1 株金黃色葡萄球菌烈性噬菌體的生物學(xué)特性及其裂解效果

侯忠余，李傳友，朱成林，于基成，唐俊妮,,*

（1.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；3.大連民族大學(xué) 生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，是一種常見的食源性和醫(yī)院感染的病原菌，會(huì)引起輕微皮膚損傷及嚴(yán)重感染，如肺炎、靜脈炎、腦膜炎、乳腺炎、泌尿道感染，以及深度感染，如骨髓炎和心內(nèi)膜炎[1]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillinresistantStaphylococcus aureus，MRSA）是金黃色葡萄球菌的一種，對(duì)半合成青霉素（甲氧西林、苯唑西林等）具有抗藥性[1]。自1961年首次分離發(fā)現(xiàn)后便在世界各地蔓延，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]。據(jù)報(bào)道，全球MRSA攜帶人數(shù)約200～5 300萬(wàn) 人[2]。中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)CHINET數(shù)據(jù)分析顯示，僅2019年期間，我國(guó)MRSA的平均檢出率高達(dá)31.40%。由此可見，MRSA感染已經(jīng)變得愈來(lái)愈常見[3-4]。食品工業(yè)生產(chǎn)中也存在檢出MRSA的案例，涉及的食物有雞肉[5]、豬肉[6]、牛奶[7]、魚肉[8]、即食食品[9]等。利用萬(wàn)古霉素可有效治療MRSA引起的感染，但是隨著細(xì)菌耐藥性日益嚴(yán)重，耐萬(wàn)古霉素的菌株也不斷被發(fā)現(xiàn)。因此，亟需探尋有效且不易引起細(xì)菌耐藥性的新型防控方法。

噬菌體是地球上數(shù)量可觀的一類生物體，具有特異性強(qiáng)、不易引起細(xì)菌抗性等特點(diǎn)[10]。近年來(lái)，由于細(xì)菌耐藥性日漸嚴(yán)重，噬菌體在抗菌方面的研究備受關(guān)注。金黃色葡萄球菌噬菌體不斷被分離出，其中已測(cè)序的金黃色葡萄球菌噬菌體就多達(dá)390余種[11]。Hsieh[12]和Kishor[13]等在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了金黃色葡萄球菌噬菌體的安全性；Curtin等[14]證實(shí)噬菌體可有效抑制細(xì)菌生物被膜；Alves等[15]研究也發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌噬菌體處理細(xì)菌被膜4 h后，被膜清除率為50%以上，處理48 h后生物被膜基本可除凈；阮紅日等[16]研究表明，在含金黃色葡萄球菌的脫脂牛乳中加入噬菌體，處理24 h后菌落數(shù)減少了5.42（lg（CFU/mL）），抗菌效果明顯；龍門等[17]研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌噬菌體JS25處理火腿后，在2 d內(nèi)金黃色葡萄球菌菌落數(shù)直接減少至少2（lg（CFU/mL））?？梢?，噬菌體是一種可有效替代抗生素治療的新型抗菌方法。因此，本研究旨在分離可裂解MRSA的噬菌體，探究噬菌體對(duì)MRSA生物被膜的影響以及在食品中的初步應(yīng)用，以期為食品中MRSA的生物防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MRSA菌株ATCC 43300、MRSA 2、MRSA 29[18]、其他受試16 株MRSA菌株[18]和8 株普通金黃色葡萄球菌菌株[19]均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。污水樣品采集自四川某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)；脫脂牛奶與牛肉 市售。

BP（Baird-Parker）瓊脂培養(yǎng)基、1%亞碲酸鉀、LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；胰蛋白胨、酵母粉 英國(guó)Oxoid公司；氫氧化鈉、濃鹽酸、二甲基亞砜、結(jié)晶紫、甲醇 天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

SM緩沖液：2 g MgSO4·7H2O、5.89 g NaCl、50 mL pH 7.5 Tris-HCl、2%明膠；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）：8 g NaCl、0.2 g KCl、3.58 g Na2HPO4·12H2O、0.245 g K2H2PO4。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)、pHS-4C pH計(jì) 寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-6100分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司；Coster 96 孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板 美國(guó)Bio-Rad公司；HZQ-X160恒溫振蕩培養(yǎng)箱 蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；318C+酶標(biāo)儀 上海沛歐分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 噬菌體初篩菌株的鑒定

以參考菌株ATCC 43300作為質(zhì)控菌株，mecA基因作為判斷MRSA依據(jù)，參考王瓊等[20]方法提取DNA，對(duì)ATCC 43300、MRSA 2 和MRSA 29菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

擴(kuò)增引物：上游引物：5’-GTGAAGATATACCAAGTGATT-3’；下游引物：5’-ATGGGGTATAGATTGAAAGGA-3’，理論長(zhǎng)度174 bp[21]；擴(kuò)增體系：上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，1.1hT3 Super PCR Mix 17 μL；擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性2 min、98 ℃變性20 s、59 ℃退火10 s、72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min。

1.3.2 噬菌體的分離純化

參考文獻(xiàn)[22]的分離方法，將采自四川成都某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)不同環(huán)境（采奶環(huán)境、飼養(yǎng)環(huán)境及周邊溝渠）污水混合后除雜，采用0.22 μm濾器過(guò)濾。取3 株已活化好的MRSA菌液2 mL（OD600nm0.3～0.6）分別與100 mL無(wú)菌LB培養(yǎng)基混勻，靜置0.5 h后，加入到100 mL污水中，混合液于37 ℃、160 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩過(guò)夜，8 000 r/min離心10 min，用0.22 μm濾器過(guò)濾除掉細(xì)菌，得到噬菌體液。

