基于實驗室指標(biāo)的新型冠狀病毒肺炎和甲型流感鑒別診斷模型的建立及其臨床意義

邢東洋, 田肅巖, 陳玉坤, 王金梅, 孫雪娟, 李善姬, 許建成

（1. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院檢驗科，吉林 長春 130021；2. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院臨床研究部，吉林 長春 130021；3. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院感染科，吉林 長春 130021；4. 吉林省四平市傳染病醫(yī)院檢驗科，吉林 四平 136000；5. 吉林省長春市傳染病醫(yī)院檢驗科，吉林 長春 130123；6. 吉林省吉林市傳染病醫(yī)院檢驗科，吉林 吉林 132000）

新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）自2019年爆發(fā)以來在全球迅速蔓延，引起世界范圍性的關(guān)注。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO） 宣布新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）的流行已成為國際公共衛(wèi)生緊急事件。該病早期典型的臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、呼吸道癥狀和肌肉疼痛，嚴重者出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征甚至急性呼吸衰竭［1］。冬季是病毒感染性疾病高發(fā)期。甲型流感作為常見季節(jié)性流感，也多在冬季高發(fā)［2］，其傳播方式主要有3 種：接觸傳播、飛沫傳播和空氣傳播， 可引起大范圍人與人之間的傳播［3］。甲型流感患者早期臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱、頭痛、肌肉疼痛和呼吸困難［4］， 這與COVID-19 早期發(fā)病臨床表現(xiàn)相似。研究［5-6］顯示：甲型流感病毒中H1N1 和H5N1 患者的實驗室檢測結(jié)果中白細胞 （white blood cell， WBC）、 淋 巴 細 胞（lymphocyte，LY） 和血小板（platelet，PLT） 數(shù)量減少，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT） 活性升高，而COVID-19 患者也同樣出現(xiàn)WBC、LY 和PLT 數(shù)量減少，門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和ALT 活性升高的現(xiàn)象［7-8］，上述研究提示2 種疾病重要的實驗室檢測指標(biāo)呈現(xiàn)相似變化［6］。同時，兩者臨床表現(xiàn)、傳播途徑和好發(fā)季節(jié)都相似，這提示有必要通過實驗室指標(biāo)來區(qū)分感染SARS-CoV-2 和甲型流感病毒的患者。目前，已經(jīng)有研究［6］通過影像學(xué)檢查結(jié)果或臨床癥狀建立COVID-19 與甲型流感的鑒別診斷模型。本研究通過彈性網(wǎng)絡(luò)模型篩選高度特異性指標(biāo)建立COVID-19 和甲型流感患者實驗室指標(biāo)的鑒別診斷模型，為2 種疾病的鑒別診斷提供更多線索。

1 資料與方法

1.1 患者基本信息和數(shù)據(jù)來源本研究最初納入來自吉林省3 家三級甲等醫(yī)院的COVID-19 患者61 例，剔除重型患者5例，最終納入56例COVID-19普通型患者作為研究對象。56 例COVID-19 普通型患者分別來自2020年1－3月吉林大學(xué)第一醫(yī)院（n=3）、吉林省長春市傳染病醫(yī)院（n=39）和吉林省四平市傳染病醫(yī)院（n=14）；選擇2019年12月－2020年3月吉林大學(xué)第一醫(yī)院54 例甲型流感患者作為對照；用于模型驗證的24 例COVID-19普通型患者來自2020年1－5月吉林省吉林市傳染病醫(yī)院，30 例甲型流感患者來自2018年12月－2019年4月吉林大學(xué)第一醫(yī)院。實驗室檢測結(jié)果、臨床資料和人口統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)均檢索于電子病歷系統(tǒng)，研究數(shù)據(jù)均由經(jīng)驗豐富的專業(yè)醫(yī)務(wù)人員從醫(yī)院數(shù)據(jù)庫中提取，最終由2 名研究人員獨立檢查數(shù)據(jù)。檢測標(biāo)本符合每個醫(yī)院的實驗室采集標(biāo)準(zhǔn)，一般采集方式為鼻拭子、咽拭子和靜脈血液樣本。COVID-19 與甲型流感患者樣本排除標(biāo)準(zhǔn)：①具有其他細菌或常見病毒的感染；②具有心腦血管、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)等器質(zhì)性疾病及血液相關(guān)疾病病史；③孕婦及哺乳期婦女。

