環(huán)境因子對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)不同輪次釀造環(huán)境細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響

王 琳，胡小霞，黃永光*

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025）

作為中國傳統(tǒng)白酒的典型代表之一，醬香型白酒產(chǎn)量雖然只占中國白酒的3%左右，但利潤卻占了中國白酒行業(yè)的40%以上[1-2]。醬香型白酒發(fā)酵主要分為3個(gè)典型固態(tài)發(fā)酵階段，即大曲制備、堆積發(fā)酵和入池發(fā)酵[3-4]，其中大曲制備和堆積發(fā)酵會(huì)網(wǎng)羅釀造環(huán)境中的微生物菌群，說明釀造環(huán)境中必然存在與發(fā)酵相關(guān)的微生物[5]。王歡等[6]在醬香型白酒機(jī)械化釀造7個(gè)輪次堆積發(fā)酵酒醅中檢測(cè)出14個(gè)門、456個(gè)屬，Kroppenstedtia、Acinetobacter、Caulobacter、Bacillus和Lactobacillus等12個(gè)為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。吳徐建[7]利用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法研究了醬香型白酒2～7輪次環(huán)境、大曲及酒醅中的酵母和細(xì)菌多樣性，結(jié)果表明，Zygosaccharomyces bailii、Saccharomyces cerevisiae、Bacillus licheniformis和Bacillus amyloliquefaciens是堆積發(fā)酵過程中最主要的酵母與細(xì)菌種屬，其還驗(yàn)證了堆積酒醅中的細(xì)菌主要來源于大曲，而酵母主要來自于堆積發(fā)酵的地面。Wang Xuanshan等[8]運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)與Source Tracker方法相結(jié)合，研究了釀造環(huán)境微生物對(duì)白酒發(fā)酵過程的貢獻(xiàn)，結(jié)果表明環(huán)境微生物是發(fā)酵微生物的重要來源，而且環(huán)境微生物可以驅(qū)動(dòng)白酒發(fā)酵生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。Pang Xiaona等[9]研究了環(huán)境微生物菌群對(duì)清香型白酒釀造微生物的影響，發(fā)現(xiàn)酒醅中的Lactobacillus acetotolerans主要來源于空氣。龐曉娜[10]對(duì)比分析了不同時(shí)期釀造環(huán)境與大曲微生物的多樣性，結(jié)果表明大曲和空氣中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)比較相似；并應(yīng)用Source Tracker對(duì)不同時(shí)期發(fā)酵過程的細(xì)菌來源進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)車間和地缸表面為清香型白酒發(fā)酵提供了重要的微生物來源。上述文獻(xiàn)均表明參與釀造過程的微生物與釀造環(huán)境微生物關(guān)聯(lián)非常密切，而且釀造環(huán)境中微生物之間存在相互作用，這些微生物在長期自然馴化過程中借助復(fù)雜的微生物相互作用實(shí)現(xiàn)了功能定向進(jìn)化[11]。

微生物的生長、繁殖、衰亡與其生存的環(huán)境密切相關(guān)，受環(huán)境因子的影響較大[10,12-13]。研究表明茅臺(tái)地區(qū)赤水河水體[14]和茅臺(tái)鎮(zhèn)空氣[15]夏季樣品中的微生物多樣性相對(duì)其他3個(gè)季節(jié)更加豐富，說明該地區(qū)夏季的氣候條件更適合微生物生長繁殖。王鵬等[16]利用冗余分析和蒙特卡洛置換檢驗(yàn)研究環(huán)境因子對(duì)中國白酒發(fā)酵過程中核心微生物群的影響，結(jié)果表明水分含量、溫度等環(huán)境因素對(duì)核心微生物菌群影響較大。杜海[17]通過考察白酒釀造特定環(huán)境因子，如水分、溫度和pH值等環(huán)境因子對(duì)產(chǎn)土味素菌株的影響，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)土味素的鏈霉菌在含水量50%的釀造基質(zhì)、溫度30 ℃、中性偏堿性的環(huán)境中可大量繁殖。陳雪等[18]分析了鳳香型白酒發(fā)酵酒醅微生物多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)溫度與細(xì)菌多樣性呈極顯著負(fù)相關(guān)。由此可見，環(huán)境因子直接影響了釀造環(huán)境微生物的生長繁殖，對(duì)白酒釀造過程中的微生物菌群存在直接或間接作用，從而導(dǎo)致白酒風(fēng)味的差異。因此，研究環(huán)境因子與環(huán)境微生物的相關(guān)性對(duì)于了解環(huán)境因子對(duì)白酒產(chǎn)區(qū)的形成、功能影響具有重要意義。

