貴式肉品中乳酸菌的選育及其對(duì)發(fā)酵里脊火腿風(fēng)味品質(zhì)的影響

周 潔，李洪英,2，朱秋勁,2,*，萬 婧,2，周 穎，胡 可，田志擎，況于光，李 晴

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550005；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心，高原山區(qū)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；3.貴陽吉品風(fēng)味食品有限公司，貴州 貴陽 550018）

發(fā)酵肉制品是指在微生物或酶作用下，自然或人為控制條件形成的一類具有特殊風(fēng)味、質(zhì)地和色澤，且能保存較長(zhǎng)時(shí)間的高檔肉制品[1]。里脊火腿是一種低溫發(fā)酵肉制品，發(fā)酵周期短，不僅有肉纖維的彈性，且較高溫肉制品，其營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味更豐富，肉類蛋白質(zhì)和脂肪經(jīng)微生物發(fā)酵作用被水解為更易被人體吸收的小分子物質(zhì)，提高人體對(duì)肉制品中營(yíng)養(yǎng)成分的利用[2]。我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品制作周期長(zhǎng)，生產(chǎn)季節(jié)性、區(qū)域性較強(qiáng)，標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)不足，因此，開發(fā)直投式發(fā)酵劑不僅有助于縮短生產(chǎn)周期，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，而且可以提升產(chǎn)品的安全性，抑制腐敗微生物和病原微生物生長(zhǎng)，提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性、感官質(zhì)量和保存性[3]。

乳酸菌是一類革蘭氏陽性菌，需氧或兼性厭氧，可通過多種途徑抑制某些腐敗菌的生長(zhǎng)，如產(chǎn)生苯乳酸、乙酸或乳酸等有機(jī)酸而導(dǎo)致環(huán)境pH值降低，從而抑制不耐酸細(xì)菌的生長(zhǎng)；其次乳酸菌能產(chǎn)生具有抑菌活性的代謝產(chǎn)物，即細(xì)菌素（Nisin、羅氏菌素、片球菌素、鏈球菌素等）以及類細(xì)菌素[4]；同時(shí)其產(chǎn)生的有機(jī)酸既可以延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期還可以增加肉制品的風(fēng)味[5]。肉制品生產(chǎn)中使用的乳酸菌主要有植物乳桿菌、清酒乳桿菌、戊糖片球菌等，這些菌株不具有毒性因子，如氨基酸脫羧能力、產(chǎn)腸毒素、溶血性或脫氧核糖核酸酶活性[6]。

將植物乳桿菌單一或混合發(fā)酵可提高肉制品的品質(zhì)和安全性。潘曉倩等[7]從腌臘肉中篩選得到植物乳桿菌10M-7應(yīng)用于臘腸，降低了有害菌數(shù)量。單菌發(fā)酵還能改善香腸感官性狀[8]，抑制產(chǎn)品氧化酸敗[9]，生產(chǎn)功能性干腌香腸[10]。Dicks等[11]將植物乳桿菌423和彎曲乳桿菌D126混合發(fā)酵可有效抑制意大利香腸中單核細(xì)胞性李斯特菌的生長(zhǎng)；陳一萌等[12]研究表明植物乳桿菌和戊糖片球菌共同發(fā)酵牦牛肉可提升產(chǎn)品嫩度；Hu Yingying等[13]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌混合發(fā)酵還能改善干腌香腸口感。此外，添加植物乳桿菌可降解亞硝酸鹽[14]，降低產(chǎn)品中生物胺含量[15]，水解肌肉蛋白促進(jìn)肉制品風(fēng)味形成[16-18]，提高低鹽發(fā)酵肉制品安全性[19]。

本研究從貴式傳統(tǒng)發(fā)酵肉和腌臘制品中篩選得到強(qiáng)蛋白質(zhì)降解能力的植物乳桿菌SJ-4，并應(yīng)用于發(fā)酵里脊火腿，探討該菌株對(duì)火腿色澤、質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味的影響，以期為本土微生物資源的挖掘利用、肉類直投式發(fā)酵劑的研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

