基于體外受精-胚胎移植助孕女性患者年齡對(duì)早期胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)參數(shù)及胚胎發(fā)育潛能影響的Time-lapse 技術(shù)評(píng)估

楊冬宇, 陸 杉, 曹曉靜, 陳旭龍, 李思楠, 盧興宏, 倪運(yùn)萍, 謝 妍

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510120）

隨著年齡的增長(zhǎng)，高齡女性卵巢中卵母細(xì)胞儲(chǔ)備耗竭、卵母細(xì)胞質(zhì)量下降和非整倍體率增加，而卵母細(xì)胞質(zhì)量直接影響胚胎質(zhì)量，高齡女性的妊娠率和活產(chǎn)率下降，流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)明顯增高，提示高齡不孕癥發(fā)生率逐漸增加可能與胚胎質(zhì)量下降密切相關(guān)［1-2］?，F(xiàn)有的形態(tài)學(xué)評(píng)分系統(tǒng)并未發(fā)現(xiàn)女方年齡與受精率和胚胎質(zhì)量存在相關(guān)性［3］，近年來(lái)，基于動(dòng)力學(xué)評(píng)估胚胎的時(shí)差成像技術(shù)得到廣泛的應(yīng)用，該技術(shù)為胚胎學(xué)家提供了更多的胚胎優(yōu)選動(dòng)態(tài)參考指標(biāo)［4］?；谀遗咝纬陕省⒅渤晒β屎蛶Щ丶覌雰郝蔬壿嫽貧w模型已被用于證明胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)有利于預(yù)測(cè)胚胎的著床潛能［5-6］。然而關(guān)于女性患者年齡是否為胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)影響因素的相關(guān)報(bào)道有限。GRYSHCHENKO 等［7］研 究 表 明：女 方年 齡對(duì)胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)參數(shù)無(wú)影響，但該研究只納入了86 枚胚胎生物數(shù)據(jù)， 存在一定的局限。WARSHAVIAK 等［8］對(duì)≥42 歲 和＜35 歲 女 性 患 者胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較，未發(fā)現(xiàn)2 組患者動(dòng)力學(xué)參數(shù)存在差異，并認(rèn)為年齡可能不是胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)的影響因素，但該研究未對(duì)35～42 歲女性患者胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。金海霞等［9］對(duì)≥35 歲和＜35 歲女性患者的胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)進(jìn)行比較，與≥35 歲組女性患者比較，＜35 歲組女性患者胚胎發(fā)育至3 細(xì)胞和4 細(xì)胞的速度更快，認(rèn)為女性患者年齡對(duì)部分動(dòng)力學(xué)參數(shù)有一定的影響。女性患者年齡是否為胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)的影響因素至今仍存在爭(zhēng)議。本研究將女性患者按年齡進(jìn)行分組，分別比較＜30歲組、30歲≤患者年齡＜40歲組和≥40 歲組患者發(fā)育動(dòng)力學(xué)參數(shù)，通過(guò)比較不同年齡組胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)參數(shù)的差異，闡明患者年齡對(duì)胚胎發(fā)育潛能的影響，進(jìn)一步探討患者年齡與胚胎質(zhì)量的關(guān)系，同時(shí)為時(shí)差成像技術(shù)的更廣泛應(yīng)用提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究回顧性分析2019年10月—2020年12月于本院生殖醫(yī)學(xué)科行體外受精-胚胎移植（in vitrofertilization and embryo transfer，IVFET）助孕治療不孕女性的臨床資料。根據(jù)患者年齡分為3 組：＜30 歲組（48 例，439 枚胚胎）、30 歲≤患者年齡＜40 歲組（129 例，1019 枚胚胎）和≥40 歲組（48 例，176 枚胚胎），所有胚胎置于時(shí)差成像系統(tǒng)（Time-lapse）中培養(yǎng)至第3 天。本研究使用藥品及試劑：促性腺激素（gonadotripin，Gn）（瑞士默克雪蘭諾公司），人絨毛促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）（中國(guó)麗珠公司），受精液（IVF-plus） 和胚胎分裂液（G1-plus）（瑞典Vitrolife 公司）。儀器：時(shí)差成像系統(tǒng)（Primo Vision）（瑞典Vitrolife 公司），胚胎培養(yǎng)箱（德國(guó)Labtect 公司）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡22～45 歲；②存在雙側(cè)卵巢；③患者夫婦滿足IVF-ET 指征。排除標(biāo)準(zhǔn)：①重度子宮內(nèi)膜異位癥或子宮腺肌癥者；②雙側(cè)輸卵管積水且未經(jīng)處理者；③患有不適合目前進(jìn)行輔助生殖技術(shù)或者患有不適合妊娠的疾病者；④未獲卵或無(wú)正常受精胚胎者。