1.2 實驗室檢測COVID-19 患者的實驗室確診是由吉林省長春市疾病預(yù)防控制中心、吉林省四平市疾病預(yù)防控制中心和吉林省吉林市疾病預(yù)防控制中心完成，疑似SRAS-CoV-2 陽性的標(biāo)本被運送至吉林省疾病預(yù)防控制中心重新確認。甲型流感患者的實驗室確診由長春市疾病預(yù)防控制中心完成。SRAS-CoV-2 檢測采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）（新型冠狀病毒2019-nCoV 核酸檢測試劑盒，MA-6000 型實時熒光定量PCR 儀，上海伯杰醫(yī)療科技有限公司；新型冠狀病毒2019-nCoV 核酸檢測試劑盒，全自動核酸提取儀GenAct NL-48，上海捷諾生物科技有限公司）。甲型流感病毒檢測也應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)（RespiFinder 2SMART 核酸檢測試劑盒，全自動核酸提取儀GenAct NL-4，上海捷諾生物科技有限公司）。COVID-19 和甲型流感患者血液樣本在4 家三級甲等醫(yī)院進行血液學(xué)和生化項目檢測。各醫(yī)院檢測設(shè)備及相關(guān)信息見表1。4 家醫(yī)院各檢驗項目的檢測方法、參考值范圍、儀器精密度和質(zhì)量控制產(chǎn)品相同。同時參加并通過了吉林省臨床檢驗中心的外部質(zhì)量評價。本研究中的所有醫(yī)生、技術(shù)人員和護士均接受吉林省衛(wèi)生健康委員會的統(tǒng)一培訓(xùn)。各個實驗室參照中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會于制定的中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，包括臨床常用生化項目：AST、ALT、γ 谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（glutamyltranspeptidase，GGT）、膽堿酯酶（cholinesterase，CHE）、總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、球蛋白（globulin，GLB），白蛋白/球蛋白（A/G）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、間接膽紅素（direct bilirubin，DBIL）、直接膽紅素（indirect bilirubin，IBIL）、尿素氮（blood urea nitrogen，Urea）、肌酐（creatinine，Cr）、二氧化碳結(jié)合力（carbondioxide combining power， CO2-CP）、 葡 萄 糖（glucose，Glu）、鉀（potassium，K）、鈉（sodium，Na） 和氯（chloride，Cl）；血液學(xué)項目：WBC、中性粒細胞（neutrophils， NE）、 LY、 嗜 酸 性 粒 細 胞（eosinophils， EO）、 嗜 堿 性 粒 細 胞（basophil，BA）、單核細胞（monocyte，MO）、紅細胞（red blood cell，RBC）、血紅蛋白（hemoglobin，HGB）、紅細胞比容（hematocrit，HCT）、平均紅細胞體積（mean corpuscular volume，MCV）、平均紅細胞血紅蛋白量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）、平均紅細胞血紅蛋白濃度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）、紅細胞分布寬度 （red blood cell distribution width， RDW）、PLT、平均血小板體積（mean platelet volume，MPV）、 血小板分布寬度（platelet distribution width，PDW）和血小板比容（platelet hematocrit，PCT）。

表1 4 家定點三甲級醫(yī)院設(shè)備信息Tab.1 Equipment informations of four designated tertiary hospitals

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 26.0 和R 語言3.6.1軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。為識別并區(qū)分COVID-19 和甲型流感中有診斷價值的指標(biāo)，本研究進行如下篩選過程。首先，將COVID-19 患者住院后5d 的實驗室檢測結(jié)果取平均值（實驗室檢測結(jié)果次數(shù)為2～5 次），利用彈性網(wǎng)絡(luò)模型進行第1 輪篩選，其中調(diào)優(yōu)參數(shù)alpha 設(shè)置為0.6，并通過10 折交叉驗證選擇lambda 的最佳截斷值；采用不同隨機種子，將彈性網(wǎng)絡(luò)模型擬合200 次，計算200 個模型選取指標(biāo)的頻率，選取高頻指標(biāo)（頻率＞90%），計算每對指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)。為消除冗余指標(biāo)和避免高度相關(guān)指標(biāo)間的共線性問題，剔除生物學(xué)意義最小的指標(biāo)。第2 輪篩選采用以AIC 作為選擇標(biāo)準(zhǔn)的逐步Logistic 回歸模型，篩選出高度特異性指標(biāo)，列線圖用來表示最終的模型；使用獨立數(shù)據(jù)集作為外部驗證集，計算受試者工作特征（receiver operation characteristic， ROC） 曲 線 下 面 積（area under curve，AUC）以評估最終模型的預(yù)測性能。使用非參數(shù)方法計算COVID-19 患者基本資料第25 百分 位 數(shù)（P25） 和 第75 百 分 位 數(shù)（P75），Mann-WhitneyU檢驗比較2 種疾病實驗室指標(biāo)間差異。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組患者人口學(xué)資料和臨床特征本研究納入56 例COVID-19 患者（10～87 歲） 和54 例甲型流感患者（23～87 歲）。2 組患者人口學(xué)資料和臨床特征見表2。COVID-19 患者住院時間較長，年齡中位數(shù)低于甲型流感患者。COVID-19 患者常見的臨床癥狀為發(fā)熱、咳嗽和乏力；甲型流感患者常見的臨床癥狀為發(fā)熱、咳嗽和呼吸困難。用于模型驗證的24 例COVID-19 普通型患者和30 例甲型流感患者人口學(xué)資料和臨床特征見表3。

