基于非靶向代謝組學分析副干酪乳桿菌發(fā)酵枸杞汁各階段代謝差異

胡明珍，劉慧燕，潘 琳，王 彤，李旭陽，王艷萍，方海田*

（寧夏大學食品與葡萄酒學院，寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室，寧夏 銀川 750021）

寧夏枸杞（Lycium barbarumL.）是管狀花目茄科枸杞屬植物，耐寒及抗旱能力強，多生長于堿性沙質(zhì)土壤，在我國主要分布于中北部地區(qū)。且寧夏枸杞是唯一載入2010年版《中國藥典》的品種。其果實被稱為枸杞子，又名枸杞豆、枸杞子等，是藥食同源的植物資源[1-2]。枸杞果實中含有多種豐富的活性成分，具有降血糖、抗氧化、增強免疫力等作用[3-4]。由于枸杞本身并無特別突出的香味，以枸杞為原料生產(chǎn)的枸杞原漿風味欠佳，嚴重地影響了枸杞類飲品的生產(chǎn)和開發(fā)。

乳酸菌能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸[5]，可以通過對不同底物發(fā)酵而制作不同的發(fā)酵食品，如發(fā)酵乳制品、發(fā)酵肉制品、發(fā)酵蔬菜等[6]。相關研究表明，菌株在發(fā)酵過程中不僅能提高原料中不同營養(yǎng)物質(zhì)的含量，還可以改善發(fā)酵制品的風味[7]。副干酪乳桿菌是一種廣泛存在于發(fā)酵制品中的兼性厭氧微生物，有良好的調(diào)節(jié)腸道菌群[8]、抗氧化[9]和增強免疫力等功能[10]。用副干酪乳桿菌發(fā)酵果蔬產(chǎn)品，不僅能保留其原有的營養(yǎng)成分，還能提高有機酸、細菌素、多糖等多種活性成分的含量[11-12]。

代謝組學是基于不同生長環(huán)境、時期以及外界刺激下的生物樣品中有機酸等低分子質(zhì)量代謝產(chǎn)物為研究對象，通過高通量檢測和數(shù)據(jù)處理，進行信息整合及生物標記物鑒定的科學[13]，已被廣泛應用于食品研究中。張啟力等[14]基于植物代謝組學技術從整體化學組成上分析了青海產(chǎn)區(qū)枸杞子的化學特征。楊孟可等[15]針對人工接種枸杞癭螨，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術比對分析枸杞癭螨致癭后枸杞葉片初生和次生代謝產(chǎn)物的變化。對枸杞發(fā)酵產(chǎn)品的研究多關注于枸杞中揮發(fā)性成分及其香氣特征[16]，但運用代謝組學技術分析不同時期益生菌發(fā)酵枸杞代謝物組分及差異的報道很少。

本實驗以寧夏枸杞為原料，采用從傳統(tǒng)發(fā)酵漿水中分離出的1 株乳酸菌進行枸杞汁液態(tài)發(fā)酵，研究發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的變化。采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）非靶向代謝組學方法研究不同階段枸杞發(fā)酵液中的代謝組分，結合多元統(tǒng)計分析方法篩選差異代謝物，分析相關的代謝通路，旨在為植物發(fā)酵過程中化學物質(zhì)表征和功能成分研究提供有效研究策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧夏甲級枸杞干果為寧夏中寧市售（2020年）；MRS（De Man Rogosa Sharpe）肉湯培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；水、甲醇（均為色譜級） 美國Fisher Chemical公司；甲氧胺鹽酸鹽上海阿達瑪斯試劑有限公司；硅烷化試劑BSTFA（1%TMCS） 美國Regis Technologies公司；氯仿（色譜級） 上海沃凱化學試劑有限公司；D-異抗壞血酸鈉（食品級）、果膠酶、過硫酸鉀、乙醇、無水碳酸鈉（均為分析純） 銀川偉博鑫生物科技有限公司。