1.2 促排卵與取卵3 組患者均采用拮抗劑方案行超促排卵，當(dāng)主導(dǎo)卵泡達(dá)到以下條件之一時(shí)行扳機(jī)操作：①1 個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑≥19 mm；②2 個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm；③卵泡直徑≥14 mm 的卵泡數(shù)中有60%以上卵泡直徑≥16 mm 時(shí)，于當(dāng)晚注射HCG 4000～10000 U，36 h 左右行取卵手術(shù)。

1.3 受精、胚胎培養(yǎng)和延時(shí)攝影經(jīng)B 超下引導(dǎo)行取卵術(shù)回收卵母細(xì)胞，對(duì)取卵日丈夫留取的精液樣本進(jìn)行優(yōu)化處理，常規(guī)體外受精；受精后16～18 h后脫顆粒觀察卵母細(xì)胞受精情況，將正常受精卵轉(zhuǎn)移至微孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境：37 ℃、6.0%CO2。本研究采用Time-lapse 技術(shù)拍照頻率為每次5 min，曝光時(shí)間為每次70 ms，連續(xù)拍攝72 h，監(jiān)測(cè)胚胎的動(dòng)態(tài)發(fā)育過(guò)程，觀察并記錄3 組胚胎分裂的發(fā)育動(dòng)力學(xué)參數(shù)、異常卵裂發(fā)生率、可利用胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)和發(fā)育至2～8 細(xì)胞的比例。

1.4 胚胎移植和妊娠檢查取卵后第3 天結(jié)合胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)參數(shù)和形態(tài)學(xué)參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合患者身體條件，挑選1～2 個(gè)胚胎移植，移植后14 d 檢查是否妊娠，妊娠者繼續(xù)黃體支持治療，移植30 d 后以B 超下觀測(cè)到孕囊并有胎心搏動(dòng)為臨床妊娠。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。3 組患者女方年齡、男方年齡、體質(zhì)量 指 數(shù)（body mass index， BMI）、 竇 卵 泡 數(shù)（antral follicle count，AFC）、不孕年限、基礎(chǔ)卵泡刺激素（bsal follicle-stimulating hormone，bFSH）、基 礎(chǔ) 黃 體 生 成 素 （basal luteinizing hormone，bLH）、基礎(chǔ)雌性激素（basal estrogen，bE2）、抗穆勒氏管激素（anti-Mullerian hormone，AMH），治療參數(shù)和胚胎動(dòng)力學(xué)參數(shù)符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；2 組患者2 原核（2 pronuclears，2PN）受精率，卵裂率，胚胎著床率，臨床妊娠率，逆分裂率，1 裂3 率和2 裂5 率，碎片化率，發(fā)育至2 細(xì)胞、3 細(xì)胞、4 細(xì)胞、5 細(xì)胞、6 細(xì)胞、7 細(xì)胞和8 細(xì)胞比例以百分率（%）表示，組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組患者基礎(chǔ)資料對(duì)3 組患者基本資料進(jìn)行組間比較，≥40 歲組患者女方年齡、男方年齡、BMI、不孕年限高于＜30 歲組和30 歲≤患者年齡＜40 歲組（P＜0.05），≥40 歲組AFC 少于＜30 歲組和30 歲≤患者年齡＜40 歲組（P＜0.05），≥40 歲組AMH 低于＜30 歲組和30 歲≤患者年齡＜40 歲組（P＜0.05）。3 組患者bFSH、bLH 和bE2 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3 組患者基本臨床資料Tab.1 Clinical materials of patients in three groups (-±s）

表1 3 組患者基本臨床資料Tab.1 Clinical materials of patients in three groups (-±s）

“—”：No data；*P＜0.05 compared with ＜30 years old group；△P＜0.05 compared with 30 years old ≤patients’age＜40 years old group.

