針刺干預(yù)對(duì)單眼視覺剝奪模型大鼠視皮層方位柱“漂移”和異常重組的調(diào)節(jié)作用及其腦功能機(jī)制

葉鈺娟, 張娟娟, 馬重兵, 嚴(yán)興科

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

弱視是指在視覺發(fā)育期內(nèi)因各種病因引起的單眼或雙眼最佳矯正視力低于相應(yīng)年齡的視力，眼部檢查常無器質(zhì)性病變或弱視眼視力低于健側(cè)眼視力2 行及以上，視力較低眼稱為弱視［1］。全球弱視患病率約為4%［2］；中國(guó)兒童弱視的患病率為1%～2%，以人群為基礎(chǔ)的研究［3］顯示弱視的患病率為1%～5%。弱視常分為斜視性、屈光參差性、先天性、形覺剝奪性和屈光不正性等，其中單眼形覺剝奪性弱視較雙眼弱視后果更為嚴(yán)重，因其疾病轉(zhuǎn)歸預(yù)后不佳，嚴(yán)重影響患者身心健康發(fā)育［1］。近年來，越來越多的研究［4-5］從腦功能成像角度探索弱視引起的大腦皮層結(jié)構(gòu)及腦功能損傷，主要以功能磁共振成像（尤其是靜息態(tài)功能磁共振成像）技術(shù)為主，然而上述技術(shù)主要偏重于相關(guān)腦區(qū)或腦區(qū)之間功能（網(wǎng)絡(luò)）連接為主，對(duì)大腦皮層功能改變的研究較少。針灸療法在弱視治療中具有操作簡(jiǎn)單、療程短、不良反應(yīng)較少和明顯改善視力及視功能等優(yōu)點(diǎn)，目前在眼科臨床中應(yīng)用日益增多［6-7］。本研究采用功能近紅外光譜技術(shù)（functionality near infrared spectroscopy，fNIRs），基于神經(jīng)血管耦合機(jī)制，從血氧響應(yīng)角度觀察單眼剝奪大鼠不同方位刺 激 下 視 皮 層 方 位 柱 氧 合 血 紅 蛋 白（oxyhemoglobin， Oxy-Hb）、 脫 氧 血 紅 蛋 白（deoxygenated hemoglobin，Deoxy-Hb） 和 總 血 紅蛋白（total hemoglobin，Total-Hb） 濃度的變化，檢測(cè)評(píng)估視皮層方位柱對(duì)單眼剝奪損害的響應(yīng)模式，探討針刺干預(yù)對(duì)視皮層方位柱異常功能改變的調(diào)節(jié)作用，為針灸干預(yù)形覺剝奪效應(yīng)的腦功能機(jī)制和應(yīng)用研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器70 只SPF 級(jí)健康14 d 齡SD 大鼠，體質(zhì)量（30±5）g，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供，質(zhì)量合格證編號(hào)：62000600000513，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（甘）2015-0001。水合氯醛（天津市大茂化學(xué)試劑廠），左 旋 多 巴 甲 酯 （levodopa methyl ester hydrochloride，LDME）（上海阿拉丁生化科技公司）。羅蘭傳統(tǒng)多焦視覺電生理診斷儀（德國(guó)ROLAND CONSULT Stasche & Finger GmbH 公司），fNIRs 采集與分析系統(tǒng)（美國(guó)NIRX 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備和分組70 只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組10 只和造模組60 只?？瞻讓?duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)，造模組60 只大鼠模型復(fù)制3 d 后，選擇右眼閉合良好、不漏光大鼠50 只，隨機(jī)分為模型組，LDME 組，早期、中期和末期針刺組，每組10 只。本實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合2006年科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。依據(jù)文獻(xiàn)［8］方法復(fù)制右眼剝奪大鼠模型：大鼠按0.3 mL·100 g－1體質(zhì)量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，剪除眼瞼緣周圍毛發(fā)，嚴(yán)格消毒大鼠右眼眼瞼后，自內(nèi)眥到外眥剪除上下瞼緣各1.0～1.5 mm，皮下及皮膚分層縫合，封閉實(shí)驗(yàn)眼。以大鼠出現(xiàn)圖形視覺誘發(fā)電位（pattern visual evoked potential，P-VEP）潛伏期延長(zhǎng)和振幅降低為模型復(fù)制成功的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 干預(yù)方法LDME 組按照體質(zhì)量給予LDME 40 mg·kg－1灌胃，從模型復(fù)制后第3 天開始，連續(xù)治療30 d。穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［9］及《大鼠斷層解剖彩色圖譜》［10］進(jìn)行定位。睛明：眼內(nèi)角、上下眼瞼間；攢竹：當(dāng)眉頭凹陷中，眶上切跡處；風(fēng)池：項(xiàng)部，當(dāng)兩耳后角連線中點(diǎn)與耳后角外1/3 和內(nèi)2/3 處；光明：在小腿外側(cè)下1/3，趾長(zhǎng)伸肌和腓骨短肌之間。