威寧火腿 畢節(jié)市正文食品加工廠；盤縣火腿貴州楊老奶食品有限公司；錦屏酸肉購(gòu)于楊儀文醬菜作坊；榕江酸肉購(gòu)于榕江農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；黔五福風(fēng)肉、黔五福香腸 貴州五福仿食品股份有限公司；遵義香腸、風(fēng)肉遵義黔之農(nóng)食品有限公司；凱里風(fēng)肉、凱里香腸購(gòu)于凱里市興聯(lián)民種養(yǎng)殖農(nóng)民專業(yè)合作社；畢節(jié)風(fēng)肉為農(nóng)家自制；豬里脊、脫脂乳、食鹽、白糖、胡椒粉等均購(gòu)于貴陽花溪沃爾瑪超市。

MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、PY培養(yǎng)基、PYG液體培養(yǎng)基（在PY培養(yǎng)基中添加10 g/L葡萄糖）上海博微生物科技有限公司；細(xì)菌微量生化鑒定管（賴氨酸脫羧酶肉湯、L-精氨酸雙水解酶、氨基酸脫羧酶對(duì)照、H2S生化管、V-P半固體瓊脂） 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫鈉、硫酸銨、液體石蠟、甘油、革蘭氏染色試劑、L-精氨酸、α-萘酚、氫氧化鉀、氯化鈉、亞硝酸鹽、過氧化氫、硝酸鉀、Griss試劑、甲基紅、石蕊、納賽爾試劑、三丁酸甘油酯、葡萄糖、吐溫-80、溴甲酚紫（均為分析純）天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；2hTaqPCR Master Mix天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司；酪蛋白 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FB超凈工作臺(tái)、YM-COS-100B恒溫?fù)u床、YM-08X無菌均質(zhì)機(jī) 上海豫明儀器責(zé)任有限公司；AR224CN電子分析天平 美國(guó)Ohaus儀器有限公司；SPX-300生化培養(yǎng)箱 浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司；LS-75LD全自動(dòng)高壓滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；Seven2GOTMpH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Thermal Cycler2720聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Applied Biosystem公司；DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠；L5S紫外分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；SpectraMAX190酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；XHF-DY高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；TA.TOUCH質(zhì)構(gòu)儀 上海保圣科技有限公司；NH350便捷式電腦色差儀 安捷倫科技有限公司；SA402B電子舌 北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司；Pegasus GC-HRT 4D+全二維氣相色譜高通量高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)力可公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離純化與保藏

肉樣剪碎成米粒大小，稱取10 g，加入90 mL無菌生理鹽水，經(jīng)無菌均質(zhì)機(jī)拍打后作10 倍稀釋，選取3個(gè)適當(dāng)稀釋濃度分別吸取200 μL涂布于MSR瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，根據(jù)《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》[20]對(duì)符合條件的單菌落進(jìn)行初步篩選并分離純化，反復(fù)劃線直至革蘭氏染色鏡檢結(jié)果無雜菌，停止分離純化，將純化的革蘭氏陽性菌株4 ℃斜面保存，同時(shí)保存于-80 ℃ 40%甘油管中。

菌株活化：吸取200 μL甘油管中的菌液至10 mL MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃活化3次得到107CFU/mL菌液，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 菌株初篩

蛋白降解實(shí)驗(yàn)：稱取10 g肉樣于離心管中，加入200 mL 50 mmol/L pH 7.5預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液，12 000 r/min勻漿3次后于4 ℃、8 000 r/min離心15 min，重復(fù)3次，收集沉淀并冷凍干燥成粉末，得到肌原纖維蛋白[21]。將新鮮碎肉分散在10 倍體積的磷酸鹽緩沖液（40 mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4、50 mmol/L NaCl，pH 6.0）中，12 000 r/min均質(zhì)30 s后12 000 r/min、4 ℃離心15 min，用紗布快速過濾收集上清液，加入硫酸銨至飽和，連續(xù)攪拌析出肌漿蛋白，10 000 r/min、4 ℃離心15 min收集沉淀，冷凍干燥成粉末，得到肌漿蛋白[22]。在MRS培養(yǎng)基中加入1%上述預(yù)先提取的肌原纖維蛋白和肌漿蛋白，115 ℃滅菌后使用7 mm打孔器打孔，加入100 μL菌液，37 ℃培養(yǎng)24 h測(cè)量降解圈直徑。

產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)：吸取400 μL菌液加入20 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)定pH值。