采集甘肅隴南地區(qū)農(nóng)家自然發(fā)酵漿水，通過純培養(yǎng)技術篩選樣品中的乳酸菌并保藏。由16S rDNA序列分析測定各菌株堿基序列，并與NCBI網(wǎng)站中的BLAST程序進行核酸序列的同源性比對，同源性均達到99%以上，確定分離菌種分別為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），并命名為副干酪乳桿菌NXU-19004，保藏于寧夏大學食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室。該菌株37 ℃培養(yǎng)14 h時達到穩(wěn)定期，活菌數(shù)達1.24h108CFU/mL，pH 2條件下存活率達（87.35f0.43）%，耐受0.5%牛膽鹽存活率達（65.68f2.86）%。

1.2 儀器與設備

BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司；LRH-250 生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；靜音真空高速破壁機 九陽股份有限公司；Wonbio-96c多樣品冷凍研磨儀 上海萬柏生物科技有限公司；NewClassic MS電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；高速冷凍離心機、手動單道移液器 德國Eppendorf公司；JXDC-20氮吹儀 上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；8890B-5977 GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司；恒溫振蕩器 上海葉拓儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化與擴大培養(yǎng)

將保存于脫脂乳中的5 株乳酸菌分別劃線接入MRS固體培養(yǎng)基上， 37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后取出。挑取1 環(huán)固體培養(yǎng)基上生長較好的單菌落接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后取出，并按照2%接種量（體積分數(shù)）將菌液接入液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)（37 ℃，24 h），在充分活化兩代后將菌液離心（4 ℃，3 000 r/min，5 min），傾去培養(yǎng)基，用無菌水洗滌沉淀2次后得到菌泥，再將其轉(zhuǎn)入無菌水中振蕩均勻，活菌數(shù)可達106CFU/mL以上，得到菌懸液放入4 ℃冰箱備用。

1.3.2 發(fā)酵枸杞汁的制備

挑選肉厚、無腐爛的寧夏枸杞干果，用流動水多次沖洗枸杞表皮，洗掉黏在枸杞表面的污垢后，以純水與枸杞干果5∶1（mL/g）加水，并加入0.05%的異抗壞血酸鈉護色后，室溫浸泡8～9 h。再加入0.15%的果膠酶后打漿，用3 層無菌紗布和漏斗過濾除籽。加入5%白砂糖后，添加10%的檸檬酸調(diào)pH值至4.5，分裝于玻璃瓶中，每瓶100 mL，用紗布球和報紙封口，在55 ℃條件下殺菌25 min后備用。將滅菌后的枸杞汁取出，冷卻后接入培養(yǎng)好的菌株，接種量為5%，靜置于37 ℃條件下發(fā)酵14 h，得到成品。

1.3.3 樣品制備與處理

以發(fā)酵后樣品中乳酸產(chǎn)量為評價指標，對接種副干酪乳桿菌NXU-19004的枸杞發(fā)酵液每間隔2 h進行取樣，分別選取滅菌后未接入菌液的枸杞汁、接菌發(fā)酵0 h、接菌發(fā)酵10 h和接菌發(fā)酵22 h的枸杞發(fā)酵液，共4 組待測樣本。同時制備了質(zhì)控樣品（由每個分析樣品各取部分混合而成），通過GC-MS聯(lián)用進行代謝組學分析。

發(fā)酵樣品前處理：取發(fā)酵液于10 mL離心管中，渦旋振蕩混勻后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。取1 000 μL樣品加入800 μL乙酸乙酯，渦旋30 s混勻后，冰水浴超聲萃取30 min。將樣品于-20 ℃靜置30 min，然后4 ℃、13 000hg離心15 min，取上清液，裝入1.5 mL離心管中；再加入700 μL乙酸乙酯重復萃取一次，合并兩次上清液氮氣吹干，加入200 μL乙酸乙酯復溶，渦旋2 min后，冰水浴超聲10 min，4 ℃、13 000hg離心10 min。取上清液至進樣小瓶中進行GC-MS代謝組學分析。