早期針刺組大鼠在模型復(fù)制后第3 天開始針刺治療，中期針刺組大鼠在模型復(fù)制后第12 天開始針刺治療，末期針刺組大鼠在模型復(fù)制后第21 天開始針刺治療［11］。取雙側(cè)睛明、攢竹和風(fēng)池斜刺5 mm，雙側(cè)光明直刺3 mm。以Φ=0.25 mm、長(zhǎng)度為15 mm 的毫針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）進(jìn)行治療，進(jìn)針后行捻轉(zhuǎn)平補(bǔ)平瀉法。每日1 次，每次留針10 min，每組治療期均為9 d。

1.4 各組大鼠P-VEP 檢測(cè)P-VEP P100波潛伏期和振幅檢測(cè)：數(shù)據(jù)采集前進(jìn)行麻醉處理，大鼠按體質(zhì)量給予4%水合氯醛0.3 mL·100 g－1腹腔注射麻醉。檢測(cè)時(shí)將大鼠固定，調(diào)整雙眼視軸，使其角膜映光點(diǎn)與視屏中心標(biāo)記點(diǎn)平行。檢測(cè)電極內(nèi)置電極膏，連接13 mm 毫針，參考電極于大鼠內(nèi)眼角連線中點(diǎn)刺入，記錄電極于大鼠枕骨粗隆上0.5 cm刺入，地電極于大鼠面頰部刺入，刺激時(shí)大鼠受試眼角膜與視刺激視屏垂直距離為50 cm。模式反轉(zhuǎn)刺激器設(shè)置：刺激頻率4.00，圖形大小10×10，滿視野；模式圖案：棋盤格。放大器設(shè)置：上限頻率500 Hz；下限頻率1 Hz；記錄電極為OZ；參考電極為Fpz；采樣時(shí)程300 ms。記錄電極與參考電極間阻抗≤2 kΩ。