發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)：在1 L PY培養(yǎng)基中加入30 g葡萄糖、0.5 mL吐溫-80、1.4 mL 1.6 g/100 mL溴甲酚紫，分裝10 mL試管后放入倒置的杜氏小管，滅菌后接入200 μL菌液，使用無菌石蠟液封，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，若杜氏小管中有氣泡為陽性，無氣泡為陰性[23]。

1.3.3 菌株復(fù)篩

1.3.3.1 菌株生產(chǎn)適應(yīng)性

耐鹽性實(shí)驗(yàn)：將活菌數(shù)107～108CFU/mL菌液活化3 代后按2%接種量接入含6 g/100 mL NaCl的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h測(cè)定OD600nm[24]。

耐亞硝酸鹽實(shí)驗(yàn)：將活菌數(shù)107～108CFU/mL菌液活化3 代后按2%接種量接入含150 mg/kg NaNO2的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h測(cè)定OD600nm[24]。

耐酸實(shí)驗(yàn)：將活菌數(shù)107～108CFU/mL菌液活化3 代后按2%接種量接入pH 5.0的MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h測(cè)定其OD600nm[24]。

1.3.3.2 菌株安全性

氨基酸脫羧酶活性實(shí)驗(yàn)：分別吸取300 μL菌液于細(xì)菌微量生化鑒定管（賴氨酸脫羧酶肉湯、L-精氨酸雙水解酶、氨基酸脫羧酶對(duì)照）中，接種后覆蓋300 μL無菌液體石蠟，37 ℃培養(yǎng)24 h，若實(shí)驗(yàn)管紫色、對(duì)照管黃色，則為陽性反應(yīng)；若實(shí)驗(yàn)管和對(duì)照管均為黃色，則為陰性反應(yīng)。

1.3.3.3 菌株作為肉用發(fā)酵劑的評(píng)定

硝酸鹽還原酶實(shí)驗(yàn)：在MRS培養(yǎng)基中加入0.2%硝酸鉀，將純菌落劃線后37 ℃培養(yǎng)48 h，滴入Griess試劑A液（150 mL 20%鹽酸中加入0.5 g對(duì)氨基苯磺酸）、B液（0.2 g鹽酸萘乙二胺溶于100 mL蒸餾水），觀察菌落周圍是否出現(xiàn)紅圈并測(cè)量紅圈直徑[24]。

產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)：將0.5 g NaCl、0.5 g精氨酸溶于100 mL脫脂牛乳中，接入0.2%的菌液，37 ℃培養(yǎng)24 h后滴入1 滴納賽爾試劑，有黃色沉淀為陽性，無沉淀為陰性[24]。

產(chǎn)黏性實(shí)驗(yàn)：將菌落接種于MRS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行觀察。

產(chǎn)H2S實(shí)驗(yàn)：將菌落穿刺于H2S細(xì)菌微量生化鑒定管，37 ℃培養(yǎng)24 h，若穿刺線變黑呈傘狀生長(zhǎng)則為陽性，清晰無變化為陰性。

脂肪酶分解活性實(shí)驗(yàn)：MRS瓊脂培養(yǎng)基121 ℃滅菌20 min后冷卻至80 ℃，加入1%滅菌的三丁酸甘油酯，得到脂肪酶培養(yǎng)基，挑取單菌落接種于該培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)降解圈。

1.3.3.4 生理生化鑒定

石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)：在100 mL脫脂牛乳中加入4 mL 25 g/mL石蕊試劑，分裝10 mL試管滅菌后接入0.2%菌液37 ℃培養(yǎng)2 d觀察石蕊牛奶是否凝固[23]。

接觸酶實(shí)驗(yàn)（過氧化氫實(shí)驗(yàn)）：挑取單個(gè)菌落至PYG培養(yǎng)基中，滴加3%過氧化氫，若有氣泡生成為陽性，無氣泡為陰性[25]。

甲基紅實(shí)驗(yàn)：接種2%菌液至PYG培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后滴入甲基紅指示劑，變紅為陽性，變黃為陰性。

乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn)（V-P實(shí)驗(yàn)）：挑取單個(gè)菌落穿刺V-P半固體瓊脂細(xì)菌微量生化鑒定管，37 ℃培養(yǎng)24 h，滴入試劑A（6%α-萘酚-乙醇溶液）6 滴、試劑B（40% NaOH溶液）2 滴，靜置30 min后觀察，穿刺線無明顯變化為陰性；穿刺線變紅呈傘狀生長(zhǎng)為陽性。