1.3.4 GC-MS分析

色譜條件：樣本用不分流模式注入GC-MS系統(tǒng)進行分析，進樣量1 μL。樣品經(jīng)Agilent 122-5532G DB-5MS毛細管柱（40 mh0.25 mm，0.25 μm）分離后進入質(zhì)譜檢測。進樣口溫度260 ℃，載氣為高純氦氣，載氣流速1 mL/min，隔墊吹掃流速3 mL/min，溶劑延遲5.5 min。升溫程序：初始溫度60 ℃，平衡0.5 min，然后以8 ℃/min的速度升至310 ℃，并維持6 min。

質(zhì)譜條件：電子電離源，傳輸線溫度310 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV。掃描方式為全掃描模式（SCAN），質(zhì)量掃描范圍m/z50～500，掃描頻率為3.2 scan/s。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有的GC-MS圖譜使用MassHunter workstation Quantitative Analysis（v10.0.707.0）軟件進行峰提取、對齊等數(shù)據(jù)預處理操作，并將得到的數(shù)據(jù)輸入ropls（Version1.6.2）軟件，使用R2和Q2進行主成分分析（principal components analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA），根據(jù)Studentt檢驗的P值小于0.05，同時PLS-DA模型PC的計算變量投影重要性分析值（variable importance in the projection，VIP）＞1，進行差異性代謝物的篩選。對篩選出的差異代謝集，通過關聯(lián)分析、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路數(shù)據(jù)庫通路分析、聚類分析等高級分析手段進行生物學信息挖掘。

2 結果與分析

2.1 不同階段枸杞發(fā)酵液代謝物PCA

采用PCA對優(yōu)化條件下，從未接菌枸杞汁、接菌發(fā)酵0 h、接菌發(fā)酵10 h和接菌發(fā)酵22 h的4個不同時間段的枸杞發(fā)酵液進行差異分析，從總體上反應了各組樣本之間的總體差異和組內(nèi)樣本之間的變異度大小。樣本通過降維分析后，在PC1、PC2上有相對坐標點，各個坐標點距離代表了樣本間聚集和離散程度；置信橢圓表示本組“真實”樣本在95%置信度下，分布在此區(qū)域內(nèi)；超過此區(qū)域可認為是可能異常樣本。如圖1所示，4 組發(fā)酵液樣品以及質(zhì)控樣品樣本組的平行樣本聚在一起，表明所有檢測具有良好的分析穩(wěn)定性和實驗重現(xiàn)性；同時，PC1和PC2貢獻率分別為53.80%和19.60%，兩者累計貢獻率達到73.40%，可見各時間內(nèi)枸杞發(fā)酵液之間分離趨勢較明顯，從整體上反映出這些樣品之間的代謝物差異。

圖1 不同階段枸杞發(fā)酵液樣本PCA模型得分圖Fig.1 PCA score plot of fermented goji juice samples at different fermentation times

2.2 不同階段枸杞發(fā)酵液代謝物PLS-DA

PLS-DA通過對PC適當旋轉(zhuǎn)，可以有效對組間觀察值進行區(qū)分，并且能夠找到導致組間區(qū)別的影響變量[17]。常用來直觀地展示模型的分類效果，圖中兩組樣品分離程度越大，說明分類效果越顯著。進一步采用PLS-DA對構建的模型進行驗證，4個時間點內(nèi)枸杞發(fā)酵液樣本PLS-DA得分圖和置換檢驗結果如圖2所示，其結果與PCA相似，正離子模式下所建模型對發(fā)酵液的累計判別解釋能力R2X=0.884，R2Y=0.985，對模型預測能力Q2=0.949，這3個指標越接近于1時表示模型越穩(wěn)定可靠，模型的擬合度較好。同時采用n=200的隨機置換檢驗（圖3），可見模型隨著置換保留度下降，R2和Q2下降，回歸線呈向上的趨勢，且位于最右邊的R2和Q2值均超過0.9，Q2回歸線的截距為-1.007 9，說明置換檢驗過關，模型不存在過擬合現(xiàn)象，具有很好的穩(wěn)定性和預測性，適合探索接種乳酸菌后枸杞汁發(fā)酵過程中的代謝物差異。

