閩楠中WRKY家族成員鑒定及缺磷脅迫下表達(dá)分析*

張 苗 周生財 吳夢潔 童再康 韓 瀟 張俊紅 程龍軍

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室 杭州 311300； 2.麗水職業(yè)技術(shù)學(xué)院 麗水 323000)

磷元素(P)是植物生長發(fā)育所必需的大量元素之一，在生命大分子構(gòu)成、能量轉(zhuǎn)移、代謝調(diào)控和蛋白質(zhì)活化等生命活動中發(fā)揮重要作用(Raghothama, 1999)。植物主要吸收土壤中的可溶性無機磷，但土壤中磷主要以非生物活性的有機磷存在，限制了植物對土壤中磷的利用。而過量施用磷肥，不但增加農(nóng)作物生產(chǎn)成本，還會對環(huán)境造成污染(Daveetal., 2010; Vanceetal., 2003)。因此，在研究植物吸收、利用磷機制的基礎(chǔ)上，通過現(xiàn)代分子育種技術(shù)，提高植物自身吸收、利用磷的效率對農(nóng)作物和林木種植經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展具有重要作用。

土壤中可利用磷較少，植物在長期進(jìn)化基礎(chǔ)上形成了一系列分子水平上的適應(yīng)機制(Chiouetal., 2011; Chienetal., 2018)，明確植物在磷吸收、利用方面的分子機制是改善植物磷營養(yǎng)狀況的基礎(chǔ)。目前，在分子水平上，已有很多植物磷吸收、轉(zhuǎn)運和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及植物在低磷條件下采用的分子調(diào)控策略的研究(Zhangetal., 2014; Wangetal., 2017； Haetal.， 2014)。在植物適應(yīng)低磷脅迫的分子調(diào)控機制中，轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮了非常重要的作用。其中，MYB類轉(zhuǎn)錄因子PHR1被認(rèn)為是迄今為止發(fā)現(xiàn)的調(diào)控植物磷饑餓響應(yīng)的最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它通過調(diào)控PS1基因，影響很多磷脅迫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)(Pantetal., 2015； Nilssonetal., 2007)； 低磷環(huán)境下，bHLH32可以作為一個負(fù)調(diào)控因子參與調(diào)控花色素苷的合成及根毛形成過程(Chenetal., 2007)； 轉(zhuǎn)錄因子ZAT6則參與磷相關(guān)的根系發(fā)育以及磷在植物體內(nèi)的分布平衡(Devaiahetal., 2007)。

除此之外，WRKY轉(zhuǎn)錄因子也在植物磷饑餓脅迫中發(fā)揮重要作用。WRKY轉(zhuǎn)錄因子因其蛋白序列中含有1～2個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域WRKY(WRKYGQK)而得名。它通過識別基因啟動子區(qū)域的W-box元件(C/TTGACT/C)調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)(Eulgemetal., 2000)。除WRKY結(jié)構(gòu)域外，WRKY蛋白中一般還含有1～2個其特有的鋅指結(jié)構(gòu)域，參與DNA序列的結(jié)合。根據(jù)其序列特征，鋅指結(jié)構(gòu)域可分為2種類型： C-X4-5-C-X22-23-H-X-H(C2H2型)或C-X7-C-X23-H-X-C(C2HC型)。按照WRKY蛋白所含WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)目及鋅指結(jié)構(gòu)類型將它們分為3個亞類。第Ⅰ、Ⅱ亞類所含鋅指結(jié)構(gòu)均為C2H2型，WRKY結(jié)構(gòu)域在第Ⅰ亞類中為2個而在第Ⅱ亞類中為1個； 第Ⅲ亞類含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，但其鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2HC型(Eulgemetal., 2000)。擬南芥(Arabidopsisthaliana)的AtWRKY6、AtWRKY42、AtWRKY45、AtWRKY75和水稻(Oryzasativa)的OsWRKY74等都被證明在植物低磷脅迫下參與磷的轉(zhuǎn)運、分配和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對提高植物對低磷環(huán)境的適應(yīng)性發(fā)揮重要功能(Devaiahetal., 2007； Chenetal., 2009； Suetal., 2015； Daietal., 2016)。麻風(fēng)樹(Jatrophacurcas)的58個WRKY基因中有16個在低磷脅迫下表達(dá)發(fā)生明顯變化(Xiongetal., 2013)。大豆(Glycinemax)中GmWRKY45超表達(dá)也能提高植株對低磷脅迫的適應(yīng)性(Lietal., 2019)。在低磷條件下，對植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)功能和調(diào)控機制的深入研究和分析，不但能豐富對植物磷吸收和利用分子機制的了解，還有利于挖掘植物中參與磷吸收、利用相關(guān)的WRKY基因成員并加以利用。