Group＜30 years old 30 years old≤patients’age＜40 years old≥40 years old FP Group＜30 years old 30 years old≤patients’age＜40 years old≥40 years old FP n 4812948— —Duration of infertility（year）2.4±1.53.7±2.9*4.7±3.4*8.527＜0.001 Age of female（year）27.2±1.734.0±2.8*41.6±2.8*△370.371＜0.001 bFSH[λB/（IU·L—1）]6.6±1.78.1±8.38.4±3.41.1110.331 Age of male（year）30.0±3.336.7±5.3*42.6±4.1*△88.971＜0.001 bLH[λB/（IU·L—1）]7.2±4.26.8±5.55.5±2.61.8080.166 BMI（kg·m—2）21.4±2.422.2±3.123.4±3.4*△5.4370.005 AMH[λB/（IU·L—1）]5.2±3.83.8±3.3*1.4±1.1*△18.120＜0.001 AFC 22.6±11.217.2±11.1*7.1±4.4*△29.962＜0.001 bE2[ρB/（pmol·L—1）]161.7±77.3167.2±88.1202.4±88.12.4210.091

2.2 3 組患者治療參數(shù)和結(jié)局對(duì)3 組患者促排卵資料和治療結(jié)局進(jìn)行比較，與＜30 歲組比較，30 歲≤患者年齡＜40 歲組和≥40 歲組患者Gn 啟動(dòng)劑量和Gn 使用總劑量增加（P＜0.05）；≥40 歲組患者扳機(jī)日內(nèi)膜厚度高于＜30 歲組和30 歲≤患者年齡＜40 歲組（P＜0.05）；≥40 歲組患者獲卵數(shù)、可利用胚胎數(shù)和優(yōu)胚數(shù)少于＜30 歲組及30 歲≤患者年齡＜40 歲組（P＜0.05），3 組患者移植胚胎數(shù)、2PN 受精率、卵裂率、胚胎種植率和臨床妊娠率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 3 組患者治療參數(shù)及結(jié)局Tab.2 Parameters and outcome of treatment of patients in three groups

2.3 3 組患者胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)參數(shù)3 組患者胚胎的從受精到3 細(xì)胞時(shí)間（time from fertilization to division into 3 cells stages，t3）、從受精到4 細(xì)胞時(shí)間（time from fertilization to division into 4 cells stages，t4）、從受精到5 細(xì)胞時(shí)間（fertilization time to division into 5 cells stages，t5）、從受精到6 細(xì)胞時(shí)間（time from fertilization to division into 6 cells stages，t6）和從2 細(xì)胞分裂到3 細(xì)胞的時(shí)間（time from 2 cells to 3 cells，cc2）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中30 歲≤患者年齡＜40 歲組患者從受精到2 細(xì)胞時(shí)間（time from fertilization to division into 2 cells stages，t2）和t6 長(zhǎng) 于＜30 歲 組（P＜0.05），≥40 歲組t3 長(zhǎng)于＜30 歲組和30 歲≤患者年齡＜40 組（P＜0.05），且30 歲≤患者年齡＜40 歲組t3 長(zhǎng)于＜30 歲組（P＜0.05），≥40 歲組t4 和t5 長(zhǎng)于＜30 歲組（P＜0.05），≥40 歲組cc2 長(zhǎng)于＜30 歲組和30 歲≤患者年齡＜40 歲組（P＜0.05）， 3 組患者原核消失時(shí)間（time from fertilization to the disappearance of the two pronucleis，tPNF）、從受精到7 細(xì)胞時(shí)間（time from fertilization to division into 7 cells stages，t7）、從受精到8 細(xì)胞時(shí)間（time from fertilization to division into 8 cells stages，t8）、從3 細(xì) 胞 分 裂 至4 細(xì)胞的時(shí)間（time from 3 cells to 4 cells，s2）、從5 細(xì)胞分裂至8 細(xì)胞的時(shí)間（time from 5 cells to 8 cells，s3）和從3 細(xì)胞分裂到5 細(xì)胞的時(shí)間（time from 3 cells to 5 cells，cc3）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 3 組患者胚胎動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab. 3 Embryo kinetic parameters of patients in three groups (t/h,-±s）

表3 3 組患者胚胎動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab. 3 Embryo kinetic parameters of patients in three groups (t/h,-±s）

“—”：No data；* P＜0.05 compared with ＜30 years old group；△P＜0.05 compared with 30 years old≤patients’age＜40 years old group.

