基于COⅠ基因序列的云南人工養(yǎng)殖黃腳胡蜂遺傳多樣性分析

王宇宸 ，陶守超 ，李晨陽 ，施 雯 ，和秋菊 *，易傳輝

（1.云南省森林災害與控制重點實驗室，昆明 650224；2.西南林業(yè)大學生物多樣性保護學院，昆明 650224；3.云南生物多樣性研究院，昆明 650224）

目前世界已知胡蜂科昆蟲約6 000種，胡蜂屬23種，其中中國有胡蜂科昆蟲200余種，胡蜂屬昆蟲17種。黃腳胡蜂(Vespa velutinaLepeletier,1836)屬膜翅目Hymenoptera胡蜂科Vespidae昆蟲，在中國有4個亞種，分別為凹紋胡蜂V.v.aurariaSimth、異凹紋胡蜂V.v.varianavan der Vecht、墨胸胡蜂V.v.nigrithoraxBuysson和黃足凹紋胡蜂V.v.flavi?tarsusSonan[1]；主要分布于中國（福建、廣東、廣西、貴州、江西、云南、四川、江蘇等）、印度和東南亞等地[2-3]。黃腳胡蜂具有豐富的營養(yǎng)、保健和藥用價值[4-5]。近年來，在云南等南方各地廣泛進行人工養(yǎng)殖，一方面增加了山區(qū)農(nóng)民的收入，但另一方面也因其放養(yǎng)的養(yǎng)殖方式，導致生態(tài)系統(tǒng)中胡蜂種群的爆炸式增長，對當?shù)厣锒鄻有栽斐闪瞬焕绊?，尤其是對傳粉昆蟲蜜蜂的種群數(shù)量影響巨大[6-11]。最近幾年黃腳胡蜂作為外來物種，已入侵韓國、日本和歐洲大部分地區(qū)，給當?shù)貍鞣劾ハx特別是蜜蜂的種群數(shù)量造成了嚴重影響[12-14]。目前主要對歐洲地區(qū)黃腳胡蜂的生物入侵方面進行了研究[15-16]，J.S.Kim等[17]對墨胸胡蜂及R.Takahashi等[18]對黃腳胡蜂線粒體基因全序列進行了研究。由于在演化過程中昆蟲的線粒體基因具有選擇壓力小、突變易穩(wěn)定遺傳、在群體中變異率較高等特點，常被用作系統(tǒng)發(fā)育、種群遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳分化研究的分子標記[19-21]，在線粒體基因中COⅠ基因因其具有豐富的變異，在遺傳學研究中應用尤其廣泛[22-23]。本研究基于COⅠ基因序列對云南地區(qū)主要人工養(yǎng)殖區(qū)的黃腳胡蜂種群遺傳多樣性進行研究，以期掌握本區(qū)域養(yǎng)殖種群遺傳多樣性狀況，并通過了解親緣關(guān)系養(yǎng)殖種群的原始來源，為該物種科學養(yǎng)殖與利用和入侵種群危害管理提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 研究樣品

供試蟲源：來自云南省內(nèi)的8個地級市（表1），將采集到的黃腳胡蜂放入裝有無水乙醇的1.5 mL離心管中封存，記錄相關(guān)采集信息并編號，置-40℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 黃腳胡蜂云南不同養(yǎng)殖種群樣品信息Table 1 The data of different breeding populations of V.velutina in Yunnan

1.2 總DNA提取、PCR擴增及測序

選取各種群黃腳胡蜂職蜂1頭，取10 mg胸部肌肉用于DNA提取，采用Magen公司的HiPure Insect DNA Kit試劑盒，參考說明書提取黃腳胡蜂的總DNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的完整性。以提取的總DNA為模板，采用DNA條形碼COⅠ基因的通用引物LCO1490(5’-GGTC AACAAATCATAAAGATATTG-3’)和HCO2198(5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAT-3’)[24-25]進 行PCR擴增。PCR擴增反應體系為30 μL，3 μL模板DNA，正向引物1 μL，反向引物1 μL，Taq PCR Master Mix 15 μL，去離子水10 μL。擴增反應在GmbH Power Cycler SL 96型PCR儀上完成，PCR反應程序為：94℃預變性3 min；94℃變性30 min，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃補償延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠于1×TAE緩沖液中電泳，電壓70 V，電泳時間約45 min。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測并拍照保存，將有清晰條帶的擴增產(chǎn)物送至北京擎科生物有限公司昆明分公司進行雙向測序。