為揭示茅臺(tái)鎮(zhèn)1～7輪次釀造環(huán)境中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性及環(huán)境因子對(duì)其影響，本研究以茅臺(tái)鎮(zhèn)釀造環(huán)境中細(xì)菌群落為研究對(duì)象，通過高通量測(cè)序技術(shù)與數(shù)理統(tǒng)計(jì)結(jié)合研究釀造環(huán)境樣本中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)組成、分布和環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)性，旨在解析環(huán)境因子與釀造環(huán)境優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落的相關(guān)性，為茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒釀造環(huán)境微生態(tài)結(jié)構(gòu)、資源價(jià)值評(píng)價(jià)、產(chǎn)業(yè)發(fā)展等研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)理論及科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

樣品采自貴州省仁懷市茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒釀造區(qū)域的17個(gè)代表性釀酒企業(yè)（分布于7個(gè)主要釀酒區(qū)域，簡稱7個(gè)主釀區(qū)）周邊的釀造環(huán)境[19]。環(huán)境樣品采集涵蓋采樣釀造企業(yè)周邊200 m內(nèi)范圍的生產(chǎn)車間晾堂、產(chǎn)房墻角地面土塵、灰塵，車間窗戶玻璃、窗臺(tái)、墻體表面的灰塵、粉塵等。取樣時(shí)間為2018年1ü9月，茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒釀造1～7輪次的堆積發(fā)酵期，每輪次對(duì)釀造環(huán)境進(jìn)行3～5 d采樣。每個(gè)采樣企業(yè)的樣品采集均固定在同一采樣點(diǎn)。從17個(gè)釀造企業(yè)釀造環(huán)境中共采集119個(gè)環(huán)境樣品，按照區(qū)域劃分將從每個(gè)酒廠采集的樣品采用等量混合為該區(qū)域的綜合樣，7個(gè)輪次共計(jì)49個(gè)環(huán)境區(qū)域的最終混合樣品，每輪次采集樣品取完后及時(shí)轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱密封保存。

1.1.2 試劑

E.Z.N.A.Soil DNA Kit 美國Omega BioTek公司；rTaqDNA聚合酶試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA Marker 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、引物合成 上海生物工程股份有限公司；異丙醇（分析純） 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；TEA緩沖液、Gengreen染料 上海賽百盛有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；G154DW高壓蒸汽滅菌鍋 廈門致徽儀器有限公司；GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國ABI公司；DYY-8C電泳儀 北京六一儀器廠；JS-680C凝膠成像儀 上海培清科技有限公司；MiSeq測(cè)序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品總DNA提取

參考文獻(xiàn)[19]報(bào)道的方法，主要步驟為：1）取每個(gè)混勻的最終樣品各20 g于100 mL離心管中，加入35 mL滅菌后的0.1 mol/L PBS懸浮和3～5 顆玻璃珠，充分振蕩7 min，400 r/min離心5 min，吸取上清液；2）沉淀用PBS洗滌，漩渦振蕩4 min，400 r/min離心5 min，收集上清液；3）重復(fù)上一步操作共收集40～50 mL上清液，配平后于12 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集細(xì)胞沉淀。預(yù)處理后每個(gè)樣品的總DNA提取步驟參考E.Z.N.A.Soil DNA Kit的操作說明書。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

細(xì)菌PCR擴(kuò)增引物：338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和 806R（5’-GGACTACHVGG GTWTCTAAT-3’）。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增體系（20 μL）：4 μL 5hFastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL引物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu聚合酶，10 ng DNA 模板。