Group＜30 years old 30 years old≤patients’age＜40 years old≥40 years old FP Group＜30 years old 30 years old≤patients’age＜40 years old≥40 years old FP No.of embryos 4391019176— —No.of embryos 4391019176— —tPNF 25.3±3.425.8±3.925.6±4.02.6580.070 t756.3±5.657.1±5.757.7±5.02.8030.061 t228.0±3.928.6±4.4*28.8±4.73.3840.034 t857.8±5.358.3±5.559.8±5.13.010.050 t337.7±5.138.9±5.9*40.0±6.8*△10.353＜0.001 s2(t4-t3)2.8±4.52.6±4.52.4±3.90.6540.520 t440.4±5.541.3±6.342.2±6.2*5.0760.006 s3(t8-t5)8.5±6.37.5±6.48.8±6.61.9960.137 t551.3±7.052.3±7.653.5±7.4*1.1370.016 cc2(t3-t2)9.8±4.110.4±4.211.7±4.9*△10.137＜0.001 t654.4±6.055.4±6.5*55.7±6.83.080.046 cc3(t5-t3)14.0±5.714.2±5.614.9±6.51.0960.334

2.4 3 組患者胚胎異常卵裂事件發(fā)生率3 組患者碎片化率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中30 歲≤患者年齡＜40 歲組和≥40 歲組高于＜30 歲組（P＜0.05），3 組患者2 裂5 率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），≥40 歲組2 裂5 率高于＜30 歲組和30 歲≤患者年齡＜40 歲組（P＜0.05），3 組患者胚胎逆分裂率和1 裂3 率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但≥40 歲組較＜30 歲組和30 歲≤患者年齡＜40 歲組相比有升高的趨勢(shì)。見表4。

表4 3 組患者異常卵裂事件發(fā)生情況Tab.4 Proportion of abnormal cleavage events in three groups ［η/%（n/N）］

2.5 3 組患者胚胎分裂比例對(duì)3 組胚胎分裂比例進(jìn)行比較，成功分裂至2 細(xì)胞、3 細(xì)胞和4 細(xì)胞的比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），3 組患者胚胎分裂至5 細(xì)胞、6 細(xì)胞、7 細(xì)胞和8 細(xì)胞比例比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與＜30歲組和30歲≤患者年齡＜40 歲組比較，≥40 歲組胚胎分裂至5 細(xì)胞、6 細(xì)胞和7 細(xì)胞的比例降低（P＜0.05）；≥40 歲組胚胎分裂至8 細(xì)胞的比例低于＜30 歲組（P＜0.05）。見表5。

表5 3 組患者胚胎在特定發(fā)育階段的百分比Tab.5 Percentages of embryos existing at specific developmental stages of patients in three groups ［η/%(n/N)］

3 討論

一些研究利用靜態(tài)評(píng)估探討女性年齡和胚胎形態(tài)間的關(guān)系，結(jié)果表明：常規(guī)使用的形態(tài)評(píng)分系統(tǒng)，如卵裂球數(shù)目和卵裂球形態(tài)評(píng)分等與年齡無(wú)相關(guān)性［3，10-12］，因此本研究擬通過(guò)對(duì)胚胎動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析來(lái)探討年齡對(duì)胚胎發(fā)育的影響。

Time-lapse 技術(shù)在輔助生殖領(lǐng)域大量應(yīng)用，為研究者挖掘胚胎發(fā)育潛能信息提供了新的途徑，Time-lapse 技術(shù)的主要特點(diǎn)是對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程進(jìn)行高質(zhì)量連續(xù)的圖像采集，較傳統(tǒng)倒置顯微鏡下觀察更安全，可將外界環(huán)境的干擾降至最低。Timelapse 技術(shù)采集圖片時(shí)間頻率為5～10 min，對(duì)胚胎動(dòng)態(tài)學(xué)觀察和異常分裂事件的記錄同步進(jìn)行，充分記錄胚胎發(fā)育過(guò)程中的全部動(dòng)態(tài)信息［13-15］。近年來(lái)關(guān)于胚胎動(dòng)力學(xué)信息與胚胎發(fā)育潛能的研究已成為輔助生殖專家們感興趣的熱點(diǎn)論題，研究者對(duì)胚胎動(dòng)力學(xué)的影響因素進(jìn)行了一系列的探索，COBO 等［16］對(duì)玻璃化冷凍后的卵母細(xì)胞在形成胚胎后的胚胎動(dòng)力學(xué)信息進(jìn)行觀察，新鮮卵母細(xì)胞和玻璃化冷凍卵母細(xì)胞來(lái)源胚胎的著床率相似，但在t2 到囊胚發(fā)育動(dòng)力學(xué)方面有明顯差異。