表2 COVID-19 和甲型流感患者基本特征Tab. 2 Baseline characteristics of patients with COVID-19 and influenza A

表3 用于模型驗證的COVID-19 和甲型流感患者基本特征Tab. 3 Basic information of COVID-19 and H1N1 patients for model validation

2.2 2 組患者入院后首次實驗室檢測結(jié)果在WBC 參數(shù)中，甲型流感患者的WBC、NE 和MO計數(shù)明顯高于COVID-19 患者（P＜0.01）。在RBC 參 數(shù) 中， COVID-19 患 者 的RBC、HGB 和HCT 均高于甲型流感患者（P＜0.01），RDW 則低于甲型流感患者（P＜0.01）。生化指標(biāo)中，除ALT、Cr 和Glu 外，2 組患者AST、GGT、CHE、TP、ALB、GLB、A/G、TBIL、DBIL、IBIL、Urea 和CO2-CP 比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。電解質(zhì)參數(shù)中，COVID-19 患者的K 和Na 離子含量高于甲型流感患者（P＜0.05），Cl 離子含量則低于甲型流感患者（P＜0.05），但兩者電解質(zhì)參數(shù)整體接近于參考值區(qū)間下限。見表4。

表4 入院初期實驗室檢查結(jié)果Tab. 4 Laboratory findings at onset to hospital admission

2.3 COVID-19 和甲型流感鑒別診斷模型的建立經(jīng)過第1 輪篩選，EO、MO、RBC、HGB、HCT、MPV、GGT、TP、ALB、GLB、A/G、TBIL、HCT、IBIL、Urea、CO2-CP、Cl－和年齡在200 個彈性網(wǎng)絡(luò)模型中為高頻指標(biāo)（圖1 所示為單次彈性網(wǎng)絡(luò)模型選擇最優(yōu)調(diào)優(yōu)參數(shù)lambda 的圖）。然后，繪制出以上各個指標(biāo)間的相關(guān)性來檢查潛在的冗余指數(shù)，見圖2。第2 輪篩選，得到A/G、TBIL 和HCT 作為最佳子集模型，公式為：Logit （pi） =－15.28+7.21×A/Gi－0.08×TBILi+17.03×HCTi。公 式 中，pi 為 患 者i 感 染COVID-19 的概率，A/G、TBIL 和HCT 對應(yīng)的P值分別為＜0.01、0.014 和0.037。諾莫圖表示最終的模型。見圖3。通過外部數(shù)據(jù)集驗證，該模型AUC 為0.844（95%CI：0.747～0.941），具有較好的預(yù)測性能。見圖4。

圖1 彈性網(wǎng)絡(luò)模型中λ 調(diào)優(yōu)參數(shù)的確定Fig. 1 Determination of optimal value for tuning parameter λ in elastic network model

圖2 彈性網(wǎng)絡(luò)模型篩選出高頻率指標(biāo)間相關(guān)性Fig.2 Correlations between high-frequency indicators selected with elastic network model

圖3 列線圖顯示區(qū)分COVID-19 和甲型流感的最終模型Fig. 3 Final model for distinguishing COVID-19 and influenza showed with nomogram

圖4 基于外部驗證數(shù)據(jù)集最終模型的ROC 曲線Fig. 4 ROC curve of final model based on external validation dataset

3 討論

本研究中，COVID-19 與甲型流感患者的大部分實驗室檢測結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，COVID-19 患者WBC 和NE 數(shù)量明顯低于甲型流感患者。甲型流感患者的WBC 和NE 數(shù)量在感染的第1 天 明 顯 升 高［9-10］，這 與LI 等［11］的 研 究 結(jié)果 一致。甲型流感患者的LY 數(shù)量低于COVID-19 患者，這可能與感染H7N9 的患者會出現(xiàn)淋巴細胞減少癥有 關(guān)［12］。研 究［13］顯 示：LY 計 數(shù) 減 低 在 甲 型 流 感的實驗室診斷中具有較高特異性，可以相對提高H1N1 患者的檢出率。由此可見，WBC 參數(shù)比較對于鑒別2種疾病具有一定的參考意義。FLICK等［14］也提出發(fā)熱和WBC 參數(shù)改變是甲型流感患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)，可將臨床診斷的靈敏度提高到86.4%。然而，多個研究［15-18］認為WBC 參數(shù)可能更有助于區(qū)分呼吸道病毒感染或細菌感染。此外，甲型流感患者的RBC、HGB 和HCT 值低于COVID-19 患者，RDW 值高于COVID-19患者。SALVAGNO 等［19］證明RDW 是紅細胞穩(wěn)態(tài)和紅細胞生成受損的重要指標(biāo)，其測定值升高也是炎癥和氧化狀態(tài)的標(biāo)志。在感染早期，H1N1 患者發(fā)熱和肺炎的發(fā)生率較高［20］，因此H1N1 患者的RDW 會明顯升高。