1.3 DNA數(shù)據(jù)處理

運用BioEdit 7.2.6軟件對測序返回的數(shù)據(jù)進行序列的雙向?qū)Ρ龋コ笔?、雙峰序列和兩端不穩(wěn)定的序列，翻轉(zhuǎn)反向序列進行核對，查看是否存在缺失的位點，保存后應用在線軟件Mafft（http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/）G-INS-1策略進行多重序列對比，使用NCBI數(shù)據(jù)庫中Blast功能對校對后的序列進行同源性比對，確定其為黃腳胡蜂的目的基因序列。將在線比對的保守區(qū)FASTA文件導入DAMBE軟件進行替換飽和檢測，若ISS

利用BioEdit處理軟件校對檢驗序列，進行遺傳多樣性分析；利用DNASP 5.1軟件統(tǒng)計各個種群的位點和堿基構(gòu)成，并分析各養(yǎng)殖種群核酸平均差異度K、核苷酸多度Pi、單倍型多度Hd，總?cè)后w以及群體間的遺傳多樣性和差異性；利用MEGA 6.05軟件基于Kimura2-Parameters模型，計算各個養(yǎng)殖種群之間核苷酸的遺傳距離；利用PopART軟件構(gòu)建COⅠ單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖；通過DAMBE軟件進行核苷酸序列飽和度檢測，并用MEGA 6.05軟件中的雙參數(shù)模型分析[26]，分別用最大似然法（ML）和鄰接法（NJ）構(gòu)建分子系統(tǒng)樹；利用Arlequin軟件中的AMOVA進行分子方差分析，計算遺傳變異在種群間和種群內(nèi)的方差貢獻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃腳胡蜂線粒體COⅠ基因序列特征、變異情況及單倍型分析

對黃腳胡蜂云南不同人工養(yǎng)殖種群的175條DNACOⅠ基因序列雙向測序，獲得大小約700 bp片段。利用Chromas軟件和Bioedit軟件進行序列對比，去除含有雜合子質(zhì)量較低序列后，最終獲得154條序列長度約為621 bp的COⅠ基因序列。其中保守位點614個，遺傳變異位點7個，5個簡約信息位點和2個單一變異位點，序列中無堿基插入或缺失等情況。COⅠ序列中堿基A、T、C和G的含量分別是34.43%、26.23%、22.95%和16.39%，其中A+T的含量為60.66%，G+C含量為39.34%，結(jié)果表明黃腳胡蜂COⅠ基因序列具有A+T堿基偏向性。在154個樣本中，共檢測出7個單倍型（表2），命名為Hap1～Hap7。KM、CX、HH、WS和PE群體中都檢測有2個單倍型；BS、LC和QJ種群中只含有1個單倍型；Hap1為除臨滄外其余7個種群的共享單倍型，分布最為廣泛；Hap2為CX獨享單倍型，Hap3為HH獨享單倍型，KM有2個獨享單倍型Hap4和Hap5，Hap6為LC獨享單倍型，Hap7為PE和WS共享。

表2 云南人工養(yǎng)殖黃腳胡蜂COⅠ基因序列單倍型差異Table 2 Haplotypes difference of COⅠgene sequence in V.velutina in Yunnan

2.2 黃腳胡蜂種群遺傳多樣性分析

各養(yǎng)殖種群的核酸平均差異度（K）、核苷酸多度（Pi）、單倍型多度（Hd）分析結(jié)果顯示（表3）：總?cè)后w的Hd為0.608 61，K為0.892 62，Pi為0.001 44。不同養(yǎng)殖種群間Pi在0～0.000 79之間，Hd在0～0.6之間，其中BS、QJ、LC 3個種群Hd、K、Pi最低，均為0。中性檢測結(jié)果不顯著（Tajima's D=-0.625 98，P>0.10），說明供試黃腳胡蜂總?cè)后w在過去較近歷史時期群體大小相對穩(wěn)定，沒有經(jīng)歷明顯群體擴張和持續(xù)增長。