本研究共納入225 例患者的1634 枚胚胎，將患者按年齡分為3 組，結(jié)果顯示：與＜30 組和30 歲≤患者年齡＜40 歲組比較，≥40 歲組t3、t4 和t5 增 加，≥40 歲 組cc2 也 增 加，3 組 患 者tPNF、t2、t6、t7、t8、s2、s3 和cc3 比 較 差 異 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AKARSU 等［17］研究表明：在卵巢儲(chǔ)備正常的情況下，年輕組（20～30 歲） 從授精到tPNF 和t2、t3 及t4 明顯短于高齡組（30～40 歲），與本研究結(jié)果一致。紀(jì)冰等［18］比較著床胚胎與未著床胚胎的發(fā)育時(shí)間參數(shù)，結(jié)果表明：tPNF、t2、cc2 和s2 對(duì)胚胎發(fā)育潛能具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，著床胚胎的發(fā)育速度相對(duì)更快，發(fā)育時(shí)間更集中，即在一定時(shí)間范圍內(nèi)發(fā)育快的胚胎其發(fā)育潛能更高，在范圍之外發(fā)育較快或較慢可能會(huì)對(duì)胚胎質(zhì)量產(chǎn)生不良影響。以上研究結(jié)果表明：年輕患者的胚胎及發(fā)育潛能好的胚胎均具有早期卵裂速度較快的趨勢(shì)，本研究的結(jié)果也表明：＜30 歲組患者到達(dá)2～6 細(xì)胞階段用時(shí)更短，患者年齡在一定程度上可能影響胚胎的發(fā)育速度。

胚胎發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)逆分裂和不均等分裂的異常分裂現(xiàn)象時(shí)可導(dǎo)致其著床潛能的降低［19-20］。隨年齡的增長(zhǎng)，高齡女性的卵母細(xì)胞和胚胎出現(xiàn)染色體異常概率也相應(yīng)增加。誘發(fā)胚胎卵裂模式異常的主要原因可能是胚胎出現(xiàn)非整倍體或基因異?，F(xiàn)象［21］。本研究結(jié)果顯示：與＜30 歲組和30 歲≤患者年齡＜40 歲組比較，≥40 歲組患者更易出現(xiàn)2 裂5 異常分裂現(xiàn)象，同時(shí)胚胎碎片化程度也明顯升高，雖然3 組患者逆分裂、1 裂3 的異常分裂模式差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但≥40 歲組有升高趨勢(shì)，推測(cè)高齡女性卵母細(xì)胞及其產(chǎn)生的胚胎的高染色體異常率促進(jìn)了異常卵裂模式的發(fā)生。

本研究對(duì)3 組胚胎第3 天發(fā)育至不同細(xì)胞階段的比例進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示：≥40 歲組僅有33.5% 的胚胎可以發(fā)育至8 細(xì)胞，與＜30 歲組（45.3%） 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，3 組胚胎能夠成功發(fā)育至5、6 和7 細(xì)胞比例也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，≥40 歲組較＜30 歲組和30 歲≤患者年齡＜40 歲組更容易出現(xiàn)發(fā)育阻滯，提示年齡的增長(zhǎng)可能是制約胚胎發(fā)育潛能的一個(gè)主要因素。

隨著年齡的增長(zhǎng)，臨床妊娠率和胚胎著床率均會(huì)明顯下降這一事實(shí)已被研究［1，12］所證實(shí)，但本研究結(jié)果中3 組患者的臨床妊娠率和胚胎著床率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，主要是因?yàn)樽罱K移植周期數(shù)相對(duì)較少所致，因納入的病例采用拮抗劑促排卵方案，早發(fā)黃體生成素（luteinizing hormone，LH）峰的出現(xiàn)影響子宮內(nèi)膜的形態(tài)，移植日取消移植的周期數(shù)占比較高。

綜上所述，隨著年齡的增長(zhǎng)，胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)受到一定的影響，胚胎也更容易出現(xiàn)發(fā)育阻滯的現(xiàn)象。希望本研究能夠?yàn)檠a(bǔ)充胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)的一些臨床意義提供理論支持。本研究為單中心回顧性分析，需加大樣本量對(duì)某些具有一定差異趨勢(shì)但未表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的參數(shù)進(jìn)行探討，進(jìn)一步證實(shí)其在胚胎發(fā)育過(guò)程中的潛在意義。