圖2 不同階段枸杞發(fā)酵液樣本PLS-DA得分圖Fig.2 PLS-DA score plot of goji juice fermented for different times

圖3 不同階段枸杞發(fā)酵液樣本置換檢驗圖Fig.3 Permutation test of giji juice fermented for different times

2.3 差異代謝物的篩選與分析

根據(jù)PLS-DA模型結果，將t檢驗P值小于0.05的代謝物作為篩選標準。結合METLIN、HMDB等在線數(shù)據(jù)庫通過化合物的精確m/z和保留時間進行代謝物的鑒定，結果如表1所示，從4個階段的枸杞發(fā)酵液中共篩選出14 大類63種差異代謝物，差異代謝物的種類由多到少為有機酸及其取代衍生物、氨基酸及其衍生物、羧酸及其衍生物、脂肪?；?、類黃酮、呋喃、咪唑嘧啶、吲哚及其衍生物、非金屬氧陰離子化合物、酚酸類、三萜類、吡啶及其衍生物等。

表1 不同階段枸杞發(fā)酵液中差異代謝物含量Table 1 Contents of differential metabolites in goji juice fermented for different times

有機酸類在枸杞發(fā)酵液中不僅具有呈香作用，同時也可在發(fā)酵過程中抑制雜菌。枸杞發(fā)酵液中的有機酸一部分來源于發(fā)酵前酸度調(diào)節(jié)，另一部分來源于乳酸菌發(fā)酵過程中微生物代謝產(chǎn)生。如苯甲酸和苯甲醛等可用作果汁飲料的定香劑和香料[18]，也可用以調(diào)和香精以及香料的制備。但也有一些產(chǎn)生不良風味的物質(zhì)，如硫氰酸芐酯[19]，從未接菌到接種乳酸菌發(fā)酵22 h過程中，其平均相對豐度隨時間的延長而降低，且在所有差異代謝物中含量最高。游離氨基酸是菌株代謝過程中生成的重要組分，一些游離氨基酸不僅具有生物活性[20]，還具有鮮、甜、苦、澀、酸等特殊滋味[21]。從4個階段枸杞發(fā)酵液中篩選出的氨基酸差異代謝物有脯氨酸、N-甲基丙氨酸、肌氨酸、丙氨酸，均屬于甜味氨基酸，在接種發(fā)酵過程中其平均相對豐度均呈上升趨勢，可改善枸杞經(jīng)乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的有機酸的酸味，對枸杞汁的發(fā)酵風味及感官品質(zhì)的形成具有重要貢獻。黃酮類化合物廣泛分布于豆科植物中，能帶給發(fā)酵產(chǎn)品愉快的香氣[22]，主要為3-羥基黃酮。差異代謝物中以角鯊烯為主的三萜類物質(zhì)不僅具有生理調(diào)控功能[23]，還具有防御功能[24]。