1.3.3 Illumina MiSeq測(cè)序

利用Illumina公司的MiSeq PE 300平臺(tái)，分別對(duì)細(xì)菌V3-V4高變區(qū)序列進(jìn)行測(cè)序分析（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.3.4 環(huán)境因子

貴州省氣象局檢測(cè)提供每輪次采樣期及其前后3 d的環(huán)境因子值，包括環(huán)境溫度、空氣濕度、降雨量、光照時(shí)長和大氣壓。

1.4 數(shù)據(jù)及圖像處理

采用Microsoft Office Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和分析?；贗llumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)，利用IBM SPSS Statistics 26.0進(jìn)行Student’st-檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)性分析；Origin 2017和TB-tools繪制箱線圖、豐度圖和Heatmap圖等。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性分析

通過α多樣性分析可以得到群落中物種的豐富度、覆蓋度和多樣性等信息，常用的度量標(biāo)準(zhǔn)有Shannon指數(shù)、Chao指數(shù)、ACE指數(shù)和覆蓋率。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)Student’st-檢驗(yàn)方法分析不同輪次釀造環(huán)境樣本之間的指數(shù)值是否具有顯著差異。本研究茅臺(tái)鎮(zhèn)不同輪次釀造環(huán)境樣本的菌群多樣性指數(shù)顯著性分析（可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）水平）見圖1。

圖1 各環(huán)境樣品細(xì)菌菌群多樣性指數(shù)及其顯著性分析（OTU 水平）Fig.1 Diversity index and significance analysis of bacterial communities in environmental samples (OTU Level)

從圖1可看出，7個(gè)輪次的釀造環(huán)境樣品之間的差異顯著性較小。從圖1A、B可知各個(gè)輪次的Shannon指數(shù)和ACE指數(shù)相差不大，Shannon指數(shù)和ACE指數(shù)表明，1、4、5、6輪次釀造環(huán)境的細(xì)菌多樣性和豐富度明顯高于其他輪次，該結(jié)果表明這4個(gè)輪次期間（1月、5月、6月和7月）的環(huán)境氣候條件適宜于細(xì)菌生長[19]。Chao指數(shù)主要衡量樣本的物種豐富度信息，其值越大群落豐度越高（圖1C）。經(jīng)t-檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，7輪次與6輪次差異極顯著（P＜0.01，n=49），與4輪次有差異（P＜0.05，n=49）。覆蓋率主要用于衡量測(cè)序深度（圖1D），各輪次釀造環(huán)境的覆蓋率均大于0.99，說明該信息足以揭示釀造環(huán)境樣品中大多數(shù)樣本的細(xì)菌菌群?；赟hannon指數(shù)、ACE指數(shù)和覆蓋率經(jīng)t-檢驗(yàn)，6輪次與7輪次有差異（P＜0.05，n=49）。

通過α多樣性分析結(jié)合t-檢驗(yàn)進(jìn)一步分析茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒不同輪次釀造環(huán)境中的物種豐富度和差異顯著性。結(jié)果表明，茅臺(tái)鎮(zhèn)7個(gè)輪次釀造環(huán)境的細(xì)菌多樣性豐富度高，且只有7輪次與4輪次和6輪次環(huán)境細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性和物種多樣性存在差異，其他輪次釀造環(huán)境中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)具有明顯的相對(duì)穩(wěn)定性特征。

