復(fù)合酶解耦合微生物發(fā)酵制備海藻生物有機(jī)液肥的研究

亓守賀，李昊遠(yuǎn)，張 恒，孔凡克，曲 威

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院，山東 煙臺(tái) 264670）

中國(guó)擁有1.8 萬(wàn)km 的海岸線，水產(chǎn)資源豐富，自古以來(lái)，中國(guó)人就開始采撈和利用海藻。海藻不僅可以食用而且由于海藻中富含N、P、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、I 等大、中、微量元素［1］和海藻酸、海藻多糖、多酚化合物、萜類化合物、甜菜堿、多胺、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)（細(xì)胞分裂素［2］、生長(zhǎng)素、細(xì)胞激動(dòng)素［3］、脫落酸和赤霉素［4］）、高度不飽和脂肪酸等生物活性物質(zhì)，在功能食品、海洋藥物和動(dòng)物飼料等領(lǐng)域有巨大應(yīng)用潛力。

海藻液肥（Seaweed Liquid Fertilizer）是采用特殊生產(chǎn)工藝使大型海藻細(xì)胞壁破碎，釋放細(xì)胞內(nèi)容物而形成的液體肥料［5］，是一種新型無(wú)公害的綠色肥料。褐藻類可用于生產(chǎn)海藻肥，包括海帶、馬尾藻、巨藻、泡葉藻等［1］。利用海藻肥作用于農(nóng)作物和蔬菜的研究較多，施用海藻肥后可以提高種子發(fā)芽率［6］、提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)［7，8］、提高農(nóng)作物抗逆性［9］和抗病蟲害［10］等作用。

目前海藻液肥常用酸法、堿法或酸堿混合法進(jìn)行制備，這些方法常需要在強(qiáng)酸堿及高溫條件下進(jìn)行，會(huì)對(duì)海藻細(xì)胞內(nèi)生物源活性物質(zhì)造成破壞，并且化學(xué)物質(zhì)殘留量高，不易去除，影響海藻液肥的品質(zhì)及施肥效果。近幾年來(lái)隨著生物技術(shù)的廣泛應(yīng)用，生物酶解法成為海藻液肥的制備工藝之一［11，12］。海藻細(xì)胞壁的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和特殊韌性是阻礙海藻細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)釋放的關(guān)鍵因素［11］。如何高效提取、利用海藻中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并保證在加工過(guò)程中各種活性物質(zhì)不被破壞是海藻肥料生產(chǎn)加工領(lǐng)域的瓶頸。

因此，本研究采用自主研究的超速海藻粉碎機(jī)將風(fēng)干海藻粉碎，利用復(fù)合酶劑進(jìn)行酶解，使得海藻細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來(lái)，通過(guò)微生物菌劑發(fā)酵將海藻酶解液中大分子物質(zhì)降解為可溶性易被植物吸收利用的小分子物質(zhì)，以期開發(fā)新型海藻有機(jī)液肥。

1 材料與方法

1.1 材料

海藻為煙威海域自然生長(zhǎng)的海帶、滸苔和馬尾藻加工后的下腳料。復(fù)合酶劑和EM 微生物菌劑為中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院生物質(zhì)研究所配制。凱特98 綠芯黃瓜、四月慢油菜和精品206 番茄種子均購(gòu)于煙臺(tái)市種子站。

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)處理 新鮮海藻洗凈風(fēng)干后，利用超速海藻粉碎機(jī)粉碎至 100～200 目。按照1∶10（W/V）與蒸餾水混合，充分?jǐn)嚢杈鶆?，制成勻漿。

1.2.2 復(fù)合酶劑酶解反應(yīng) 取海藻勻漿100 mL，用稀鹽酸調(diào)整pH 至7.0 左右，加入復(fù)合酶，30 ℃攪拌酶解，反應(yīng)結(jié)束后，取上清液測(cè)定海藻酸含量。

1.2.3 復(fù)合酶劑酶解反應(yīng)單因素條件試驗(yàn)

