BoaBKI1基因編碼區(qū)及氨基酸序列Figure 3 CDS and amino acid sequences of BoaBKI1 gene

圖4 BoaBKI1與其他植物BKI1蛋白的氨基酸序列比對Figure 4 Amino acid sequence alignment of BoaBKI1 protein with other BKI1 proteins

在同源性分析的基礎(chǔ)上，將來自33種不同植物的BKI氨基酸序列以距離矩陣法中的鄰接法（neighbor-joining method）做N-J聚類分析，構(gòu)建進(jìn)化樹（圖5）。結(jié)果顯示，33種植物首先分為兩個大的類群，一類為大葉藻、蒺藜苜蓿、薊和鷹嘴豆等較低等植物，另一類為其它草本及木本植物。在草、木本植物的大類群中又可以分為兩類，一類為白花菜目的十字花科和白花菜科植物，另一類為除白花菜目的其他草、木本植物。白花菜目植物中，芥藍(lán)首先與9種十字花科植物聚在一小類，其中又與同為蕓薹屬蔬菜的甘藍(lán)、歐洲油菜以及蕪菁的距離更近，且與甘藍(lán)和歐洲油菜在同一分支。

2.3 BoaBKI1基因表達(dá)分析

2.3.1 BoaBKI1在不同時(shí)期的表達(dá)

芥藍(lán)BoaBKI1基因在萌動種子期、子葉期、真葉期和成熟葉片期均有表達(dá)，并且在整個發(fā)育時(shí)期中，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中真葉期表達(dá)量最高，其次為子葉期和成熟葉片期，萌動種子期的表達(dá)量最低（圖6）。

2.3.2 BoaBKI1在成熟期不同器官的表達(dá)

圖6顯示BoaBKI1基因在芥藍(lán)不同器官中均有表達(dá)，其中在葉片、葉柄中的表達(dá)水平明顯高于其他器官，在果莢中的表達(dá)量次之，在幼果、根系中的表達(dá)量較低，在花序、花薹中表達(dá)水平最低。

圖6 芥藍(lán)不同發(fā)育時(shí)期和不同器官中BoaBKI1的表達(dá)Figure 6 Expression of BoaBKI1 in different developmental stages and organs of Chinese kale

2.3.3 BoaBKI1在花器官的表達(dá)

對芥藍(lán)花器官中BoaBKI1的表達(dá)水平進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，BoaBKI1基因在花蕾和開放花朵的各組織中均有表達(dá)。花蕾中花瓣和雌蕊的BoaBKI1表達(dá)水平最高，其次是雄蕊，萼片中表達(dá)水平最低。開放花朵中雌蕊表達(dá)量最高，其次是雄蕊和花瓣，萼片中表達(dá)量最低。伴隨花朵開放，BoaBKI1基因在各組織中表達(dá)水平均出現(xiàn)上調(diào)，其中雌蕊和雄蕊上調(diào)趨勢最為顯著（圖7）。

圖7 芥藍(lán)花器官不同組織BoaBKI1的表達(dá)量Figure 7 Expression of BoaBKI1 in different tissues of flower organs in Chinese kale

3 討論

本試驗(yàn)克隆獲得了芥藍(lán)油菜素甾醇相關(guān)基因BoaBKI1的cDNA序列，同源序列比對及進(jìn)化樹分析表明BoaBKI1與其他植物的BKI1蛋白在氨基酸序列上有較高的一致性，與同為蕓薹屬的甘藍(lán)和歐洲油菜在同一分支，與蘋果等木本植物在不同分支，即BKI1蛋白在同科屬植物間較為保守，在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的不同屬植物間較不保守。據(jù)亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，BoaBKI1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，這與擬南芥AtBKI1在煙草上的定位結(jié)果相同[20]，由此可推測該基因可能在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜上參與BR信號途徑的調(diào)控。