2.2 α多樣性與環(huán)境因子的關(guān)系

為揭示茅臺(tái)鎮(zhèn)釀造環(huán)境中的微生物多樣性與環(huán)境因子間的相關(guān)性，利用SPSS Statistics 26.0進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析[20]。從圖2可看出，Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao指數(shù)和覆蓋率與降雨量相關(guān)性較弱，但與其余4個(gè)環(huán)境因子相關(guān)性強(qiáng)，其中Shannon指數(shù)與環(huán)境溫度和光照時(shí)長相關(guān)性顯著；ACE指數(shù)和Chao指數(shù)與環(huán)境溫度和濕度顯著相關(guān)；覆蓋率與環(huán)境溫度、濕度和大氣壓存在顯著相關(guān)性。同樣，從輪次角度分析發(fā)現(xiàn)，4個(gè)指數(shù)在6輪次釀造環(huán)境樣本中均與5個(gè)環(huán)境因子具有較弱的相關(guān)性，而其他輪次與1種或多種環(huán)境因子存在顯著相關(guān)。例如，在1輪次中Shannon指數(shù)與光照時(shí)長呈顯著負(fù)相關(guān)，在7輪次中Chao指數(shù)與溫度和濕度呈顯著正相關(guān)，而在2輪次中ACE指數(shù)與濕度顯著負(fù)相關(guān)，Chao指數(shù)和覆蓋率與溫度、濕度和大氣壓具有顯著正相關(guān)。綜上結(jié)果表明，不同輪次的環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌菌群多樣性存在一定調(diào)控，細(xì)菌α多樣性在一定程度上與氣候條件因子相關(guān)，而且各輪次的相關(guān)程度存在差異，對(duì)細(xì)菌菌群的顯著影響主要在2輪次和3輪次。

圖2 細(xì)菌α多樣性指數(shù)與環(huán)境因子的Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)的熱圖Fig.2 Heatmaps of Spearman’s rank correlation coefficients of bacterial α-diversity metrics with environmental factors

2.3 細(xì)菌物種與菌群結(jié)構(gòu)分析

如圖3A所示，從茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒1～7輪次釀造環(huán)境依次檢出27、28、29、30、28、31個(gè)和26個(gè)細(xì)菌綱，共檢出33個(gè)綱類。從微生物的含量豐度高低看，其中Gammaproteobacteria（平均相對(duì)豐度為36.09%）在所有樣本中的含量最為豐富，且在7輪次樣本中占比最高，達(dá)到了59.15%，在3輪次中占比最低（19.78%）。第2豐富的優(yōu)勢(shì)菌綱為Bacilli（25.40%），其在1～6輪次釀造環(huán)境樣本中相對(duì)豐度較穩(wěn)定，為20.70%～32.10%，但在7輪次的相對(duì)豐度僅7.33%。第3優(yōu)勢(shì)細(xì)菌綱為Sphingobacteriia（15.79%），第4優(yōu)勢(shì)菌綱為Alphaproteobacteria（7.05%），第5優(yōu)勢(shì)菌綱為Actinobacteria（6.92%）。其他優(yōu)勢(shì)細(xì)菌綱分別為Flavobacteriia（5.35%）、Betaproteobacteria（2.08%）、Bacteroidia（0.42%）、norank_p_Saccharibacteria（0.28%）、Cytophagia（0.19%）和Clostridia（0.11%）。除了前述11個(gè)優(yōu)勢(shì)綱外，其余22個(gè)相對(duì)豐度＜0.10%的綱出現(xiàn)在“others”中，包括Deinococci（0.08%）、Cyanobacteria（0.03%）、Chlamydiae（0.03%）、Verrucomicrobiae（0.03%）、Deltaproteobacteria（0.02%）等。結(jié)果表明，茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒釀造環(huán)境不同輪次間的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌綱基本一致，其中Gammaproteobacteria、Bacilli、Sphingobacteriia、Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Flavobacteriia和Actinobacteria為釀造環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌綱。進(jìn)一步說明茅臺(tái)鎮(zhèn)釀造環(huán)境中的微生物具有一定的共性和穩(wěn)定性，這為茅臺(tái)鎮(zhèn)釀造產(chǎn)區(qū)的形成奠定了微生物生態(tài)基礎(chǔ)優(yōu)勢(shì)及其特征微生態(tài)結(jié)構(gòu)。Du Hai等[21]研究也發(fā)現(xiàn)制曲環(huán)境樣品中的5個(gè)綱（Bacilli、Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Actinobacteria和Sphingobacteriia）為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌綱，與本研究結(jié)果一致。其中，Bacilli和Gammaproteobacteria也是高溫大曲[22]和酒醅[23]中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌綱。Zuo Qiancheng等[22]比較了醬香型高溫大曲傳統(tǒng)制曲和機(jī)械化制曲中的細(xì)菌菌綱，發(fā)現(xiàn)Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Actinobacteria和Cyanobacteria的相對(duì)豐度在機(jī)械化高溫大曲發(fā)酵過程中顯著高于傳統(tǒng)制曲。