1）酶反應(yīng)pH 條件對(duì)海藻酶解的影響。取100 mL 海藻勻漿，按 5%添加CPPX 復(fù)合酶，調(diào)節(jié) pH 為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 和8.0，酶解溫度為40 ℃，反應(yīng)時(shí)間為6 h，反應(yīng)結(jié)束后取樣測(cè)定海藻酸含量。

2）酶反應(yīng)溫度對(duì)海藻酶解的影響。取100 mL海藻勻漿，按5%添加CPPX 復(fù)合酶，調(diào)節(jié)pH 為7，酶解溫度為40、45、50、55、60、65、70 和75 ℃，反應(yīng)時(shí)間為6 h，反應(yīng)結(jié)束后取樣測(cè)定海藻酸含量。

3）復(fù)合酶添加量對(duì)海藻酶解的影響。取100 mL 海藻勻漿，調(diào)節(jié)pH 為7，按1%、2%、3%、4%、5%和6%添加CPPX 復(fù)合酶，酶解溫度為30 ℃，反應(yīng)時(shí)間為6 h，反應(yīng)結(jié)束后取樣測(cè)定海藻酸含量。

4）酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)海藻酶解的影響。取100 mL海藻勻漿，調(diào)節(jié)pH 為7，按5%添加CPPX 復(fù)合酶，酶解溫度為 30 ℃，反應(yīng)時(shí)間為 2、4、6、8、10、12、15、20和25 h，反應(yīng)結(jié)束后取樣測(cè)定海藻酸含量。

1.2.4 正交試驗(yàn) 在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)L（934），即酶解pH 為6.0、6.5和 7.0；酶解溫度 60、65 和 70 ℃；酶解時(shí)間為 6、8 和10 h；酶用量為3%、4%和5%。按正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化酶解海藻的條件。

表1 復(fù)合酶劑酶解海藻正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.5 混合菌劑發(fā)酵制備海藻肥

1）混合菌劑發(fā)酵時(shí)間對(duì)海藻肥發(fā)酵的影響。海藻酶解液調(diào)節(jié)pH 至7.0 左右，121 ℃高壓蒸氣濕熱滅菌20 min，按接種量3%、溫度30 ℃，裝瓶量40 mL/100 mL，轉(zhuǎn)速 180 r/min 進(jìn)行發(fā)酵。分別在 0、12、24、36、48、60 和 72 h 測(cè)定發(fā)酵液中海藻酸含量。

2）混合菌劑發(fā)酵接種量對(duì)海藻肥發(fā)酵的影響。海藻酶解液調(diào)節(jié)pH 至7.0左右，121 ℃高壓蒸氣濕熱滅菌20 min，接種量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，溫度30 ℃，裝瓶量40 mL/100 mL，轉(zhuǎn)速180 r/min 發(fā)酵48 h 后測(cè)定發(fā)酵液中海藻酸含量。

3）混合菌劑發(fā)酵裝瓶量對(duì)海藻肥發(fā)酵的影響。海藻酶解液調(diào)節(jié)pH 至7.0 左右，121 ℃高壓蒸氣濕熱滅菌20 min，接種量3%，按裝瓶量為20、30、40、50和60 mL/100 mL，溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min發(fā)酵48 h后測(cè)定發(fā)酵液中海藻酸含量。

4）混合菌劑發(fā)酵溫度對(duì)海藻肥發(fā)酵的影響。海藻酶解液調(diào)節(jié)pH 至7.0 左右，121 ℃高壓蒸氣濕熱滅菌20 min，接種量3%，按裝瓶量為40 mL/100 mL，調(diào)節(jié)溫度至35、40、45、50、55 和60 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min發(fā)酵48 h 后測(cè)定發(fā)酵液中海藻酸含量。

5）混合菌劑發(fā)酵初始pH 對(duì)海藻肥發(fā)酵的影響。調(diào)節(jié)海藻酶解液發(fā)酵初始 pH 至 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，121 ℃高壓蒸氣濕熱滅菌20 min，按接種量3%，溫度 30 ℃，裝瓶量 40 mL/100 mL，轉(zhuǎn)速 180 r/min 發(fā)酵48 h 后測(cè)定發(fā)酵液中海藻酸含量。