1.3.4 菌株SJ-4最適生長(zhǎng)條件的確定

將菌液以4%接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基，分別在17、22、27、32、37、42、47 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)定菌液OD600nm，確定菌株最適生長(zhǎng)溫度[26]。將菌液以4%接種量分別接種于pH 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，每12 h測(cè)定一次菌液OD600nm，確定菌株最適生長(zhǎng)pH值。

1.3.5 菌株SJ-4生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線的測(cè)定

將菌液以4%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，每隔2 h測(cè)定一次OD600nm和pH值。

1.3.6 菌株SJ-4 16S rDNA分子生物學(xué)鑒定

將篩選出的菌液使用細(xì)菌通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）、1492R（5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’）擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA，使用1%瓊脂糖凝膠電泳20 min，送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序后進(jìn)入NCBI網(wǎng)站BLAST程序進(jìn)行同源性比對(duì)，使用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.7 植物乳桿菌SJ-4對(duì)發(fā)酵里脊火腿質(zhì)構(gòu)及色差的影響

發(fā)酵里脊火腿的制作：將市售里脊使用少量高粱酒去腥，風(fēng)干后加入2.5%食鹽、0.01%亞硝酸鈉、0.15%異抗壞血酸鈉、0.8%花椒粉、0.5%三聚磷酸鈉、0.8%白糖、0.5%白胡椒、0.5%五香粉（均按肉質(zhì)量計(jì)），0～4 ℃腌制24 h后使用無菌注射器按107CFU/g接入SJ-4菌液，真空滾揉30 min后于30 ℃發(fā)酵24 h，結(jié)束后50 ℃烘烤4 h再真空包裝。以不接菌液為對(duì)照組。

質(zhì)構(gòu)測(cè)定：去除火腿表面，切成2 cmh2cmh2 cm立方體，使用TA/36探頭，測(cè)前速率1 mm/s，測(cè)后速率1 mm/s，壓縮率50%，觸發(fā)力5 g，間隔時(shí)間2 s，測(cè)定硬度、彈性、黏聚性、咀嚼性。

色差測(cè)定：去除火腿表面，切成長(zhǎng)、寬均為3 cm片狀，測(cè)定紅度值（a*）、黃度值（b*）、亮度值（L*），同時(shí)使用E*評(píng)價(jià)，，減少色澤誤差。

1.3.8 植物乳桿菌SJ-4發(fā)酵里脊火腿電子舌分析

切除火腿表面，取10 g加入100 mL蒸餾水使用高壓均質(zhì)機(jī)攪碎，30 ℃浸提3 h后于冷凍離心機(jī)4 ℃、6 000 r/min離心15 min后取上清液20 mL，加入60 mL蒸餾水稀釋，倒入電子舌樣品杯中測(cè)定，取中間測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3.9 植物乳桿菌SJ-4對(duì)里脊火腿風(fēng)味的影響

取5 g樣品加入20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，使用老化的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭于60 ℃萃取30 min。

色譜條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣，ffap色譜柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm），載氣高純氦氣，流速1 mL/min。升溫條件：40 ℃保持3 min，8 ℃/min升至230 ℃，保持5 min，儀器采用一維模式。

質(zhì)譜條件：電子電離源，陽離子模式，電子轟擊能量70 eV，離子源溫度210 ℃，傳輸線溫度250 ℃，質(zhì)譜分辨率25 000，質(zhì)量范圍33～450 u。

采用NIST 17和Wiley 9結(jié)合保留指數(shù)同時(shí)檢索，利用Leco公司軟件進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析確定化合物（匹配度大于800）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，結(jié)果表示為 fs，采用Excel軟件處理數(shù)據(jù)，Origin 2019軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株初篩結(jié)果

如表1所示，貴州發(fā)酵肉制品分離純化的乳酸菌中有37 株菌能降解肌原纖維蛋白，48 株菌能降解肌漿蛋白，對(duì)這些菌株進(jìn)行產(chǎn)酸和發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)。