目前對植物中WRKY基因低磷條件下響應(yīng)機制的研究還主要在幾種模式植物中，其他植物中報道很少。我國南方農(nóng)林用地主要以可吸收磷含量低的酸性紅壤土為主，土壤中低生物活性的磷會嚴(yán)重限制農(nóng)林植物的經(jīng)濟效益(于姣妲等, 2017)。針對我國南方較為廣泛種植的農(nóng)林植物，研究WRKY基因家族成員與低磷脅迫響應(yīng)之間的關(guān)系，對利用分子育種策略改善它們的種植效益是非常有意義的探索。

楠木(Phoebe)主要在浙江、福建、江西等地分布，是中國特有的珍貴樹種，材質(zhì)優(yōu)良，氣味芬芳，既可作用材樹種，生產(chǎn)名貴的家具，又可作觀賞用的行道樹。但由于其過度采伐逐漸成為瀕危保護(hù)樹種(Chenetal., 2020)。近年來，楠木人工林的培育開始興起，在資源保存和利用上發(fā)揮了重要作用，但在栽培和育種上仍有許多問題需要解決。尤其是楠木不耐貧瘠，在南方低磷立地條件下種植，生長會受到嚴(yán)重影響(賀維， 2015)。因此，研究楠木磷吸收利用的相關(guān)分子機制，推進(jìn)磷高效利用的楠木品種選育工作，對楠木產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

本研究以我國南方分布范圍比較廣的閩楠(Phoebebournei)為研究材料，在全基因組范圍內(nèi)鑒定了68個WRKY轉(zhuǎn)錄因子，分析了它們的基因結(jié)構(gòu)和蛋白編碼特征?；谵D(zhuǎn)錄組測序，對正常供磷、缺磷處理下的閩楠幼苗進(jìn)行了WRKY基因家族成員的表達(dá)分析，初步鑒定了楠木中磷脅迫響應(yīng)的WRKY基因，為進(jìn)一步研究這些基因在磷吸收、利用分子調(diào)控途徑中發(fā)揮的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

閩楠半同胞家系種子采集于浙江慶元楠木種子園，沙藏后第2年春播種，6個月后，選取長勢一致的植株作為試驗材料。缺磷試驗在植物培養(yǎng)箱(Snijders MC1000, 荷蘭) 中進(jìn)行，植株培養(yǎng)條件為： 白天溫度25 ℃，夜間溫度22 ℃； 相對濕度75%； 日照16 h/黑暗8 h； 光照強度150 μmol·m-2s-1。

1.2 PbWRKY家族基因成員鑒定

利用在線網(wǎng)站(http:∥pfam.xfam.org)下載WRKY轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型(pfam03106)，通過HMMER(ver 3.1)軟件中hmmsearch模塊在閩楠基因組蛋白序列文件中進(jìn)行檢索，E值設(shè)定為< e-20，去掉重復(fù)序列。對獲得的PbWRKY基因進(jìn)行染色體定位分析，并對PbWRKY基因進(jìn)行編號、命名。

1.3 PbWRKY家族基因及其編碼蛋白特性

對68個PbWRKY及擬南芥AtWRKY6、AtWRKY18、AtWRKY40、AtWRKY42、AtWRKY45、AtWRKY75和水稻OsWRKY74的蛋白序列用MEGA7.0構(gòu)建1 000個重復(fù)的無根鄰接(NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹。用在線軟件GSDS2.0(http:∥gsds.cbi.pku.edu.cn)分析PbWRKY基因的外顯子、內(nèi)含子的數(shù)目和位置。利用Protaram(https:∥web.expasy.org/protparam/)在線網(wǎng)站對PbWRKY家族成員編碼蛋白進(jìn)行氨基酸數(shù)目、分子質(zhì)量、等電點等理化特性預(yù)測。在https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi上的Batch CD-Search程序搜索PbWRKY蛋白序列中的WRKY結(jié)構(gòu)域和存在的其他結(jié)構(gòu)域。利用TBtools(ver.1.075)(Chenetal., 2020)作圖展示。氨基酸序列通過ClustalX(ver 1.81)進(jìn)行多序列比對，確定WRKY結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)域的位置。