1.2.6 種子萌發(fā)試驗(yàn) 挑選種子大小近似、顆粒飽滿的凱特98 綠芯黃瓜、四月慢油菜和精品206 番茄種子，分別用清水和200、400、600、800、1 000 倍稀釋海藻液肥浸泡3 種蔬菜種子。每個(gè)處理的蔬菜種子均浸種12 h，浸種后用純凈水沖洗3 次。將種子均勻置于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中放置50 粒蔬菜種子，每個(gè)處理3 個(gè)平行，并用紗布覆蓋在種子上，置于光照培養(yǎng)箱中于25 ℃條件下培養(yǎng)，每天噴施純凈水保持濕潤(rùn)，培養(yǎng)期間觀察并記錄蔬菜種子的萌發(fā)情況，并計(jì)算種子發(fā)芽率。

1.2.7 海藻酸含量測(cè)定方法 酶解液中海藻酸含量測(cè)定采用分光光度法［13，14］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理分析及繪圖采用Excel 分析軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶劑酶解反應(yīng)單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 復(fù)合酶反應(yīng)pH 條件對(duì)海藻酶解的影響 復(fù)合酶解反應(yīng)pH 對(duì)海藻酶解的影響結(jié)果如圖1 所示。隨著酶解pH 的增加，海藻酶解后的產(chǎn)物海藻酸含量呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)pH 為6.5 時(shí)，海藻酶解后產(chǎn)生的海藻酸量最高。而pH 高于或低于6.5 時(shí)，復(fù)合酶的酶活較低，酶解海藻后的海藻酸產(chǎn)率低。這主要是由于pH 會(huì)影響蛋白酶的穩(wěn)定性、蛋白酶分子與酶解底物的結(jié)合情況以及對(duì)蛋白酶各解離基團(tuán)的影響，從而影響酶解反應(yīng)效率［15］。

圖1 復(fù)合酶反應(yīng)pH 對(duì)海藻酶解的影響

2.1.2 復(fù)合酶反應(yīng)溫度對(duì)海藻酶解的影響 復(fù)合酶解反應(yīng)溫度對(duì)海藻酶解的影響結(jié)果如圖2 所示。隨著酶解反應(yīng)溫度的升高，酶解后海藻酸的含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，并且在65 ℃左右達(dá)到最大含量。對(duì)于蛋白酶來(lái)說(shuō)，酶解溫度過(guò)低蛋白酶的活性較低，但是酶解溫度過(guò)高又會(huì)導(dǎo)致蛋白酶的活性部分或完全喪失。因此，適合的酶解反應(yīng)溫度有利于海藻水解。

圖2 復(fù)合酶反應(yīng)溫度對(duì)海藻酶解的影響

2.1.3 復(fù)合酶添加量對(duì)海藻酶解的影響 復(fù)合酶添加量對(duì)海藻酶解的影響結(jié)果如圖3 所示。隨著復(fù)合酶添加量的增加，海藻酸的含量逐漸增加，當(dāng)復(fù)合酶添加量大于4%時(shí)，海藻酸含量趨于穩(wěn)定。這主要是由于在酶解反應(yīng)體系中，蛋白酶添加量過(guò)少時(shí)，底物海藻不能完全被酶解，因此效果較差；當(dāng)?shù)鞍酌柑砑舆^(guò)多時(shí)，所有的底物海藻均已被酶解，同時(shí)酶解產(chǎn)物也會(huì)抑制蛋白酶的活性。

圖3 復(fù)合酶添加量對(duì)海藻酶解的影響

2.1.4 復(fù)合酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)海藻酶解的影響 復(fù)合酶解反應(yīng)時(shí)間對(duì)海藻酶解的影響結(jié)果如圖4 所示。在復(fù)合酶反應(yīng)8 h后，水解的海藻酸含量上升減緩，15 h后海藻酸含量達(dá)到最大值，此后趨于穩(wěn)定。