表1 降解蛋白質(zhì)菌株的初篩Table 1 Screening of protein-degrading strains

產(chǎn)酸能力是評(píng)價(jià)乳酸菌作為肉制品發(fā)酵劑的重要因素，與發(fā)酵肉的品質(zhì)和安全性密切相關(guān)，其產(chǎn)酸能力應(yīng)滿足24 h液體培養(yǎng)后pH≤3.8[27]。剔除部分異型乳酸菌，從降解蛋白質(zhì)的菌株中選取滿足上述條件16 株菌SJ-1、SJ-4、SJ-5、SJ-6、SJ-7、SJ-8、SJ-9、SJ-10、SJ-11、SJ-14、SJ-16、SJ-17、RS-1、RS-16、RS-18、RS-20進(jìn)行研究。

2.2 菌株初篩結(jié)果

2.2.1 菌株耐鹽能力

發(fā)酵肉制品中食鹽添加量一般為2%～6%，因此發(fā)酵菌株需有一定耐鹽性[28]。由圖1可知，16 株乳酸菌在含6 g/100 mL NaCl的MRS肉湯培養(yǎng)基中均可生長(zhǎng)，其中SJ-4 OD600nm顯著高于其他菌株（P＜0.05），耐鹽性較好。乳酸菌等細(xì)菌可以積累甜菜堿和四氫吡啶抵御外界滲透壓脅迫[29]，賦予菌株耐鹽性。此外，嗜鹽菌相關(guān)酶類等功能蛋白在氨基酸組成和結(jié)構(gòu)等方面也具有適應(yīng)高鹽環(huán)境的特征。除SJ-1、SJ-4外，其他菌株OD600nm較低，這是因?yàn)樵谳^高NaCl質(zhì)量濃度下微生物細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，結(jié)構(gòu)損傷，菌株生理代謝活動(dòng)紊亂，生長(zhǎng)緩慢或死亡[30]。

圖1 菌株對(duì)6 g/100 mL NaCl耐受性Fig.1 Tolerance of strains to 6 g/100 mL of NaCl

2.2.2 菌株耐亞硝酸鹽能力

發(fā)酵肉制品中添加一定量的亞硝酸鹽有助于產(chǎn)品色澤的形成并抑制肉毒桿菌的生長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)選取GB 2760ü 2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定的肉制品中亞硝酸鹽最大使用量150 mg/kg。由圖2可知，在添加150 mg/kg亞硝酸鹽培養(yǎng)基中，16 株菌均能生長(zhǎng)，即在較高NaNO2水平下菌株可以自身調(diào)節(jié)，這可能與菌株自身的相容性溶質(zhì)調(diào)控系統(tǒng)、糖酵解關(guān)鍵酶調(diào)控系統(tǒng)、胞內(nèi)離子平衡等耐鹽機(jī)制有關(guān)[31]。其中SJ-4、SJ-11菌株的OD600nm明顯高于其他菌株。

圖2 菌株對(duì)150 mg/kg NaNO2耐受性Fig.2 Tolerance of strains to 150 mg/kg of NaNO2

2.2.3 菌株耐酸性

肉用發(fā)酵劑菌株除需具備耐鹽、耐亞硝酸鹽特性外，還需在pH 5.0條件下有一定耐受力[32]。由圖3可知，pH 5.0下16 株菌均能生長(zhǎng)，SJ-4菌株OD600nm顯著高于其他菌株（P＜0.05）。乳酸菌的耐酸機(jī)制現(xiàn)多傾向于質(zhì)子泵理論[33]，即在較低pH值環(huán)境下，菌株通過質(zhì)子原動(dòng)力透性酶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)提高細(xì)胞內(nèi)堿性，防止低pH值環(huán)境引起的代謝紊亂。

圖3 菌株對(duì)pH 5.0耐受性Fig.3 Tolerance of strains to pH 5.0

2.2.4 菌株發(fā)酵特性及生理生化鑒定

發(fā)酵肉制品中低含量的生物胺對(duì)健康影響較小，但攝入較高含量的生物胺可能造成頭痛、呼吸紊亂甚至死亡[34]。有研究表明添加植物乳桿菌能降低肉制品發(fā)酵過程中生物胺含量[35-36]。因此菌株需無氨基酸脫羧酶活性，且不產(chǎn)NH3、H2S、H2O2等有害氣體，不產(chǎn)黏性、石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)陽性、甲基紅實(shí)驗(yàn)陰性、V-P實(shí)驗(yàn)陰性。由表2可知，初篩的16 株菌均滿足上述要求。

表2 菌株發(fā)酵特性與生理生化鑒定Table 2 Fermentation characteristics and physiological and biochemical identification of strains