1.4 PbWRKY家族基因組織特異性表達(dá)分析

以3年生閩楠半同胞家系植株為材料，選取根、韌皮部和形成層、木質(zhì)部和葉片為材料提取RNA，每個樣本重復(fù)3次，質(zhì)檢后的RNA用于RNA-seq文庫構(gòu)建，而后采用Illumina NovaseqTM6000 進(jìn)行測序，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量特征見表1。轉(zhuǎn)錄組測序由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司完成。

1.5 缺磷處理閩楠幼苗轉(zhuǎn)錄組分析

試驗材料分為對照組和缺磷處理組，每組各15株，每5株作為一個生物學(xué)重復(fù)。栽培方式為水培，對照組(Control，CK)采用1/4霍格蘭營養(yǎng)液，缺磷處理組(deficiency of phosphorus, Treatment)采用去除磷元素的1/4霍格蘭營養(yǎng)液，每3天更換1次營養(yǎng)液。根據(jù)前期預(yù)試驗，采取缺磷處理60天作為取樣時間點，分別取對照組與處理組各5株苗的根和成熟葉片，迅速液氮冷凍，作為1個重復(fù)用作RNA提取。試驗重復(fù)3次。轉(zhuǎn)錄組測序方法同1.4，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量特征見表1。

1.6 缺磷處理閩楠幼苗有效磷含量測定

分別取對照組與處理組各5株苗的根和成熟葉片樣品各1 g，作為1個重復(fù)，將樣品放入凍干機抽離水分，充分研磨后，測定有效磷含量。分別稱取樣品0.2 g于10 mL離心管中，加蒸餾水浸提，少量多次定容至 25 mL容量瓶中，并用0.22 μm水系濾膜過濾，溶液待測。利用間斷化學(xué)分析儀BluVisionTM(Skalar，荷蘭)測定磷含量。試驗重復(fù)3次。

磷含量(mg·g-1)=顯色液濃度(mg·L-1)×顯色體積(mL)/干質(zhì)量(g)×1 000。

1.7 RNA提取、cDNA逆轉(zhuǎn)錄和實時定量qPCR

將液氨中冷凍的樣品混合均勻，充分研磨。利用RNA植物多糖多酚提取試劑盒(TIANGEN，北京)提取組織總RNA。并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT(Takara，北京)進(jìn)行cDNA合成。實時定量qPCR試驗中，用Primer3(v.0.4.0)設(shè)計引物(表2)，引物合成由有康生物科技有限公司(杭州)完成。利用SYBR Premix Ex TaqTM II(Vazyme，南京)，在CFX-96-well Real-Time System(Bio-Rad，美國)進(jìn)行qPCR。反應(yīng)體系為： SYBR Premix Ex TaqTM II 5 μL，上下游引物各0.2 μL，稀釋5倍后的cDNA 0.4 μL，超純水4.2 μL，總體積10 μL。反應(yīng)程序為： 95 ℃預(yù)變性1 min； 95 ℃變性10 s，57 ℃退火持續(xù)10 s，72 ℃延伸20 s，45個循環(huán)。內(nèi)參基因為PbEF1α，按照 2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。

1.8 數(shù)據(jù)處理

運用Microsoft Excel對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理； 試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析在SPSS(ver 26.0)軟件上進(jìn)行，并用GraphPad Prism(ver 8.0)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PbWRKY基因和蛋白序列分析

通過hmmsearch搜索，最終得到68個閩楠WRKY基因。它們分別分布在12條染色體上和1條Scaffold上，呈不均勻分布。3號染色體上數(shù)量最多，有15個； 其次為5號染色體和9號染色體，分別有9個和8個； 1、2、7、8號染色體上各有5個，6和12號染色體上各有4個，4和10號染色體上分別有3個，11號染色體和Scaffold356上各有1個。根據(jù)其在染色體上的定位分別將基因命名為PbWRKY1-68(表3)。所有的PbWRKY基因均含有內(nèi)含子，最少1個，PbWRKY64內(nèi)含子數(shù)目最多，為28個(圖1)。基因長度在1 018 bp(PbWRKY38)～39 719 bp(PbWRKY64)之間。編碼氨基酸為169(PbWRKY11)～986(PbWRKY64)個。等電點在5.02(PbWRKY53)～9.81(PbWRKY39)之間。分子質(zhì)量為19.09(PbWRKY11)～111.56 kDa(PbWRKY64)(表3)。