COVID-19 和H1N1 患者生化指標(biāo)也有明顯的改變。COVID-19 和H1N1 患者存在不同程度和原因不明的腎臟和肝臟功能損傷［21-25］。本研究中，甲型 流 感 患 者AST、 ALT 和GGT 的P75均 高 于COVID-19 患者，且高于參考區(qū)間上限，其TP、ALB 和GLB 水平的P25低于參考區(qū)間下限。這與ABELLEIRA 等［26］的研究結(jié)果一致。CO2-CP 指標(biāo)代表血漿中碳酸氫鹽的含量，臨床上可以作為判斷代謝性酸中毒和呼吸性堿中毒的重要指標(biāo)。COVID-19 患者的平均測量值低于參考區(qū)間下限，SARS-CoV-2 重型患者曾出現(xiàn)代謝性酸中毒，可直接 引 起CO2-CP 含 量 降 低［27］。H1N1 患 者 有 低 氧 血癥和二氧化碳分壓降低的臨床癥狀，這與CO2-CP含 量 降 低 有 關(guān)［5，23］。研 究 顯 示：COVID-19 和H1N1 患者會出現(xiàn)嘔吐和腹瀉癥狀［5，21］，超過50%的H1N1 患者出現(xiàn)低鉀血癥和低鈉血癥［23］，具體原因尚不清楚，但目前認為電解液參數(shù)的改變可能與上述臨床癥狀有關(guān)。

2 種疾病的實驗室結(jié)果雖然有所不同，但其變化特征是相似的。因此，為更好地對這2 種疾病進行分類，本研究基于實驗室指標(biāo)建立COVID-19 和甲型流感的鑒別診斷模型，選取高度特異性指標(biāo)用于臨床上區(qū)分上述2 種疾病。通過模型篩選，發(fā)現(xiàn)A/G、TBIL 和HCT 這3 種實驗室指標(biāo)具有較好的預(yù)測性能。甲型流感患者的ALB 水平明顯低于COVID-19 患者。H1N1 患者表現(xiàn)為嚴重的低蛋白血癥和低白蛋白血癥［28］。同時，甲型流感患者GLB 水平高于COVID-19 患者。上述結(jié)果間接證明甲型流感患者A/G 明顯降低，與本研究的結(jié)果一致。此外，甲型流感患者TBIL 水平明顯高于COVID-19 患者。ZHANG 等［29］的隊列研究中提出甲型流感患者TBIL 水平明顯升高可能是臨床藥物引起的肝臟功能損傷，在一定程度上影響TBIL 水平。HCT 是指一定體積的全血中RBC 的相對比例，其間接反映RBC 的數(shù)量和體積。本研究中，甲型流感患者HCT 水平低于COVID-19 患者，RBC 計 數(shù) 明 顯 低 于 COVID-19 患 者。MAKKOCH 等［30］通過血凝抑制試驗觀察了甲型流感病毒抗體與RBC 的結(jié)合能力，結(jié)果表明：人體中有一定數(shù)量的RBC 與甲型流感病毒抗體結(jié)合，這可能是導(dǎo)致甲型流感患者RBC 和HCT 低于COVID-19 患者的直接原因。因此，HCT 可能是作為鑒別2 種疾病的重要指標(biāo)。

建立有效的預(yù)測模型對減輕臨床醫(yī)生的工作量，提高醫(yī)療資源的合理利用具有重要的臨床意義。本研究所建立的模型主要有以下2 個優(yōu)點：①模型簡潔，易于理解和使用；②該模型綜合選取代表性實驗室檢測指標(biāo)用于區(qū)分COVID-19 和甲型流感，包括血液學(xué)和生化參數(shù)，提高診斷準(zhǔn)確性。綜上所述，本研究通過建立COVID-19 和甲型流感患者的實驗室指標(biāo)鑒別診斷模型，篩選出A/G、TBIL 和HCT 作為區(qū)分2 種疾病的特異性指標(biāo)。因此，該鑒別診斷模型在相關(guān)臨床癥狀基礎(chǔ)上，更有利于及時鑒別COVID-19 和甲型流感，具有一定的臨床實用性。