圖3 環(huán)境樣品在綱水平（A）、科水平（B）和屬水平（C）上的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)Fig.3 Bacterial community structure of environmental samples at class level (A), family level (B) and genus level (C)

如圖3B所示，在科水平上，不同輪次釀造環(huán)境中的細(xì)菌群落在數(shù)量及結(jié)構(gòu)分布上多樣性特征較明顯，從1～7輪次分別檢測(cè)出120、119、117、127、132、144個(gè)和119個(gè)科，共檢出153個(gè)科。第1優(yōu)勢(shì)細(xì)菌科為Enterobacteriaceae（平均相對(duì)豐度為24.86%），其在7輪次釀造環(huán)境樣本中含量最高（48.70%），3輪次含量最低（13.95%），Sphingobacteriaceae為第2優(yōu)勢(shì)科，其在7個(gè)輪次的相對(duì)豐度較穩(wěn)定，平均相對(duì)豐度為15.68%。第3優(yōu)勢(shì)科為Bacillaceae（平均相對(duì)豐度為9.59%），在2輪次最高，達(dá)到了18.03%，隨著生產(chǎn)輪次的進(jìn)行，其相對(duì)含量逐漸降低到1.03%。其他優(yōu)勢(shì)細(xì)菌科主要包括Flavobacteriaceae（5.35%）、Moraxellaceae（5.18%）、Pseudomonadaceae（3.86%）、Leuconostocaceae（3.41%）、Staphylococcaceae（3.29%）、Thermoactinomycetaceae（3.29%）、Acetobacteraceae（2.44%）、Planococcaceae（1.06%）、Lactobacillaceae（0.59%）和Enterococcaceae（0.27%）等，占各輪次釀造環(huán)境樣品細(xì)菌總科和的87.79%～93.09%。從圖3B還可知，2輪次釀造環(huán)境中的特有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌科（僅在1個(gè)輪次中的相對(duì)含量≥1%）包括Bacillales（1.19%）和Bacteroidales_S24-7_group（1.85%），Microbacteriaceae（1.56%）為3輪次特有優(yōu)勢(shì)科，Halomonadaceae（2.02%）為5輪次特有優(yōu)勢(shì)科，Brucellaceae（1.04%）是7輪次特有優(yōu)勢(shì)科，而1、4輪次和6輪次無特有優(yōu)勢(shì)科。本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lavobacteriaceae、Planococcaceae、Bacteroidales_S24-7_group、Microbacteriaceae和Brucellaceae是目前尚未在白酒釀造環(huán)境中被認(rèn)為是優(yōu)勢(shì)菌的微生物科類。Wang Li等[24]基于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)醬香型白酒發(fā)酵過程中的3個(gè)重要階段（制曲、堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵）的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)Bacillaceae、Lactobacillaceae、Leuconostocaceae和Enterococcaceae的相對(duì)含量大于15.84%，還在茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒釀造過程中檢出了Planococcaceae，而且在其他類型的白酒釀造過程中鮮少被報(bào)道過。推測(cè)此細(xì)菌極有可能來源于茅臺(tái)鎮(zhèn)釀造環(huán)境。由此可見，釀造環(huán)境中的微生物可能通過大曲制曲、堆積發(fā)酵遷徙進(jìn)入到釀造過程，為白酒釀造提供微生物來源。前述部分優(yōu)勢(shì)微生物也被證實(shí)為釀造過程的功能微生物，如Bacillaceae可以代謝C4化合物、吡嗪、揮發(fā)性酸、芳香族和酚類化合物，以增加醬香型白酒的特色香氣濃度[25]。Leuconostocaceae、Lactobacillaceae和Enterococcaceae為主要的乳酸菌科類，其功能可將乳糖轉(zhuǎn)化為乳酸，也是代謝醬香型白酒的主要風(fēng)味成分乙酸乙酯的重要微生物[24,26]。同樣，Li Xianran等[27]從清香型白酒發(fā)酵酒醅中檢出了15個(gè)細(xì)菌科，結(jié)果顯示，Lactobacillaceae、Bacillaceae和Staphylococcaceae為酒醅樣本中的優(yōu)勢(shì)菌科。Tian Ning等[28]基于宏基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)Lactobacillaceae、Enterobacteriaceae、Leuconostocaceae、Bacillaceae、Pseudomonadaceae和Acetobacteraceae等為十里香白酒大曲中的主要細(xì)菌科。李可[29]在濃香型白酒發(fā)酵黃水中發(fā)現(xiàn)Planococcaceae為可培養(yǎng)細(xì)菌菌群的優(yōu)勢(shì)菌科。