圖4 復(fù)合酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)海藻酶解的影響

2.2 復(fù)合酶反應(yīng)正交試驗(yàn)結(jié)果

復(fù)合酶反應(yīng)正交試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。由表2可以看出，對(duì)于海藻的酶解來(lái)說(shuō)，A2、B2、C3和D2為最佳優(yōu)化工藝條件，由R值還可以看出，影響海藻酶解的因素為酶解時(shí)間＞酶添加量＞酶解溫度＞酶解pH。由此得到各因素的最佳組合為A2B2C3D2，即酶解pH為6.5，酶解溫度為65 ℃，酶添加量為5%，酶解時(shí)間為8 h。通過(guò)試驗(yàn)檢驗(yàn)，得到酶解后海藻酸的含量為46.27 mg/mL，大于正交試驗(yàn)結(jié)果中A2B1C3D2組合的最大海藻酸含量，說(shuō)明利用正交試驗(yàn)優(yōu)化海藻酶解工藝是有效的。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 利用微生物菌劑對(duì)海藻酶解液發(fā)酵的影響

2.3.1 微生物菌劑發(fā)酵時(shí)間對(duì)海藻肥發(fā)酵的影響不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)微生物菌劑發(fā)酵海藻酸的影響見圖5，海藻酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降，表明微生物菌劑可以利用酶解液中的海藻酸，通過(guò)發(fā)酵可以降解為小分子物質(zhì)。在發(fā)酵36 h 后，發(fā)酵液中海藻酸含量趨于穩(wěn)定，因此選擇36 h 為發(fā)酵終點(diǎn)。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中海藻酸含量的影響

2.3.2 微生物菌劑發(fā)酵接種量對(duì)海藻肥發(fā)酵的影響 由圖6 可知，隨著微生物菌劑接種量的增加，酶解發(fā)酵液中海藻酸含量下降明顯，當(dāng)微生物菌劑接種量大于0.3%時(shí)，發(fā)酵液中海藻酸含量趨于穩(wěn)定。因此，選擇0.3%的接種量為微生物發(fā)酵時(shí)的添加量。

圖6 接種量對(duì)發(fā)酵液中海藻酸含量的影響

2.3.3 微生物菌劑發(fā)酵裝瓶量對(duì)海藻肥發(fā)酵的影響 從圖7 可知，在容積為100 mL 發(fā)酵瓶中，隨著裝瓶量增大，發(fā)酵液中海藻酸含量逐漸增加，說(shuō)明發(fā)酵通氣量對(duì)微生物菌劑發(fā)酵分離酶解液中海藻酸影響明顯。過(guò)低裝瓶量雖然有利于海藻酸轉(zhuǎn)化利用，但是降低了發(fā)酵設(shè)備的利用率。因此，在發(fā)酵過(guò)程中，選用40 mL/100 mL 的裝瓶量。

圖7 裝瓶量對(duì)發(fā)酵液中海藻酸含量的影響

2.3.4 微生物菌劑發(fā)酵溫度對(duì)海藻肥發(fā)酵的影響適宜的發(fā)酵溫度有利于微生物快速生長(zhǎng)以及進(jìn)行物質(zhì)代謝，不同發(fā)酵溫度對(duì)微生物菌劑發(fā)酵酶解液的影響如圖8 所示。發(fā)酵溫度過(guò)低或過(guò)高均不利于微生物菌劑對(duì)酶解液中海藻酸的轉(zhuǎn)化利用。當(dāng)發(fā)酵溫度為45 ℃時(shí)，發(fā)酵液中海藻酸含量最低，說(shuō)明此溫度是該微生物菌劑生長(zhǎng)最適宜溫度。因此，選擇45 ℃為最適發(fā)酵溫度。