續(xù)表1

2.4 差異代謝物的聚類分析

代謝物分布可在視覺上分為上調(diào)和下調(diào)[25]。為了直觀觀察不同發(fā)酵階段差異代謝物的濃度變化趨勢，依據(jù)每個差異代謝物的相對含量作出熱圖（選取代謝物含量較高的前35個物質(zhì)），如圖4所示，根據(jù)上方樣本聚類的樹狀圖，可以分成兩個區(qū)域，發(fā)酵22 h的6個平行樣本為第1區(qū)域，未發(fā)酵、發(fā)酵0 h和發(fā)酵10 h為第2區(qū)域，可見發(fā)酵22 h后的代謝物顏色比其他3個階段深，而這3 組中發(fā)酵10 h后的代謝物豐度又遠超過其他兩組，可見兩個樣本分支離的越近，說明這兩個樣本所有代謝物的表達模式越接近，即代謝物表達量變化趨勢越接近。從最左圖中可以看出發(fā)酵組（FGJF_22h）高含量差異代謝物超過50%，明顯多于對照組（UFGJ2），其中發(fā)酵組中的有機酸及其取代衍生物、氨基酸及其衍生物含量均高于未發(fā)酵組，其他類代謝物在兩組中的含量差別不明顯。同時，在鑒定出的63種差異性代謝物中，煙酸、肌氨酸在發(fā)酵22 h后表達量低于未發(fā)酵的枸杞汁。煙酸是人體必需的13種維生素之一，參與人體的脂質(zhì)代謝、氧化過程和無氧分解過程[26]。肌氨酸在肌肉中以磷酸肌酸的形式存在，可促進ATP的合成[27]。其通過層次聚類分析可以看出，不同發(fā)酵階段對枸杞汁中各類代謝物的含量具有顯著影響，通過比較差異代謝物含量的異同，對鑒別經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后枸杞汁中的代謝產(chǎn)物具有一定的參考意義。

圖4 不同階段枸杞發(fā)酵液差異代謝物層次聚類熱圖Fig.4 Hierarchical clustering heat map of differential metabolites in goji juice fermented for different times

2.5 差異代謝物的代謝通路分析

植物在生長過程中是一個十分復雜的代謝過程，受多種物質(zhì)和反應共同調(diào)控[28]，并不能僅僅從某一種物質(zhì)含量的高低進行整體判斷，因此需進一步對其代謝通路進行分析。通過與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，可將基因按照參與通路或行使功能進行分類，可以獲知代謝物參與的代謝通路信息，從而評價其對生物新陳代謝過程的影響。4個不同階段的枸杞發(fā)酵液中共檢索到差異代謝物參與的47 條代謝通路，KEGG二級分類名稱分別為氨基酸代謝、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成、氧化磷酸化、聚糖生物合成與代謝、脂質(zhì)代謝、輔助因子和維生素的代謝、其他氨基酸代謝、萜類化合物和聚酮類化合物的代謝、外源生物降解與代謝、碳代謝等。

將上述篩選鑒定的差異代謝物匹配信息后，利用對應物種的通路數(shù)據(jù)庫對其進行富集分析和拓撲結構分析，根據(jù)代謝通路的濃縮，識別出可能的受生物擾動的代謝通路[29]。首先，對差異代謝物和通路進行相關性分析，得到多條相關代謝通路。再根據(jù)P值和Impact值綜合分析，篩選出最為顯著的具體關鍵代謝通路有9 條，結果如表2所示。針對枸杞益生菌發(fā)酵過程中差異組分進行KEGG富集分析，分析發(fā)酵階段對益生菌發(fā)酵枸杞過程中代謝通路分析的影響，結果以氣泡圖的形式展現(xiàn)（圖5）。氣泡代表KEGG代謝通路，氣泡所在橫坐標和氣泡大小表示影響值，氣泡越大，表示通路重要性越大；縱坐標和氣泡顏色表示富集分析的P值（取負常用對數(shù)，即-lgP），顏色越深P值越小，富集程度越顯著。由圖5可知，既有合成途徑也有降解途徑，其中丙氨酸代謝處的氣泡顏色最深、氣泡相對較大，說明隨著發(fā)酵時間的延長，對乳酸菌發(fā)酵枸杞代謝中氨基酸類物質(zhì)的影響最顯著。