乳酸菌中能夠降解蛋白質(zhì)的菌屬較少，部分植物乳桿菌具有降解蛋白質(zhì)的能力，發(fā)酵過程中乳酸菌降低pH值促進(jìn)纖維蛋白凝固，提高終產(chǎn)品硬度、黏度，利于切片。脂類是發(fā)酵肉制品風(fēng)味前體，脂類氧化產(chǎn)物對(duì)發(fā)酵肉制品風(fēng)味的形成具有重要作用[37]。然而，過氧化反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致肉類風(fēng)味劣變[38]，因此，為控制肉制品的脂質(zhì)氧化，有必要篩選不產(chǎn)生脂肪降解圈的菌株，以避免發(fā)酵過程中脂肪分解。由表2可知，所有菌株均不分解脂肪，SJ-4、SJ-8、SJ-17分解蛋白質(zhì)能較強(qiáng)。

根據(jù)蛋白質(zhì)降解、生理生化特性、生產(chǎn)適應(yīng)性、安全性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，菌株SJ-4適合高鹽和亞硝酸鹽環(huán)境生長(zhǎng)，可作為發(fā)酵劑潛在菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 菌株SJ-4最適生長(zhǎng)條件及生長(zhǎng)曲線、產(chǎn)酸曲線

由圖4A可知，在20～45 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度上升菌株SJ-4 OD600nm先增加后減小，其最適溫度為37 ℃，此時(shí)OD600nm為1.584。在47 ℃時(shí)，因高于乳酸菌最適生長(zhǎng)溫度范圍30～45 ℃，OD600nm迅速下降，菌株代謝活動(dòng)受抑制并喪失活性。

圖4 菌株SJ-4最適溫度（A）、最適pH值（B）及生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線（C）Fig.4 Optimal temperature (A) and pH (B), growth curve and acid production curve (C) of strain SJ-4

由圖4B可知，菌株SJ-4最適pH值為6.0～7.0，培養(yǎng)12 h SJ-4在不同pH值下活力均較高，相同pH值下，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，OD600nm總體降低，表明環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)比例失調(diào)，菌株生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期，對(duì)外界不良環(huán)境敏感。在pH 6.0下培養(yǎng)24 h的OD600nm最高，為1.611。在較高和較低pH值下菌株SJ-4 OD600nm均較低，可能是偏酸或偏堿環(huán)境影響細(xì)胞內(nèi)外電荷平衡，細(xì)胞膜通透性改變，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)難以進(jìn)入細(xì)胞，嚴(yán)重影響菌株的生長(zhǎng)代謝[39]。

由圖4C可知，菌株SJ-4在0～4 h內(nèi)增長(zhǎng)緩慢，此時(shí)處于延滯期，細(xì)胞合成代謝活躍，核糖體、酶類和ATP的合成速度加快。SJ-4延滯期較短，6～10 h進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，此時(shí)細(xì)胞平衡生長(zhǎng)，分裂時(shí)間最短，酶系活躍、代謝旺盛。在培養(yǎng)10 h時(shí)，菌株OD值為1.515，達(dá)到較高菌體活性。此后隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡、有害產(chǎn)物積累或環(huán)境條件失調(diào)，菌株SJ-4進(jìn)入穩(wěn)定期，生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞處于正生負(fù)生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)平衡中。

酸度是衡量菌株發(fā)酵產(chǎn)酸能力的重要指標(biāo)[40]。由產(chǎn)酸曲線可知，10 h內(nèi)菌株SJ-4 pH值由5.98降到4.08，產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，此后pH值下降緩慢，在培養(yǎng)18 h時(shí)pH值降到3.80，已達(dá)到作為肉品發(fā)酵劑產(chǎn)酸的條件，培養(yǎng)到22 h，最低pH值可達(dá)3.73。較快的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸速率有利于菌株在發(fā)酵肉制品中快速生長(zhǎng)產(chǎn)酸，從而抑制其他腐敗微生物的繁殖[27]。

2.4 菌株SJ-4形態(tài)及16S rDNA分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

如圖5A所示，SJ-4在MRS培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)48 h，菌落呈白色、圓形，表面濕潤(rùn)不透明，邊緣整齊；將菌株SJ-4革蘭氏染色后置于顯微鏡100 倍油鏡下觀察，如圖5B所示，細(xì)菌呈桿狀，寬0.6～0.7 μm、長(zhǎng)1.0～3.2 μm，單個(gè)或成對(duì)排列，革蘭氏陽性。