表3 黃腳胡蜂云南不同養(yǎng)殖種群COⅠ基因單倍型與核苷酸多樣性分析Table 3 COⅠhaplotype and nucleotide diversity in different breeding populations of V.velutina in Yunnan

對黃腳胡蜂云南不同人工養(yǎng)殖種群間的核苷酸差異數(shù)(Kxy)與核苷酸歧義度(Dxy)比較顯示（表4），各種群核苷酸平均差異數(shù)在0～2.098 25之間，核苷酸歧義度在0.000 00～0.003 98之間，表明各養(yǎng)殖種群間的遺傳差異較小。

2.3 黃腳胡蜂種群間遺傳距離

遺傳距離分析顯示（表5），各種群間的核苷酸遺傳距離在0.000～0.004之間，其中KM與LC種群間的遺傳距離最大，為0.004，HH與BS、PE與BS、QJ與BS、QJ與HH間遺傳距離為0。結(jié)果表明，各養(yǎng)殖種群之間具有一定的遺傳距離，但總體上未出現(xiàn)種群分化現(xiàn)象。而與OUT種群之間的遺傳距離均為0.176。Mantel相關(guān)性分析顯示（圖1），地理距離與遺傳距離之間沒有顯著的相關(guān)性（r=0.141 1，P=0.24>0.05），表明各養(yǎng)殖種群間遺傳距離不是由地理距離決定的。

圖1 黃腳胡蜂8個不同人工養(yǎng)殖種群的遺傳距離與地理距離Mantel檢驗Figure 1 Mantel test of genetic distance vs.geographical distance among 8 different breeding populations of V.velutina

表5 黃腳胡蜂云南不同養(yǎng)殖種群之間的遺傳距離Table 5 Genetic distance of the different breeding population of V.velutina in Yunnan

2.4 黃腳胡蜂mt DNA COⅠ單倍型的進化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

COⅠ單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖顯示（圖2），整個進化網(wǎng)絡(luò)呈放射狀，在群體中具有較高遺傳頻率的單倍型Hap1、Hap7位于單倍型進化網(wǎng)絡(luò)圖中間，其余遺傳較低的單倍型在外圍與遺傳頻率較高的連接，由于單倍型較少，不能明顯看出該物種的進化方向。

圖2 mtDNA COⅠ基因7個單倍型的進化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系Figure 2 Median joining network of 7 mtDNA COⅠgene haplotypes

2.5 分子系統(tǒng)樹及親緣關(guān)系

核苷酸序列飽和度檢測顯示差異顯著（Iss（0.004 9）

圖3 基于COⅠ基因構(gòu)建的黃腳胡蜂云南不同養(yǎng)殖種群ML系統(tǒng)樹Figure 3 ML tree of different breeding populations of V.velutina in Yunnan on COⅠsequences

圖4 基于COⅠ基因構(gòu)建的黃腳胡蜂云南不同養(yǎng)殖種群NJ系統(tǒng)樹Figure 4 NJ tree of different breeding populations of V.velutina in Yunnan on COⅠsequences

2.6 基因流與遺傳分化

分子方差分析顯示（表6），各養(yǎng)殖種群存在著一定程度變異，各養(yǎng)殖種群之間(Va)的方差組分為0.367 35，其方差比為26.38%，而種群內(nèi)(Vb)的方差組分1.025 18，方差比為73.62%，F(xiàn)st為0.031 63，小于0.05，表明遺傳變異主要來源于種群內(nèi)部，種群之間的變異小，遺傳分化程度較低，符合該蜂群居生活和人工養(yǎng)殖的特點。