1.5 各組大鼠視皮層中Oxy-Hb、Deoxy-Hb 和Total-Hb 濃度檢測(cè)每只大鼠在不同方位刺激狀態(tài)下采集180 s，應(yīng)用美國(guó)NIRStar13-0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。fNIRs 主要檢測(cè)指標(biāo)包含Oxy-Hb、Deoxy-Hb 和Total-Hb 濃度，采用Oxy-Hb、Deoxy-Hb 和Total-Hb 濃度絕對(duì)值在大鼠模型中構(gòu)建相應(yīng)大腦皮層血流示意圖。大鼠視沖動(dòng)傳導(dǎo)終止于視皮層區(qū)（17 區(qū)）。以320 g 大鼠為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算各大鼠的視皮層17 區(qū)范圍（中線旁開1.80～3.23 mm，距前囟4.31～5.75 mm）。參考《大鼠腦立體定位圖譜》［12］和分析軟件matlab 平面圖對(duì)照，確定相關(guān)腦區(qū)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠P-VEP P100波潛伏期和振幅以±s表示，各組大鼠左和右側(cè)眼比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)或LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。fNIRs 采用R 軟件（i3863.6.1）調(diào)用數(shù)據(jù)包完成主成分分析和偏最小二乘法聚類分析法。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠視覺電生理P-VEP P100波潛伏期和振幅與空白對(duì)照組左眼比較，空白對(duì)照組大鼠右眼和其余各組大鼠左眼P100波潛伏期及振幅差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與空白對(duì)照組右眼比較，模型組大鼠右眼P100波潛伏期明顯延長(zhǎng)（P＜0.05），振幅明顯降低（P＜0.05）；與模型組右眼比較，LDME 組和早期針刺組大鼠右眼潛伏期均有不同程度縮短（P＜0.05），LDME 組和早期、中期及晚期針刺組大鼠振幅均有不同程度升高（P＜0.05）；與LDME 組右眼比較，中期和末期針刺組大鼠右眼P100波潛伏期明顯延長(zhǎng)（P＜0.05），振幅明顯降低（P＜0.05）；與早期針刺組比較，中期和末期針刺組大鼠右眼P100波潛伏期明顯延長(zhǎng)（P＜0.05）， 振 幅 明 顯 降 低（P＜0.05）。見 表1 和2。

表1 各組大鼠P100波潛伏期Tab.1 P100 wave latencies of rats in various groups(n=10，x±s，t/ms）

表2 各組大鼠P100波振幅Tab.2 P100 wave amplitudes of rats in various groups(n=10，x±s，μV）

2.2 各組大鼠不同方位刺激下左和右側(cè)視皮層中Oxy-Hb、Deoxy-Hb 及Total-Hb 濃度經(jīng)主成分分析和偏最小二乘法聚類分析法分析，不同方位刺激狀態(tài)下，各組大鼠右側(cè)視皮層中Total-Hb 濃度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與空白對(duì)照組左側(cè)視皮層比較，模型組大鼠視皮層中Oxy-Hb 和Total-Hb 濃度明顯降低（P＜0.05），Deoxy-Hb 濃度明顯升高（P＜0.05），各針刺組Oxy-Hb 和Total-Hb 濃度明顯升高（P＜0.05），Deoxy-Hb 濃度明顯降低（P＜0.05）；各組大鼠右側(cè)視皮層中Oxy-Hb 和Deoxy-Hb 濃度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）， LDME 組 左 側(cè) 視 皮 層Oxy-Hb 和Deoxy-Hb 濃度優(yōu)于早期針刺組（P＜0.05），早期針刺組大鼠視皮層中Oxy-Hb 和Deoxy-Hb 濃度優(yōu)于中和末期針刺組（P＜0.05），中期與末期組左側(cè)視皮層上述3 種濃度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1和2。

圖1 各組大鼠2-5 通道不同方位刺激下右側(cè)視皮層中Oxy-Hb、Deoxy-Hb 和Total-Hb 濃度Fig. 1 Concentrations of Oxy-Hb, Deoxy-Hb, and Total-Hb in right visual cortex of rats in various groups under 2-5 channel stimulation in different directions

2.3 各組大鼠不同方位刺激狀態(tài)下Oxy-Hb 濃度血流圖各組大鼠左右側(cè)Oxy-Hb 濃度比較，空白對(duì)照組大鼠左右側(cè)Oxy-Hb 濃度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組和LDME 組大鼠右側(cè)Oxy-Hb 濃度均高于左側(cè)（P＜0.05）；早期針刺組大鼠左右側(cè)Oxy-Hb 濃度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；中期和末期針刺組大鼠右側(cè)Oxy-Hb濃度高于左側(cè)（P＜0.05），表明早期針刺能有效調(diào)節(jié)大鼠視覺剝奪后視皮層方位柱“漂移”和重組現(xiàn)象。見圖3。