表1 組織表達(dá)與缺磷處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量特征

表2 PbWRKY基因qPCR引物

表3 閩楠WRKY基因及編碼蛋白特性

續(xù)表 Continued

圖1 閩楠WRKY基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹、基因結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域

所有PbWRKY蛋白序列均含有1或2個WRKY結(jié)構(gòu)域，其核心蛋白序列為WRKYGQK； 同時含有1～2個WRKY蛋白所特有的鋅指結(jié)構(gòu)域，不同的WRKY基因編碼的蛋白序列中含有的鋅指結(jié)構(gòu)域可能不同，有的為C2H2型，有的則為C2HC型(Eulgemetal., 2000)(圖2)?；诘鞍仔蛄羞M(jìn)化樹的構(gòu)建及WRKY和鋅指結(jié)構(gòu)域的特征，68個PbWRKY可以分為I、II、III 3個亞類。其中，I亞類中含有14個PbWRKY，它們含有2個WRKY結(jié)構(gòu)域和2個C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域； 第1和2條染色體上的10個PbWRKY (PbWRKY1-10)全部為第I亞類，第I亞類的另外4個成員則集中分布在第3條染色體上，暗示第I亞類是在這3條染色體上進(jìn)行復(fù)制擴增的。II、III亞類中都僅含1個WRKY結(jié)構(gòu)域，分別各有47個和7個PbWRKY。但I(xiàn)I亞類中的鋅指結(jié)構(gòu)域與I亞類同為C2H2型，而III亞類中的鋅指結(jié)構(gòu)域則為C2HC型。第Ⅱ亞類中根據(jù)進(jìn)化關(guān)系的不同，又可分為Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe 5個子組，Ⅱa和Ⅱc分別含有6個和14個PbWRKY，其他子組都含有9個。Ⅱa和Ⅱb子組的PbWRKY蛋白序列中，除了WRKY結(jié)構(gòu)域之外，還有其他結(jié)構(gòu)域，如PbWRKY64的sec6結(jié)構(gòu)域(pfam06046)、PbWRKY67的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(bZIP superfamily，cl21462)、PbWRKY58和PbWRKY59的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(pfam15294)以及Ⅱd子組蛋白的鋅離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域(pfam10553)等(Droge-Laseretal., 2018； Babuetal., 2006； Yazdanietal., 2020)(圖1)。

2.2 PbWRKY基因組織表達(dá)特異性分析

閩楠根、韌皮部和形成層、木質(zhì)部和葉片的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果(圖3)表明，68個PbWRKY基因在不同組織中的表達(dá)特征可以分為5類： 韌皮部和形成層中相對表達(dá)量較低(5個)； 木質(zhì)部中表達(dá)量高而葉片中表達(dá)量較低(19個)； 韌皮部和形成層中表達(dá)量較高而葉片中表達(dá)量較低(10個)； 根中表達(dá)量相對較高(18個)； 葉片中表達(dá)量高而根中表達(dá)量低(16個)。不同PbWRKY基因組織表達(dá)特異性也有很大區(qū)別，表明它們的功能也有很大不同。

圖2 閩楠WRKY蛋白序列中WRKY結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)類型

圖3 閩楠WRKY基因不同組織部位表達(dá)熱圖

2.3 閩楠缺磷處理后有效磷含量的變化

由于不同植物響應(yīng)低磷脅迫的情況不同，根據(jù)前期預(yù)試驗，對6個月正常培養(yǎng)的閩楠幼苗進(jìn)行60天缺磷處理。60天后，缺磷處理的植株側(cè)根數(shù)量相對于對照明顯增多，較發(fā)達(dá)，但地上部表型與對照相比沒有明顯差異。缺磷處理的植株葉和根中有效磷含量均顯著下降(圖4)。正常培養(yǎng)的閩楠葉片有效磷含量平均為1.235 1 mg·g-1，缺磷處理葉片有效磷平均為0.249 0 mg·g-1，降幅為79.8%； 正常培養(yǎng)的閩楠根中有效磷含量平均為4.349 1 mg·g-1，缺磷處理根中有效磷含量平均為0.334 9 mg·g-1，降幅為92.3%。以上結(jié)果說明此時缺磷處理的閩楠植株已經(jīng)處于明顯的磷饑餓狀態(tài)。