圖5 菌株SJ-4菌落形態(tài)（A）與油鏡檢測(cè)結(jié)果（×100）（B）Fig.5 Colony morphology (A) and microscopic examination (× 100) (B) of strain SJ-4

SJ-4經(jīng)16S rDNA測(cè)序后進(jìn)入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST系統(tǒng)進(jìn)行同源性比對(duì)，使用MEGA-X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖6所示。分離株SJ-4與植物乳桿菌親緣關(guān)系最近，這與形態(tài)、生理生化、發(fā)酵特性結(jié)果鑒定一致，故SJ-4可判斷為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。將菌株送至中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心CICC保藏，菌株編號(hào)CICC No.11119s。

圖6 菌株SJ-4 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain SJ-4 based on 16S rDNA sequences

2.5 植物乳桿菌SJ-4對(duì)發(fā)酵里脊火腿色澤及質(zhì)構(gòu)的影響

由表3可知，經(jīng)SJ-4發(fā)酵后，接種組L*大于自然發(fā)酵組，但無顯著差異（P＞0.05），這是由于植物乳桿菌酸化使肌絲晶格收縮，改變光反射并增加亮度。a*、b*、E*差異顯著（P＜0.05），使用SJ-4發(fā)酵后，火腿E*顯著高于對(duì)照組，能較好保持火腿色度，這與徐玉寧等[41]的研究結(jié)果一致。乳酸菌代謝產(chǎn)物將亞硝酸鹽還原生成一氧化氮，與肌紅蛋白結(jié)合成亞硝基肌紅蛋白，有助于火腿發(fā)色[42]。

表3 菌株SJ-4對(duì)發(fā)酵里脊火腿色澤及質(zhì)構(gòu)的影響Table 3 Effect of strain SJ-4 on color and texture of fermented loin ham

兩組發(fā)酵里脊火腿樣品的彈性、咀嚼性無顯著差異（P＞0.05），硬度、黏聚性差異極顯著（P＜0.01）。乳酸菌產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，火腿pH值下降，加速了肉類蛋白變性和膠凝，且腌制過程中水分流失使火腿硬度增加，有利于火腿的切片。

2.6 植物乳桿菌SJ-4對(duì)發(fā)酵里脊火腿電子舌響應(yīng)值的影響

由圖7可知，PC1和PC2累計(jì)貢獻(xiàn)率為88.4%，可以代表樣品味覺的主要特征。實(shí)驗(yàn)組在酸味、收斂性、豐富度、苦味的貢獻(xiàn)率高于對(duì)照組，可以區(qū)分兩組樣品，這是由于植物乳桿菌SJ-4發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物賦予產(chǎn)品獨(dú)特口感和風(fēng)味。雖然苦味貢獻(xiàn)較高，但味覺強(qiáng)度與閾值相關(guān)[43]，且適當(dāng)苦味對(duì)火腿風(fēng)味有益[44]。對(duì)照組在咸味、鮮味的貢獻(xiàn)率較高，這可能是乳酸菌發(fā)酵一定程度上降低了實(shí)驗(yàn)組咸味感知，使對(duì)照組咸味較為明顯，且腌制料賦予發(fā)酵里脊火腿一定鮮味。該結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組樣品味覺強(qiáng)度整體優(yōu)于對(duì)照組，乳酸菌發(fā)酵有利于發(fā)酵里脊火腿滋味的形成。

圖7 發(fā)酵里脊火腿味覺值主成分雙標(biāo)圖Fig.7 Principal component analysis biplot of taste values of fermented loin ham

2.7 植物乳桿菌SJ-4對(duì)發(fā)酵里脊火腿風(fēng)味的影響

由表4可知，兩組樣品共鑒定出70種揮發(fā)性成分，其中酯類13種、醇類11種、烯烴22種、芳香烴4種、醛類6種、酮類5種、酸類2種、其他類7種。

表4 植物乳桿菌SJ-4發(fā)酵里脊火腿風(fēng)味物質(zhì)分析Table 4 Analysis of flavor substances in fermented loin hams with Lactobacillus plantarum SJ-4