如圖3C所示，在釀造環(huán)境樣本中屬水平上共檢出396個(gè)屬[19]，平均相對(duì)豐度≥1.00%有22個(gè)，主要包括Sphingobacterium、Enterobacter、Pantoea、unclassified_f_Enterobacteriaceae、Acinetobacter、Oceanobacillus和Pseudomonas等。屬水平的結(jié)果表明，茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒各釀造輪次期間釀造環(huán)境中的細(xì)菌群落在屬水平上其種類非常豐富，為該釀造產(chǎn)區(qū)醬香白酒釀造提供給了豐富的微生物生態(tài)資源，進(jìn)一步為醬香白酒復(fù)雜風(fēng)味結(jié)構(gòu)形成奠定了基礎(chǔ)。

上述結(jié)果表明，在綱、科和屬水平上，不同輪次釀造環(huán)境樣本中的細(xì)菌菌群種類非常豐富，而且優(yōu)勢(shì)菌綱、優(yōu)勢(shì)菌科和優(yōu)勢(shì)菌屬在結(jié)構(gòu)組成上具有高度的一致性。說明茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒釀造環(huán)境中的主要細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)具有較高的相對(duì)穩(wěn)定性，也表征了茅臺(tái)鎮(zhèn)在釀造醬酒活動(dòng)過程中長期馴化環(huán)境微生物所形成固有的特征性菌群結(jié)構(gòu)，為釀酒微生態(tài)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化、穩(wěn)定性奠定了基礎(chǔ)。