基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，BoaBKI1基因在芥藍(lán)不同發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)。其中，真葉期表達(dá)量最高，子葉期次之，萌動種子期的表達(dá)量最低；在芥藍(lán)不同器官中也均有表達(dá)，其中在葉片、葉柄中的表達(dá)水平明顯高于其他器官，在果莢中的表達(dá)量次之。Wang X.L.等[21]研究了AtBKI1在擬南芥幼苗中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)AtBKI1在兩周大幼苗葉片、葉柄和莖尖中的表達(dá)量高，在根中的表達(dá)量次之，果莢中的最低，這與我們的試驗(yàn)結(jié)果基本一致。劉彩霞等[22]在對甘藍(lán)型油菜BRI1的研究中發(fā)現(xiàn)，各時(shí)期及器官中BRI1表達(dá)情況為四葉一心時(shí)期的葉中最高，根中較低。此外，郝嶺等[23]的研究進(jìn)一步表明了玉米幼嫩組織中BRI1表達(dá)量高，它能促進(jìn)葉片變大與葉柄伸長。在以往研究中發(fā)現(xiàn)，BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中BRI1與BKI1的密切關(guān)聯(lián)，它們在植物體內(nèi)的相互作用具有高度特異性，且兩者在植物中的表達(dá)規(guī)律有相似之處，這顯示了BRI1和BKI1在一些組織中共表達(dá)的可能性[21]。種子形成時(shí)，為提供大量營養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)種子成熟，植物體內(nèi)的BR激素合成增加，誘導(dǎo)BRI1-BAK1蛋白質(zhì)受體合成[22]，此時(shí)，活化的BRI1將BKI1磷酸化，并使其從質(zhì)膜上脫離并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[12]，致使BKI1在果莢中的表達(dá)量較低。至于萌動種子期，推測是因?yàn)榉N子萌發(fā)主要是BR與其他植物激素互作促進(jìn)的[24]，且該時(shí)期BRI1的表達(dá)量較低[22]，BKI1可能與BRI1的結(jié)合并不劇烈而使得表達(dá)量較低。

BoaBKI1基因在花蕾和開放花朵的各組織中均有表達(dá)。在這兩個花器官中，花蕾中花瓣BoaBKI1的表達(dá)水平最高，開放花朵中則是雌蕊，而兩者中表達(dá)量最低的都是萼片。花瓣的展開是由花蕾到開放花朵轉(zhuǎn)變的明顯標(biāo)志，為了促進(jìn)花朵的開放，一些BR信號通路上的基因如BRI1的表達(dá)有所上升[25]，相應(yīng)的，為了使BRI1的表達(dá)量維持在一定水平[12]，花瓣中BKI1表達(dá)量也會隨之增加。BR是由花粉提純而來的活性物質(zhì)，可通過降低開花抑制因子的轉(zhuǎn)錄水平來促進(jìn)花朵的開放[26]，從花蕾到花朵開放，雄蕊產(chǎn)生花粉的速度增加，花粉的活力逐漸增強(qiáng)，此時(shí)的雄蕊中BR儲備豐富，造成了大部分BKI1與BRI1脫離。隨著花朵的逐漸開放，在雌蕊中BR含量可能會有略微增加，BRI1的表達(dá)量受到BR刺激也會有所增加，Nie S.M.等[27]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)BRI1的番茄株系中花變大，花瓣和花柱均變長，花柱變長后，可能會阻礙花粉進(jìn)入子房，造成結(jié)實(shí)率下降，為了避免這一現(xiàn)象，雌蕊中的BKI1的表達(dá)量會大幅增加[21]，從而與大部分BRI1結(jié)合，使得結(jié)實(shí)率維持在一定水平。BoaBKI1在萼片中表達(dá)量最低，可能是BR信號通路主要在雄蕊、雌蕊和花瓣這幾個組織中起作用，從而促進(jìn)開花受精形成種子。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功克隆了芥藍(lán)BR信號傳導(dǎo)途徑中的受體激酶抑制劑BoaBKI1，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，接著通過對BoaBKI1進(jìn)行時(shí)空表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)該基因在芥藍(lán)的不同時(shí)期、器官和組織中都有一定程度的表達(dá)，說明該基因在芥藍(lán)的不同生長發(fā)育過程中均起到作用。所得結(jié)果為研究芥藍(lán)BoaBKI1的功能和在BR信號傳導(dǎo)過程中的調(diào)節(jié)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。