續(xù)表4

發(fā)酵火腿風(fēng)味成分中烯烴含量較多。烯烴是脂肪酸烷氧基均裂的產(chǎn)物[45]，一般認(rèn)為烴類物質(zhì)對(duì)火腿風(fēng)味的貢獻(xiàn)不大[46]。檸檬烯被認(rèn)為是金華火腿中的主要風(fēng)味化合物，賦予火腿甜味或檸檬香味[47]。在植物乳桿菌SJ-4作用下，火腿中芳香族化合物含量增加，芳香烴是美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，雖含量較少，但其風(fēng)味閾值低，與烯烴相比，芳香烴對(duì)火腿風(fēng)味更為重要，賦予火腿熟肉風(fēng)味。

醛類是脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，具有脂肪香味，對(duì)肉類風(fēng)味形成有重要影響?；鹜戎械木€性醛、烯醛和二醛來源于不飽和脂肪酸氧化形成的過氧化物的裂解；支鏈醛類主要來源于氨基酸的氧化脫氨和脫羧。經(jīng)植物乳桿菌SJ-4發(fā)酵后壬醛、辛醛等直鏈醛含量增加，其風(fēng)味閾值較低，呈花香、果香，對(duì)火腿風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[48]。

接種發(fā)酵后醇類物質(zhì)含量增高，乙醇含量約占醇類總含量的34.4%，可能是植物乳桿菌SJ-4發(fā)酵過程中產(chǎn)生乙醇等次級(jí)代謝產(chǎn)物，同時(shí)代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸促進(jìn)脂肪氧化生成醛、烴、醇和酮類化合物[49]。醇類化合物具有較高的氣味閾值，多呈脂肪、木質(zhì)和草本味，但對(duì)火腿風(fēng)味貢獻(xiàn)較小。

酮類化合物通常與奶油、水果和烹飪等風(fēng)味特征有關(guān)。植物乳桿菌SJ-4發(fā)酵后，由美拉德反應(yīng)生成的3-羥基-2-丁酮含量高于對(duì)照組。3-羥基-2-丁酮是二乙酰前體，而二乙酰也可能是2-乳酸乙酯脫羧的副產(chǎn)物[50]，有研究認(rèn)為2-酮類化合物有助于促進(jìn)肉類風(fēng)味的形成[51]。

經(jīng)植物乳桿菌SJ-4發(fā)酵后在火腿中檢出乙酸。乙酸是干腌火腿中檢出含量最豐富的酸，酸類可以調(diào)節(jié)堿性化合物對(duì)火腿風(fēng)味的不利影響。

酯類是醇類與游離脂肪酸的反應(yīng)產(chǎn)物，主要通過微生物作用形成。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組酯類總含量相同。有研究在成熟干腌火腿中發(fā)現(xiàn)低閾值酯類化合物，其來源于羧酸和醇的酯化作用[52]，可能賦予火腿一定水果香氣。

3 結(jié) 論

以貴式發(fā)酵肉制品為原料，通過蛋白降解能力、產(chǎn)酸和產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株進(jìn)行初篩，對(duì)菌株安全性、生產(chǎn)適應(yīng)性、肉用發(fā)酵劑潛力、生理生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行復(fù)篩，得到1 株乳酸菌，經(jīng)16S rDNA測(cè)序后鑒定為植物乳桿菌SJ-4。

SJ-4可降解蛋白質(zhì)和促進(jìn)產(chǎn)品風(fēng)味的形成，對(duì)6 g/100 mL NaCl、150 mg/kg NaNO2有一定耐受力，不產(chǎn)NH3、H2S、H2O2，無氨基酸脫羧酶活性和分解脂肪能力，最適溫度37 ℃，最適pH 6.0。在MRS液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)18 h可使pH值由5.98降至3.80，達(dá)到肉制品發(fā)酵劑條件，有較好的生長(zhǎng)能力和產(chǎn)酸能力。

將植物乳桿菌SJ-4應(yīng)用于發(fā)酵里脊火腿，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組火腿的a*、b*、E*與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），但L*無顯著差異，SJ-4發(fā)酵促進(jìn)了火腿色澤的形成和穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)組火腿硬度、黏聚性與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），表明SJ-4接種有利于提高火腿的切片性；SJ-4接種后火腿滋味更豐富，醛類等特征風(fēng)味含量增高，改善了產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)。