2.4 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群與環(huán)境因子的關(guān)系

基于醬香型白酒釀造過程中的釀造微生物一部分來自于釀造環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)微生物，而且微生物也存在復(fù)雜的分類結(jié)構(gòu)，因此有必要篩選出綱、科和屬水平下的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌（平均相對(duì)豐度≥1.00%），研究其與環(huán)境因子之間的相關(guān)性（圖4）。從茅臺(tái)鎮(zhèn)1～7輪次釀造環(huán)境樣本中檢測(cè)出的細(xì)菌在綱、科和屬水平上篩選出了48種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類別，其中7種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌綱、19種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌科和22種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。統(tǒng)計(jì)分析表明，環(huán)境溫度與16種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌相關(guān)性顯著（10種呈正相關(guān)，6種負(fù)相關(guān)），主要是Alphaproteobacteria綱及其亞類群和Bacilli綱及其亞類群。Alphaproteobacteria綱及其亞類群與溫度呈顯著正相關(guān)，包括Alphaproteobacteria（ρ=0.350）、Acetobacteraceae（ρ=0.488）、Sphingomonadaceae（ρ=0.283）、Caulobacteraceae（ρ=0.290）和Brevundimonas（ρ=0.284）。Bacilli綱中的Bacillaceae（ρ=-0.489）、Lentibacillus（ρ=-0.598）、Bacillus（ρ=-0.387）、Oceanobacillus（ρ=-0.419）、Thermoactinomycetaceae（ρ=0.284）和Kroppenstedtia（ρ=-0.347）與溫度顯著負(fù)相關(guān)，而Planococcaceae（ρ=0.291）、Leuconostocaceae（ρ=0.384）、Weissella（ρ=0.394）與溫度顯著正相關(guān)。環(huán)境濕度與7種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌相關(guān)性顯著（5種呈正相關(guān)，2種呈負(fù)相關(guān)），其中Gammaproteobacteria（ρ=0.342）、Enterobacteriaceae（ρ=0.376）、Escherichia-Shigella（ρ=0.366）、Enterobacter（ρ=0.367）和Pantoea（ρ=0.347）與濕度呈顯著正相關(guān)，Rhodospirillales（ρ=-0.363）、Acetobacteraceae（ρ=-0.298）呈負(fù)相關(guān)。Acetobacteraceae（ρ=-0.298）和Actinobacteria（ρ=-0.359）與濕度顯著負(fù)相關(guān)。降雨量與10種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌相關(guān)性顯著（2種呈正相關(guān)，8種呈負(fù)相關(guān)），顯著負(fù)相關(guān)的菌主要是Bacilli綱的大多數(shù)亞類群，例如Bacillaceae（ρ=-0.393）、Lentibacillus（ρ=-0.450）、Thermoactinomycetaceae（ρ=-0.451）和Lactobacillaceae（ρ=-0.325）等。Cronobacter（ρ=0.312）、Alphaproteobacteria（ρ=0.278）與降雨量呈顯著正相關(guān)。光照時(shí)長與20種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌相關(guān)性顯著（15種呈正相關(guān)，5種呈負(fù)相關(guān)），其中顯著負(fù)相關(guān)的菌有Enterobacteriaceae（ρ=-0.401）、Escherichia-Shigella（ρ=-0.381）、Enterobacter（ρ=-0.333）、Pantoea（ρ=-0.349）和Lentibacillus（ρ=-0.341）；顯著正相關(guān)的菌主要是Bacilli綱及其亞類群和Actinobacteria綱及其亞類群，在Bacilli綱及其亞類群中主要是Planococcaceae（ρ=0.383）、Leuconostocaceae（ρ=0.390）、Weissella（ρ=0.425）、Carnobacteriaceae（ρ=0.367）等；Actinobacteria綱及其亞類群全部都與光照時(shí)長呈顯著正相關(guān)，包括Actinobacteria（ρ=0.418）、Micrococcaceae（ρ=0.323）、Kocuria（ρ=0.403）、Dermabacteraceae（ρ=0.453）、Brachybacterium（ρ=0.453）。大氣壓與5種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌相關(guān)性顯著（2種呈正相關(guān)，3種呈負(fù)相關(guān)），與大氣壓顯著負(fù)相關(guān)的菌群有Cronobacter（ρ=-0.314）、Pseudomonadaceae（ρ=-0.352）、Pseudomonas（ρ=0.313），與大氣壓呈顯著正相關(guān)的菌群有2個(gè)，分別是Lentibacillus（ρ=0.342）、Actinobacteria（ρ=0.418）。

圖4 綱、科、屬水平優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群的相對(duì)豐度（平均相對(duì)豐度≥1.00%）與環(huán)境因子之間的Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)的熱圖Fig.4 Heatmap of Spearman’s rank correlation coefficients between relative abundances of dominant bacterial classes, families and genera(average relative abundance ≥1.00%) and environmental factors

Bacillus和Weissella是白酒發(fā)酵過程中的主要功能細(xì)菌菌群，在多種香型白酒發(fā)酵過程中均有報(bào)道[30,23]。其中作為大曲重要核心細(xì)菌屬的Bacillus為關(guān)鍵的產(chǎn)酸和產(chǎn)香菌，可代謝4-甲基吡嗪、乙偶姻等白酒關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)[19]。Weissella為高、中、低溫大曲和小曲中的主要細(xì)菌之一，可代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸類，是發(fā)酵的啟動(dòng)劑[31]。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境溫度是影響B(tài)acillus[32]和Acetobacter[33]性能的重要原因之一，40 ℃條件下的Bacillus菌株比20 ℃條件下具有更多的高溫耐受性，代謝更多脂肪酸[32]，其能加快乙醇在體內(nèi)的代謝，降低白酒的醉度[34]。Wang Li等[24]發(fā)現(xiàn)Planococcaceae受氣候條件的調(diào)控較大，其可能通過產(chǎn)生其他次級(jí)代謝產(chǎn)物而影響白酒的質(zhì)量和風(fēng)味。本研究還發(fā)現(xiàn)該菌與環(huán)境溫度與光照時(shí)長正相關(guān)性顯著。

