UFLC法同時測定黃芩湯中3個有效成分的含量

崔 悅，湯鑫淼，2，范琢玉，2，關(guān) 皎，朱鶴云*，馮 波* (.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 3203；2.延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林 延吉 33002)

黃芩湯是張仲景所著《傷寒論》中的經(jīng)典名方，包括黃芩、甘草、白芍和大棗四味藥材，其中黃芩是君藥，芍藥是臣藥，甘草是佐藥，大棗是使藥[1]。文獻(xiàn)報道，黃芩湯對于潰瘍性結(jié)腸炎具有良好的治療作用[2]，其有效成分能夠轉(zhuǎn)運至大腸，對瀉痢等疾病發(fā)揮出局部治療作用[3]。

黃芩作為黃芩湯中的君藥，含有多種黃酮類化合物如漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎和抗?jié)冏饔茫l(fā)揮著主要的治療作用[4-5]。漢黃芩素可通過調(diào)控Ywhaz蛋白抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移；黃芩素可抑制HeLa細(xì)胞和U14宮頸癌荷瘤小鼠腫瘤生長[6]。因此分析黃芩湯中成分對其質(zhì)量控制和深入研究具有重要意義。目前，有關(guān)黃芩湯成分的測定主要是采用高效液相色譜法[8]，尚缺乏黃芩湯中黃芩的多種有效成分的含量測定，且已有方法分析時間較長、靈敏度較差。超快速液相色譜(ultra-fast liquid chromatography，UFLC)分析方法分離效果好，分析時間短，節(jié)省溶劑，適合中藥復(fù)方成分的分離分析[8-9]。本實驗建立了一種UFLC法可同時測定黃芩中漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的含量，為黃芩湯的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

Prominence UFLC型超高快速液相色譜儀(日本島津)；XK96-A快速混勻器(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)；N-1300-WB型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本EYELA東京理化器械株式會社。

黃芩、甘草、芍藥和大棗藥材購買自吉林大藥房。乙腈和甲醇均為色譜純，購自美國Fisher公司。對照品均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司：漢黃芩苷(141214，純度>98%)，黃芩素(150320，純度>98%)，漢黃芩素(150319，純度>98%)。

1.2 色譜條件

色譜柱為Shimadzu Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm×3.0 mm，2.2 μm)；流動相由0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)組成，梯度洗脫(0～30 min，10%～70%B)，流速0.4 mL/min，在274 nm波長下檢測，柱溫保持在35 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素典型色譜圖見圖1。

1.漢黃芩苷;2.黃芩素,3.漢黃芩素

1.3 對照品溶液的配制

分別稱取5 mg漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對照品，用甲醇定容至5 mL，配制成濃度為1.0 mg/L的各對照品儲備液。

1.4 供試品溶液的制備

1.4.1黃芩湯的制備

稱取黃芩9 g，炙甘草、白芍、大棗各6 g，加入10倍量的乙醇，然后將其煮沸1 h為第1次煎煮，趁熱過濾，殘渣再次加入8倍量的乙醇煮沸1 h為第2次煎煮，將第1次與第2次回流提取的濾液混合，合并于干凈的容器內(nèi)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮至80 mL，置于容量瓶中，所得即黃芩湯。

1.4.2黃芩湯供試品溶液制備

精密吸取“1.4.1”中黃芩湯0.1 mL，加入甲醇0.9 mL，渦旋5 min，用0.22 μm濾膜濾過，續(xù)濾液即為供試品溶液。

1.4.3陰性樣品的制備

除不加黃芩外，其余按照“1.4.1”項下制備得不含黃芩的陰性樣品溶液。

1.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“1.3”中對照品儲備液，以甲醇為溶劑依次稀釋配制成濃度為1、2、5、10、20、50 mg/L的混合對照品溶液，按照上述色譜條件分別進(jìn)樣，得到不同濃度下不同對照品對應(yīng)的峰面積。分別以各成分的濃度X(mg/L)為橫坐標(biāo)，以相對應(yīng)的色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

1.6 精密度試驗

吸取10 mg/L的混合對照品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次。

1.7 穩(wěn)定性試驗

取同一批次的黃芩湯樣品溶液，分別在放置不同時間(0、2、4、8、12、24 h)后,按上述色譜條件進(jìn)樣分析。

1.8 重復(fù)性實驗

同法制備6份黃芩湯樣品后制備6份供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析。

1.9 回收率試驗

分別向已知含量的黃芩湯樣品(漢黃芩苷0.132 g/L、黃芩素0.264 g/L和漢黃芩素0.140 g/L)9份中加入相當(dāng)于樣品中三種成分含量80%、100%、120%的對照品溶液各3份，計算其回收率。

1.10 樣品含量測定

取6批黃芩湯樣品制成供試品溶液，分析并計算3種成分的含量。

2 結(jié) 果

2.1 線性關(guān)系考察

三種成分的線性回歸方程分別為：

漢黃芩苷Y=52 800X+12 281；r=0.999 9

黃芩素Y=142 239X-1 401.8；r=0.999 9

漢黃芩素Y=89 113X+22 473；r=0.999 9

表明其在1～50 mg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2 精密度試驗

三種成分峰面積的RSD分別為0.6%、1.3%和0.6%，表明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗

三種成分峰面積的RSD分別為1.9%、0.9%和0.8%，表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.4 重復(fù)性試驗

三種成分的含量分別為漢黃芩苷0.132 g/L(RSD為1.0%)、黃芩素0.264 g/L(RSD為0.9%)和漢黃芩素0.140 g/L(RSD為0.9%)，說明方法具有良好的重復(fù)性。

2.5 回收率試驗

漢黃芩苷的平均回收率為98.5%,平均RSD為0.87%;黃芩素的平均回收率為98.7%,平均RSD為0.63%;漢黃芩素的平均回收率為98.5%,平均RSD為0.57%。

2.6 含量測定

三種成分的含量見表1。

表 1 黃芩湯樣品中三種成分的含量(g/L)

3 討 論

采用PDA檢測器對樣品在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素在274 nm處同時具有較高的響應(yīng)，故最終確定選擇274 nm波長下進(jìn)行檢測。

黃芩湯組方藥材分別為黃芩、甘草、白芍和大棗。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩湯方中含有的化學(xué)成分具有良好的藥理作用，因此對方中有效成分的研究具有重要意義[10]。由于在黃芩湯中黃芩為君藥，因此對其化學(xué)成分的分析對于黃芩湯的相關(guān)研究具有代表性意義。本實驗選取了黃芩中三種活性成分，即漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素，建立了UFLC方法同時對黃芩湯中這三種成分進(jìn)行檢測。與已有高效液相色譜法比較，具有分離效果更佳、分析速度更快等優(yōu)點[1，7]，可為黃芩湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

本研究建立了靈敏度高、專屬性強、同時測定黃芩湯中漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素含量的UFLC方法，可為黃芩湯的深入研究提供參考。