圖4 正常培養(yǎng)和缺磷處理閩楠60天后葉片(A)和根(B)中有效磷含量變化

2.4 缺磷脅迫下PbWRKY基因表達(dá)分析

缺磷處理的閩楠幼苗葉、根的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明： 與對照相比，缺磷處理植株葉和根組織中表達(dá)差異達(dá)到2倍以上的PbWRKY基因共有21個，占PbWRKY基因總數(shù)目的30.9%(表4)。所有差異表達(dá)基因在缺磷處理的葉片中均被誘導(dǎo)，PbWRKY66誘導(dǎo)最強，誘導(dǎo)倍數(shù)達(dá)到了18.30倍。而根中表達(dá)差異達(dá)到2倍以上的基因共有5個，分別為PbWRKY52、PbWRKY55、PbWRKY56、PbWRKY65和PbWRKY66。在根中，它們在缺磷條件下表達(dá)均受到抑制。因此，這5個基因在缺磷處理60天的閩楠植株中有一個共同的表達(dá)特點，即在葉片中受缺磷誘導(dǎo)，而在根中受缺磷抑制。抑制最強的也是PbWRKY66，表達(dá)量僅為對照的0.091倍。

2.5 缺磷脅迫下PbWRKY基因表達(dá)的qPCR驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組的可靠性，將21個差異表達(dá)的PbWRKY基因進(jìn)行了qPCR驗證(圖5)。結(jié)果表明，這些基因的qPCR結(jié)果除了在差異表達(dá)倍數(shù)上有所浮動外，表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相吻合。說明轉(zhuǎn)錄組測序中基因表達(dá)的結(jié)果具有可靠性。在這21個基因中，有與參與擬南芥磷脅迫相關(guān)的WRKY基因相似程度很高的PbWRKY基因(圖6)。如與AtWRKY6、AtWRKY42同屬于Ⅱb子組的PbWRKY50、PbWRKY51、PbWRKY61等，它們都在葉片中受到強烈誘導(dǎo)；PbWRKY20則與AtWRKY45和AtWRKY75同屬于Ⅱc子組，該基因也表現(xiàn)為缺磷下葉片中的誘導(dǎo)表達(dá)； 而與AtWRKY40和AtWRKY18氨基酸序列相似程度較高的有PbWRKY52、PbWRKY65和PbWRKY66，這3個基因的表達(dá)模式均屬于缺磷脅迫下葉片中被誘導(dǎo)而根中被抑制。其他差異PbWRKY基因則表現(xiàn)為在葉片中被強烈誘導(dǎo)。

表4 閩楠幼苗缺磷處理60天后PbWRKY差異表達(dá)基因

圖5 qPCR分析差異基因表達(dá)量

圖6 PbWRKY和參與缺磷響應(yīng)的AtWRKY、OsWRKY蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

目前發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)高等植物基因組中，WRKY基因成員數(shù)目眾多。如擬南芥有72個(Eulgemetal., 2000)，水稻有102個(Rossetal., 2007)，毛果楊(Populustrichocarpa)有122個(Heetal., 2012)，大豆中甚至達(dá)到了176個(Songetal., 2016)。本研究在閩楠中共鑒定出68個WRKY基因。這些基因編碼蛋白的WRKY結(jié)構(gòu)域保守性很強，僅PbWRKY62的WRKY結(jié)構(gòu)域第6位氨基酸由“Q”變?yōu)椤癒”，這種變異會導(dǎo)致其結(jié)合的順式作用元件由W-box變?yōu)閃K-box(TTTTCCAC)，進(jìn)而引起調(diào)控基因上的差異(Verketal., 2008)?；赪RKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)特點，PbWRKY蛋白也分為I、II、III 3個亞類。一般認(rèn)為亞類I是進(jìn)化上較為古老的一類，含有2個WRKY結(jié)構(gòu)域(Zhangetal., 2005)。而數(shù)量最多的亞類II根據(jù)氨基酸序列的相似性及進(jìn)化關(guān)系，又可被分為5個不同的子組，各子組間屬于非單源性進(jìn)化關(guān)系(Rushtonetal., 2010)。但從PbWRKY的進(jìn)化關(guān)系上看，分類情況并非如此簡單，如PbWRKY37盡管含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域和1個C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，但進(jìn)化分析表明它不屬于任何一個已知亞類II的子組。這種情況在其他植物中也有發(fā)現(xiàn)，如擬南芥中的AtWRKY38和AtWRKY52(Eulgemetal., 2000)。麻風(fēng)樹中的WRKY家族成員也有類似情況(Xiongetal., 2013)。表明PbWRKY家族成員編碼蛋白序列比基于結(jié)構(gòu)域的分類具有更大多樣性，暗示基因功能分化也更為復(fù)雜。