上述結(jié)果表明，環(huán)境因子與茅臺(tái)鎮(zhèn)釀造環(huán)境中大約73%的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落相關(guān)性顯著，其中環(huán)境溫度和光照時(shí)長對(duì)釀造環(huán)境中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)起決定性調(diào)控作用，其次是濕度和降雨量，大氣壓對(duì)環(huán)境微生物的影響最小。進(jìn)一步證明了茅臺(tái)鎮(zhèn)特有的氣候環(huán)境為參與醬香型白酒釀造的微生物菌群繁衍生息提供了適宜的條件，使釀造微生物得到了長期穩(wěn)定的繁殖、生長、富集。

3 結(jié) 論

基于高通量測(cè)序技術(shù)及數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析方法研究了茅臺(tái)鎮(zhèn)不同輪次釀造環(huán)境細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性及環(huán)境因子對(duì)其的影響，在綱水平上共檢出33個(gè)細(xì)菌綱類，其中Gammaproteobacteria、Bacilli、Sphingobacteriia、Alphaproteobacteria、Actinobacteria、Flavobacteriia和Betaproteobacteria為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌綱，在科水平上共檢出153個(gè)細(xì)菌科類，優(yōu)勢(shì)科有19個(gè)，包括Enterobacteriaceae、Sphingobacteriaceae、Bacillaceae、Flavobacteriaceae、Thermoactinomycetaceae、Planococcaceae等。其中Flavobacteriaceae、Planococcaceae、Bacteroidales_S24-7_group、Microbacteriaceae和Brucellaceae是目前尚未在白酒釀造環(huán)境中被認(rèn)為是優(yōu)勢(shì)菌的微生物科類。在釀造環(huán)境樣本中屬水平上一共檢出396個(gè)屬，平均相對(duì)豐度≥1.00%有22個(gè)，主要包括Sphingobacterium、Enterobacter、Pantoea、unclassified_f_Enterobacteriaceae、Acinetobacter、Oceanobacillus和Pseudomonas等。α多樣性分析結(jié)合t-檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒7個(gè)釀造輪次期釀造環(huán)境細(xì)菌多樣性極其豐富，且只有7輪次與4輪次和6輪次環(huán)境細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性和物種多樣性存在差異。細(xì)菌α多樣性與環(huán)境因子存在一定程度的相關(guān)性，2輪次和3輪次釀造環(huán)境中細(xì)菌群落與溫度和濕度的相關(guān)性較顯著。運(yùn)用Spearman相關(guān)性分析環(huán)境因子與釀造環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)綱、科、屬水平的48種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群中，有35種與一種或多種環(huán)境因子具有顯著相關(guān)性，其中Gammaproteobacteria綱及其亞類群和Bacilli綱及其亞類群與5個(gè)環(huán)境因子均有顯著相關(guān)性，特別是溫度、濕度和光照時(shí)長對(duì)這兩個(gè)綱類的影響較大，其中主要包括Escherichia-Shigella、Enterobacter、Pantoea、Lentibacillus、Bacillus和Oceanobacillus等。Alphaproteobacteria綱中，Acetobacteraceae、Sphingomonadaceae、Caulobacteraceae、Brevundimonas與環(huán)境溫度正相關(guān)顯著。Sphingobacteriia綱及其亞類群中的Sphingobacterium與溫度和降雨量的相關(guān)性較顯著。Actinobacteria綱的Micrococcaceae、Kocuria、Dermabacteraceae、Brachybacterium均與光照時(shí)長呈顯著正相關(guān)。Betaproteobacteria綱及其亞類群和Flavobacteriia綱的Flavobacterium和Chryseobacterium受環(huán)境因子的影響最小。

本研究對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)不同輪次釀造環(huán)境樣本的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)環(huán)境中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)更加了解，環(huán)境因子不僅調(diào)節(jié)細(xì)菌多樣性，還直接影響了細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)組成及其功能，特別是環(huán)境溫度和光照時(shí)長。為充分認(rèn)識(shí)釀造環(huán)境中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境因子之間的關(guān)系提供了基礎(chǔ)理論和學(xué)科依據(jù)。