圖8 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液中海藻酸含量的影響

2.3.5 微生物菌劑發(fā)酵初始pH 對(duì)海藻肥發(fā)酵的影響 從圖9 可以看出，隨發(fā)酵初始pH 增大，酶解液中海藻酸的含量顯著降低，說(shuō)明發(fā)酵初始高pH 有利于微生物菌劑對(duì)酶解液中海藻酸的轉(zhuǎn)化利用。因海藻利用復(fù)合酶劑進(jìn)行酶解后，所得到的酶解液pH 約為6.5，若提高微生物菌劑發(fā)酵的初始pH，雖有利于發(fā)酵轉(zhuǎn)化，但是需要添加堿或堿性物質(zhì)，發(fā)酵成本提高，不利于大規(guī)模發(fā)酵應(yīng)用。因此，選擇微生物菌劑發(fā)酵酶解液的初始pH 為6.5。

圖9 發(fā)酵pH 對(duì)發(fā)酵液中海藻酸含量的影響

2.3.6 優(yōu)化條件下微生物菌劑發(fā)酵海藻酶解液制備海藻液肥 通過(guò)發(fā)酵工藝單因素優(yōu)化試驗(yàn)，確定微生物菌劑發(fā)酵海藻酶解液的條件為發(fā)酵時(shí)間36 h、微生物菌劑接種量0.3%、發(fā)酵裝瓶量40 mL/100 mL、發(fā)酵溫度45 ℃、發(fā)酵初始pH 6.5。在優(yōu)化工藝條件下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中海藻酸含量為26.354 mg/mL。

2.4 海藻液肥對(duì)蔬菜種子萌發(fā)的影響

不同海藻液肥稀釋液處理對(duì)凱特98 綠芯黃瓜、四月慢油菜和精品206 番茄種子萌發(fā)的影響結(jié)果見表3。與清水對(duì)照組相比，各稀釋倍數(shù)的海藻液肥對(duì)3 種蔬菜種子均具有促進(jìn)種子萌發(fā)的效果，主要是由于海藻肥中含有多種天然活性物質(zhì)以及海藻經(jīng)破壁后細(xì)胞內(nèi)的小分子生物活性物質(zhì)釋放，對(duì)種子的萌發(fā)起到促進(jìn)作用。其中600 倍稀釋的發(fā)酵海藻液肥最適合用于種子發(fā)芽。

表3 海藻肥處理對(duì)蔬菜種子發(fā)芽率的影響 （單位：%）

3 結(jié)論

本研究中以海帶、滸苔和馬尾藻等為原料，利用復(fù)合酶（主要包括纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等）進(jìn)行酶解，對(duì)酶解pH、酶解溫度、酶添加量和酶解反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行研究，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)獲得復(fù)合酶酶解海藻的最佳工藝條件為酶解pH 6.5、酶解溫度65 ℃、酶添加量5%、酶解時(shí)間8 h。利用微生物菌劑對(duì)海藻酶解液進(jìn)一步發(fā)酵，通過(guò)發(fā)酵工藝優(yōu)化，獲得最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵時(shí)間36 h、微生物菌劑接種量0.3%、發(fā)酵裝瓶量40 mL/100 mL、發(fā)酵溫度45 ℃、發(fā)酵初始pH 6.5。經(jīng)600 倍稀釋的海藻液肥能顯著促進(jìn)3 種蔬菜種子的萌發(fā)，萌發(fā)率分別比對(duì)照提高了30.99%、19.77%和19.94%。

利用天然海藻為原料生產(chǎn)海藻液肥，主要制備難點(diǎn)在于既要有效降解海藻中大分子物質(zhì)（如果膠質(zhì)、蛋白質(zhì)和纖維素等），又要最大程度保留海藻中的營(yíng)養(yǎng)元素和生物活性物質(zhì)。目前，國(guó)內(nèi)制備海藻肥的工藝主要采用物理法破碎、化學(xué)法提取等，通常會(huì)破壞海藻中有效活性成分，嚴(yán)重影響肥效。利用生物法制備海藻肥是現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)的最有效工藝之一。本研究采用復(fù)合酶解耦合微生物發(fā)酵技術(shù)，有效解決海藻破壁問(wèn)題，使海藻細(xì)胞內(nèi)容物充分釋放，并保留了海藻中有效生物活性成分。