PbWRKY基因組織表達(dá)特異性模式呈多樣性，在一定程度上也表明了不同PbWRKY基因成員可能發(fā)揮不同功能。而且，進(jìn)化上親緣關(guān)系比較近的PbWRKY基因，組織特異性表達(dá)模式也類似。如同屬于亞類I的PbWRKY2、PbWRKY3、PbWRKY7、PbWRKY18和PbWRKY19，它們都屬于韌皮部和形成層表達(dá)受抑制的類型；PbWRKY20、PbWRKY32、PbWRKY33、PbWRKY41、PbWRKY46和PbWRKY68均為IIc子組中成員，它們在閩楠木質(zhì)部表達(dá)量最高。由此可見，進(jìn)化上親緣關(guān)系較近的PbWRKY成員，其功能上可能具有一定的相關(guān)性。

WRKY基因在低磷脅迫中發(fā)揮著非常重要的作用。擬南芥中AtWRKY6和AtWRKY42作為負(fù)調(diào)控因子調(diào)控磷轉(zhuǎn)運體PHO1基因的表達(dá)，低磷條件下被抑制表達(dá)(Chenetal., 2009； Suetal., 2015)；AtWRKY45則可以通過結(jié)合在另一個磷轉(zhuǎn)運體PHT1基因的啟動子區(qū)域激活它的表達(dá)(Wangetal., 2014)。另外，AtWRKY18和AtWRKY40在低磷處理早期的根部也受到強烈誘導(dǎo)(Linetal., 2011)。水稻中超表達(dá)OsWRKY74的植株，在低磷條件下，相對于對照仍能顯著提高根和地上部分的生長量(Daietal., 2016)。小麥(Triticumaestivum)中與AtWRKY75同源的TaWRKY72b-1在煙草(Nicotiana)中超表達(dá)同樣能提高低磷下植株中的干質(zhì)量、單株磷積累量和磷利用效率(苗鴻鷹等， 2009)。這些結(jié)果都表明，WRKY基因是參與植物磷吸收、轉(zhuǎn)運途徑中分子調(diào)控的一類重要轉(zhuǎn)錄因子。本研究中缺磷60天的閩楠植株葉片和根中，約有1/3的PbWRKY基因的表達(dá)發(fā)生變化。與擬南芥負(fù)調(diào)控因子AtWRKY6和AtWRKY42親緣關(guān)系最近的PbWRKY50、PbWRKY51和PbWRKY61卻都在葉片中受到誘導(dǎo)，在根中PbWRKY50、PbWRKY61的表達(dá)也有一定程度的上調(diào)(未超過2倍)，這也表明這3個基因與AtWRKY6的功能有所不同。而在缺磷條件下差異表達(dá)的基因中，PbWRKY52、PbWRKY55、PbWRKY56、PbWRKY65和PbWRKY66這5個基因在根中被抑制表達(dá)的倍數(shù)超過2倍。低磷條件下，閩楠植株必然會通過基因調(diào)控作用提高根部吸收、轉(zhuǎn)運磷的效率，因此，這5個基因極有可能是磷吸收轉(zhuǎn)運的負(fù)調(diào)控因子，與AtWRKY6和AtWRKY42功能類似。它們在低磷條件下，通過對磷吸收轉(zhuǎn)運相關(guān)基因如PHO1等的抑制，提高植物吸收、利用磷的能力； 但它們同時在葉片中又被誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)倍數(shù)都在5倍以上，暗示它們除了參與根部磷的吸收和轉(zhuǎn)運，還可能參與了低磷條件下葉片中磷元素的再分配，其具體功能值得深入研究。另外，這5個基因中PbWRKY52、PbWRKY65和PbWRKY66在親緣關(guān)系上與擬南芥的AtWRKY18和AtWRKY40最近，它們均屬于IIa子組(圖6)。但AtWRKY18和AtWRKY40分別在低磷處理1 h和2 h后，誘導(dǎo)水平達(dá)到最高，24 h時相對于對照已沒有變化(Linetal., 2011)； 而閩楠中這3個基因在低磷60天時表現(xiàn)出受抑制的現(xiàn)象，是否表明其在磷饑餓前期和后期發(fā)揮的功能不同，或者木本植物中這3個基因與擬南芥中的同源基因具有不同的功能，這些都需要進(jìn)行進(jìn)一步研究加以證實。PbWRKY55和PbWRKY56則與OsWRKY74一樣都屬于第III亞類(圖6)。低磷條件下，OsWRKY74在植株葉片中被穩(wěn)定誘導(dǎo)，而在根中低磷處理早期有比較明顯的誘導(dǎo)，它可能參與了水稻的磷元素的吸收與平衡作用，但具體機制仍不清晰(Daietal., 2016)。因此PbWRKY55和PbWRKY56低磷條件下特殊表達(dá)模式產(chǎn)生的原因及基因的功能也值得深入探究。與磷吸收轉(zhuǎn)運正調(diào)控因子AtWRKY45和AtWRKY75親緣關(guān)系較近的差異表達(dá)基因為PbWRKY20，但它同樣表現(xiàn)出葉片中被誘導(dǎo)、根中被抑制(抑制表達(dá)未超過2倍)的表達(dá)模式，表明它也可能在植株地上部分和根中都參與了磷的吸收和轉(zhuǎn)運。