圖3 各組大鼠不同方位刺激下大腦皮層血流示意圖Fig.3 Schematic diagram of cerebral cortical blood flow of rats in various groups under stimulation in different directions

選取各組大鼠不同方位刺激狀態(tài)下第160 秒時(shí)，以O(shè)xy-Hb 為標(biāo)準(zhǔn)，從頂?shù)降状竽X皮層血流平面示意圖。每幅圖的第1 列和第2 列分別代表該組的右側(cè)和左側(cè)視皮層血氧濃度，大腦皮層血氧濃度的變化以底部圖尺的特定顏色判定：越趨近深紅色，Oxy-Hb 濃度越高，表明該處大腦皮層活動(dòng)相對(duì)活躍；越趨近深藍(lán)色，Oxy-Hb 濃度越低，表明該處大腦皮層活動(dòng)受到一定程度的抑制。

3 討論

HUBEL 等［13］和WIESEL 等［14］系統(tǒng)地研究了視皮層細(xì)胞的功能組織，發(fā)現(xiàn)具有相同最優(yōu)方位的皮層細(xì)胞以一種非常規(guī)則的方式，在從皮層表面到下邊的白質(zhì)之間2 mm 的灰質(zhì)內(nèi)排列成柱狀，稱作方位功能柱。根據(jù)不同亞層的區(qū)別，方位柱內(nèi)也有不同的來源，而不同位置的方位也將有不同的用處。初級(jí)視皮層上許多細(xì)胞對(duì)處于一個(gè)特殊方位的亮的邊界和線段有最優(yōu)的刺激，這種優(yōu)勢(shì)方位在皮層的深度方向上，也就是與皮層表面垂直的方向上，仍然大致相同，但在沿皮層表面的方向上方位大部分平緩地變化。利用光學(xué)成像方法能夠形象地觀察到不同優(yōu)勢(shì)方位的分布情況，這種由垂直于皮層表面排列的，連成薄片狀的薄層方位細(xì)胞做成的薄板結(jié)構(gòu)，稱為方位柱［15-16］。

弱視不僅能導(dǎo)致視力低下，還常常伴有包括立體觀、對(duì)比敏感度、形狀知覺、輪廓整合和運(yùn)動(dòng)處理等其他視功能障礙。弱視視覺系統(tǒng)有著明顯的空間不確定性，當(dāng)刺激特征靠得很近時(shí)，弱視患者不能準(zhǔn)確地判斷相對(duì)位置、寬度和朝向，而正常人卻能良好完成，而對(duì)于屈光參差性弱視來說，空間信息的丟失與其下降的分辨率和對(duì)比敏感度是相當(dāng)?shù)模?7］。右眼視覺剝奪后，左側(cè)視皮質(zhì)神經(jīng)元代謝活動(dòng)減弱，對(duì)視覺輸入方位信息的加工和感受功能出現(xiàn)抑制和損害，右側(cè)視皮質(zhì)方位柱功能明顯增強(qiáng)［18］，相對(duì)出現(xiàn)視皮層功能柱從左側(cè)向右側(cè)“漂移”的現(xiàn)象，即為視功能柱功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生可塑性重組改變。

fNIRs 技術(shù)通過檢測(cè)血紅蛋白濃度，可以實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)地反映測(cè)量點(diǎn)局部血氧代謝和腦區(qū)神經(jīng)元活動(dòng)，為大腦皮層功能活動(dòng)與腦組織解剖位置對(duì)應(yīng)關(guān)系的建立和評(píng)估提供技術(shù)支持［19］。用于檢測(cè)單眼剝奪導(dǎo)致視皮層功能柱“漂移”，對(duì)弱視的早期診斷、臨床療效判定和發(fā)病機(jī)制研究具有重要意義［20］。P-VEP 中P100波具有穩(wěn)定性和重復(fù)性較好的優(yōu)勢(shì)，可以反應(yīng)視覺通路、視覺傳導(dǎo)能力及視皮質(zhì)的功能，成為臨床檢測(cè)和評(píng)價(jià)視功能的主要指標(biāo)［21］。