3 討論與結(jié)論

線粒體DNA(mtDNA)是常用的分子遺傳標記，其中的線粒體細胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因在昆蟲種類鑒定、種群遺傳多樣性、物種的系統(tǒng)進化等研究方面得到廣泛應用[27]。本研究基于mtDNA COⅠ基因，對云南省黃腳胡蜂8個養(yǎng)殖種群遺傳多樣性進行了分析。結(jié)果顯示，黃腳胡蜂mtDNA COⅠ基因A+T含量占60.66%，具有明顯的A+T堿基偏向性，符合昆蟲線粒體的堿基組成特征，但含量較整個線粒體基因組低[17-18]。單倍型分析發(fā)現(xiàn)，7個單倍型中，Hap1為除臨滄外其余7個種群的共享單倍型，分布最廣泛，認為是群體中適應性強的原始單倍型，可能來源于親緣關(guān)系相近原始種群。單倍型常用于各種群親緣關(guān)系分析，M.Husemann等[28]利用單倍型分析了入侵德國漢堡的黃腳胡蜂亞種黑胸胡蜂的來源，分析認為其來源于南歐，而非亞洲；黃腳胡蜂mtDNA COⅠ基因核苷酸多樣性水平偏低，僅為0.001 44，表明不同地區(qū)養(yǎng)殖種群可能來源于少數(shù)相同原始種群，近似于自然種群經(jīng)歷過“瓶頸效應”，之后短時期內(nèi)的快速擴張，核苷酸變異積累不足[29]。各種群遺傳距離較小，地理位置遠近關(guān)系對其遺傳差異變化影響不明顯，F(xiàn)st值僅為0.031 63，表明變異主要來源為種群內(nèi)部，揭示原始養(yǎng)殖種群可能來源單一，親緣關(guān)系較近。這與最初養(yǎng)殖種群多數(shù)來源于保山龍陵相符，全國胡蜂熱的興起始于龍陵人黃國忠的培訓和提供的種源[6]，大部分養(yǎng)殖戶原始養(yǎng)殖種源均來源于保山龍陵或其種群后代[30]。黃腳胡蜂mtDNA COⅠ基因單倍型多樣性偏高，表明養(yǎng)殖過程中引入種群與當?shù)胤N群存在基因交流，與作者調(diào)查發(fā)現(xiàn)的當前養(yǎng)殖現(xiàn)狀吻合，養(yǎng)殖戶常在養(yǎng)殖過程中引入當?shù)胤N源與之雜交（主要是雄蜂）。

胡蜂是傳粉昆蟲的主要天敵，入侵胡蜂常導致關(guān)鍵傳粉昆蟲下降，胡蜂人工養(yǎng)殖的快速興起，已對當?shù)貍鞣劾ハx等造成嚴重影響[6,12-16]。人工養(yǎng)殖一方面造成當?shù)睾浞N群幾何級的增加；另一方面，大部分種源從外地引入并續(xù)代繁育，大量個體逃逸野外，與當?shù)胤N群雜交，當?shù)睾浞N群遺傳多樣性和適應性快速增加，勢必引起當?shù)卣麄€生態(tài)系統(tǒng)的劇烈擾動，可能造成整個生態(tài)系統(tǒng)的失衡和破壞?；谘芯拷Y(jié)果，建議黃腳胡蜂人工養(yǎng)殖種群盡量采用本地種源，并不斷從當?shù)匾巴獠杉N源加以更新，一方面可以增加養(yǎng)殖種群的遺傳多樣性，防止種群退化；另一方面可以防止外來種群因養(yǎng)殖逃逸而造成入侵，對當?shù)厝汉蜕锒鄻有栽斐刹涣加绊?。進一步加強胡蜂人工養(yǎng)殖的研究，特別是養(yǎng)殖技術(shù)，逐步實現(xiàn)封閉設(shè)施養(yǎng)殖，以減少當前環(huán)境中因人工養(yǎng)殖而造成大幅增加的胡蜂種群數(shù)量和蜂王逃逸對野生種群遺傳多樣性的影響；同時，加強人工養(yǎng)殖地區(qū)胡蜂對蜜蜂等關(guān)鍵物種的影響研究，提出有效的保護方案，以減小人工養(yǎng)殖地區(qū)胡蜂對蜜蜂和其他生物多樣性的嚴重影響。