另外，其他具有顯著性表達(dá)差異的15個基因都僅在葉片中被誘導(dǎo)表達(dá)，很明顯，它們可能主要參與低磷條件下葉片磷元素的運輸及再分配過程。低磷條件下，植物地上部分的光合作用，生長以及碳的代謝、分配等過程都會受到嚴(yán)重影響，這些過程都與磷元素的再分配有關(guān)(Hideakietal., 1991)。WRKY基因極有可能參與其中，但到目前為止，涉及低磷條件下植株地上部分磷元素的運輸和再分配機制的研究很少(Wangetal., 2017)。在本研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步解析PbWRKY基因在植株地上部分參與的低磷響應(yīng)分子機制，對楠木的耐低磷分子輔助育種工作，以及豐富木本植物適應(yīng)磷脅迫的分子調(diào)控機制也有重要意義。

磷響應(yīng)相關(guān)的基因在磷處理的不同時間下，表達(dá)的模式會有很大的不同，60天缺磷處理盡管使植株處于了明顯磷饑餓狀態(tài)下，但單一處理時間點的選擇在一定程度上限制了低磷條件下WRKY基因表達(dá)分析的全面性，可能會使一些早期參與低磷脅迫響應(yīng)的基因未能被發(fā)現(xiàn)。今后研究應(yīng)該更加系統(tǒng)地分析低磷脅迫下WRKY基因的功能和調(diào)控機制。

4 結(jié)論

本研究在閩楠全基因組范圍內(nèi)，篩選鑒定出68個PbWRKY基因，命名為PbWRKY1-68,在所有染色體上都有分布。根據(jù)蛋白序列所含WRKY結(jié)構(gòu)域的個數(shù)和鋅指結(jié)構(gòu)類型，將其分為I、II、III 3個亞類，亞類II 又分為IIa、IIb、IIc、IId、IIe 5個子組，PbWRKY37在亞類II獨立分組。低磷處理60天，共有 21個PbWRKY基因在閩楠葉片和根中發(fā)生顯著性差異表達(dá)，所有21個基因均在葉片中被誘導(dǎo)上調(diào)，其中有5個PbWRKY基因在根中被抑制，表明這21個差異基因可能參與閩楠葉和根中的磷元素吸收、轉(zhuǎn)運和再分配過程。