表2 不同階段枸杞發(fā)酵液中代謝通路分析Table 2 Metabolic pathway analysis of goji juice fermented for different times

圖5 不同階段枸杞發(fā)酵液差異組分代謝通路影響因子圖Fig.5 Analysis of factors influencing the metabolic pathways of differential metabolites in goji juice fermented for different times

其次，通過KEGG等權威代謝物數(shù)據(jù)庫對差異代謝物進行映射，反映出具有極顯著差異的物質(zhì)有10個，分別為丙氨酸、檸檬烯、苯甲醛、苯甲酸、煙酰胺、煙酸、角鯊烯、脯氨酸、肌氨酸、2-苯基乙酰胺。為了更直觀地了解關鍵代謝物，使用箱形圖比較來自4個不同階段枸杞發(fā)酵液中這10種物質(zhì)的含量豐度差異（圖6）。其中丙氨酸、脯氨酸和肌氨酸主要參與氨基酸代謝，并且丙氨酸又參與氨酰tRNA生物合成途徑。氨基酸的代謝主要是由于菌株基于枸杞汁的代謝利用所導致，這些氨基酸為發(fā)酵枸杞汁提供了主要的風味。煙酰胺和煙酸主要參與輔助因子和維生素的代謝。而苯甲醛、苯甲酸主要為一些外源生物降解和代謝，二者同時參與氨基苯甲酸降解途徑和甲酸降解途徑，而苯甲酸又在苯丙氨酸代謝途徑中發(fā)揮作用；角鯊烯主要參與脂質(zhì)代謝，是一種無毒性的具有防病治病作用的海洋生物活性物質(zhì)，具有抗癌、抗腫瘤、抗氧化、減緩皮膚老化、增強機體免疫力等多種功效[30]；其他物質(zhì)主要參與其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成。同一代謝物同時參與了多條代謝通路，說明該差異代謝物對通路具有較大的影響。可見隨著發(fā)酵過程中營養(yǎng)物質(zhì)的減少以及pH值的下降，各級代謝趨于穩(wěn)定，代謝物也在不同的發(fā)酵時間之存在明顯差異。

圖6 不同階段枸杞發(fā)酵液中10種關鍵代謝物的相對豐度Fig.6 Relative abundance of 10 key metabolites in goji fermented for different times

3 結 論

基于GC-MS的非靶向代謝組學技術，從未發(fā)酵、接菌發(fā)酵0 h、接菌發(fā)酵10 h和接菌發(fā)酵22 h的4種枸杞發(fā)酵液中鑒定分析出63種差異代謝產(chǎn)物。通過對差異代謝物和通路進行相關性分析，篩選出了9 條最為顯著的關鍵代謝通路，映射出丙氨酸、脯氨酸、肌氨酸、2-苯基乙酰胺、檸檬烯、苯甲醛、苯甲酸、煙酰胺、煙酸、角鯊烯為關鍵代謝物。枸杞發(fā)酵液的差異代謝物中參與脂肪代謝途徑的有1種，參與輔助因子和維生素的代謝的有2種，參與外源生物降解和代謝的2種，而有參與氨基酸代謝的有3種，可見不同發(fā)酵階段可以調(diào)節(jié)枸杞中氨基酸類物質(zhì)的代謝，顯著影響枸杞發(fā)酵產(chǎn)品特殊風味物質(zhì)的形成。并且發(fā)現(xiàn)了具有增強機體免疫能力、抗衰老、抗腫瘤等多種生理功能的活性物質(zhì)角鯊烯。該模型的建立可以有效對發(fā)酵過程中氨基酸、有機酸、糖類等生物活性物質(zhì)含量變化進行區(qū)分，有助于探究外源添加物對枸杞的增效作用。同時為不同階段益生菌發(fā)酵產(chǎn)品建立了有效的評價方法，也為開發(fā)富含活菌和多種活性成分的枸杞發(fā)酵產(chǎn)品提供一定的理論參考。