本課題組經(jīng)過長(zhǎng)期臨床總結(jié)，并在針刺治療弱視安全有效的基礎(chǔ)上，提出“調(diào)氣通經(jīng)明目”針法［22-23］，選取睛明、攢竹、風(fēng)池和光明四穴為主穴，睛明和攢竹穴為近部取穴，能疏通眼周之經(jīng)脈，濡養(yǎng)局部之氣血，風(fēng)池和光明穴為遠(yuǎn)部取穴，聯(lián)絡(luò)肝經(jīng)，疏通肝膽氣血、疏通陽(yáng)維脈氣血，使經(jīng)脈暢通，氣血上達(dá)于目而能視。四穴相配，遠(yuǎn)近結(jié)合，達(dá)到“調(diào)理氣機(jī)、疏經(jīng)通絡(luò)、明目增視”的目的。同時(shí)，研究［24-27］表明：風(fēng)池穴可以調(diào)節(jié)視覺中樞及鄰近腦區(qū)功能活動(dòng)，調(diào)制默認(rèn)網(wǎng)絡(luò)腦功能連接，而針刺光明穴產(chǎn)生的神經(jīng)沖動(dòng)由軀體感覺纖維傳入中樞，能夠影響大腦相應(yīng)腦區(qū)的活動(dòng)程度及血氧水平，其中視皮層區(qū)域反應(yīng)更加明顯。LDME是目前臨床治療弱視的常用藥物，具有一定權(quán)威性［28］。研究［29］表明：弱視眼視皮層中樞對(duì)圖形運(yùn)動(dòng)感覺及邊界對(duì)比效應(yīng)敏感的神經(jīng)元功能存在異常，因此所有類型的弱視均有P-VEP 潛伏期延長(zhǎng)和振幅降低的表現(xiàn)。本研究造模成功后，在敏感期內(nèi)針刺治療后，P100波振幅升高，潛伏期提前，針刺可有效增強(qiáng)視覺通路生物電活動(dòng)，從而拮抗弱視對(duì)視覺系統(tǒng)的損害，且早期針刺更有效；同時(shí)fNIRs 指標(biāo)中Oxy-Hb、Deoxy-Hb 和Total-Hb 濃度檢測(cè)結(jié)果顯示：右眼視覺剝奪后，左側(cè)視皮質(zhì)神經(jīng)元方位信息感知的敏感性和選擇性明顯抑制，右側(cè)視皮質(zhì)以上功能相對(duì)增強(qiáng)，LDME 和早期針刺均能不同程度地改善和保護(hù)視皮層方位柱功能的損害，也證實(shí)“調(diào)氣通經(jīng)明目”針法能有效逆轉(zhuǎn)視覺剝奪后視覺加工和感受功能損害，抑制“眼優(yōu)勢(shì)”現(xiàn)象，并能夠有效調(diào)節(jié)和恢復(fù)視覺剝奪導(dǎo)致的雙側(cè)視皮層功能柱發(fā)育不平衡，對(duì)視功能柱可塑性“漂移”改變有明顯的干預(yù)和調(diào)節(jié)作用，而且早期治療是取得療效的關(guān)鍵。

圖2 各組大鼠4-4 通道不同方位刺激下左側(cè)視皮層中Oxy-Hb、Deoxy-Hb 和Total-Hb 濃度Fig. 2 Concentrations of Oxy-Hb,Deoxy-Hb and Total-Hb in left visual cortex of rats in various groups under 4-4 channel stimulation in different directions

綜上所述，本研究從單眼剝奪大鼠視覺電生理通路和視皮層方位柱功能改變角度探討了單眼剝奪后視覺皮層功能改變，但未研究具體方位柱形態(tài)學(xué)改變，有待進(jìn)一步研究與分析。