取100 μL噬菌體液與100 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液混合，靜置10 min后于EP管中加入5 mL半固體培養(yǎng)基，充分混勻后倒入到LB固體培養(yǎng)基上，冷卻后放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至出現(xiàn)噬菌斑。用接種環(huán)挑取平板上大而透明的單個(gè)噬菌斑于1 mL SM緩沖液中，在37 ℃、160 r/min搖床中過(guò)夜，次日將SM緩沖液8 000 r/min離心10 min，10 倍比稀釋制雙層平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后于板上挑出單個(gè)噬菌斑，重復(fù)上述操作3～5次，可得到大小均一且較純的噬菌體。雙層平板法按式（1）計(jì)算初始效價(jià)：

1.3.3 噬菌體理化性質(zhì)的測(cè)定

1.3.3.1 噬菌體透射電鏡觀察

噬菌體樣品送至成都里來(lái)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行透射電鏡觀察。

1.3.3.2 噬菌體裂解譜的測(cè)定

將16 株MRSA菌株和8 株金黃色葡萄球菌菌液于LB固體平板上均勻涂布，取效價(jià)約為108PFU/mL的噬菌體液5 μL點(diǎn)樣于涂滿菌液的LB平板上[23]，待平板晾干后移入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察裂解效果。以超純水點(diǎn)樣的LB平板為空白對(duì)照。

1.3.3.3 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）的測(cè)定

參考Lu等[24]的方法，調(diào)整噬菌體效價(jià)并固定為106PFU/mL，調(diào)節(jié)宿主菌濃度使最終MOI分別為10、1、0.1、0.01、0.001，取100 μL噬菌體液和100 μL宿主菌液混合，靜置10 min后加入1 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩6 h。采用雙層平板法計(jì)算效價(jià)，效價(jià)最高的為最佳MOI。

1.3.3.4 噬菌體一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

參考高明明等[25]的方法，按照最佳MOI=0.01，將1 mL噬菌體裂解液和1 mL宿主菌液混合，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置孵育15 min后，8 000 r/min離心10 min，棄上清液，此時(shí)沉淀已有噬菌體吸附，再用LB液體培養(yǎng)基洗滌1～2次，洗去未吸附的游離噬菌體，加入15 mL LB液體培養(yǎng)基，在0～150 min內(nèi)每隔10 min取樣，雙層平板法計(jì)算噬菌體效價(jià)。裂解量按式（2）計(jì)算：

1.3.3.5 pH值對(duì)噬菌體效價(jià)的影響

參考阮紅日等[16]的方法，調(diào)節(jié)SM緩沖液pH值分別為2、4、6、7、8、10、12，取1 mL效價(jià)約106PFU/mL噬菌體液分別加入不同pH值SM緩沖溶液中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h。通過(guò)雙層平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)。

1.3.3.6 不同溫度對(duì)噬菌體效價(jià)的影響

參考聶若男等[26]的方法，取1 mL效價(jià)約108PFU/mL噬菌體裂解液分別于25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃水浴1 h，取出處理液，用SM緩沖液作10 倍比稀釋后，通過(guò)雙層平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)。

1.3.3.7 紫外光照射對(duì)噬菌體效價(jià)的影響

取8 mL效價(jià)約108PFU/mL噬菌體液于一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放置于紫外燈下10～20 cm處，分別于照射0、10、20、30、40、50、60、70 min取樣1 mL，雙層平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)，評(píng)價(jià)噬菌體對(duì)紫外線的敏感性[27]。

1.3.4 噬菌體的應(yīng)用效果分析

1.3.4.1 不同MOI噬菌體對(duì)宿主菌的裂解效果

參考文獻(xiàn)[26]的方法，分別按照MOI為10、1、0.1、0.01、0.001，取100 μL噬菌體液、100 μL麥?zhǔn)蠞岫?.5的MRSA 2菌懸液加入96 孔板中（總體系200 μL）；陰性對(duì)照組為不加菌懸液的LB液體培養(yǎng)基200 μL；陽(yáng)性對(duì)照為100 μL菌懸液加100 μL LB液體培養(yǎng)基。加樣完成后，將96 孔板移至37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h，每隔1 h在酶標(biāo)儀中測(cè)定OD600nm。

1.3.4.2 噬菌體對(duì)細(xì)菌被膜清除作用

參考唐俊妮等[28]的被膜形成測(cè)定方法，以裂解譜實(shí)驗(yàn)中被裂解的菌株為研究對(duì)象，選出2 株成膜能力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行研究。生物被膜培養(yǎng)成熟后，將96 孔板取出，用滅菌PBS洗滌2～3次，除去游離菌和菌沉淀。取效價(jià)108PFU/mL噬菌體液220 μL加入到96 孔板中，對(duì)照組為220 μL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，將其移至恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。結(jié)晶紫染色法于第0、4、8、12、24、36、48小時(shí)測(cè)定OD630nm[19]。

1.3.4.3 噬菌體在食品中的初步應(yīng)用

噬菌體對(duì)牛乳中MRSA的抑制作用：根據(jù)賈靜靜[29]及預(yù)實(shí)驗(yàn)的抗菌效果，將脫脂牛乳中接入MRSA 2菌液，接種量4.57（lg（CFU/mL）），按照最終MOI分別為10 000、1 000、100、0加入噬菌體液，混合液放置于25 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，在第0、2、4、6、8、10、12、24小時(shí)分別取1 mL樣品溶液加入到9 mL 0.9 g/100 mL生理鹽水中，作10 倍稀釋，按照GB 4789.10ü2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》[30]的計(jì)數(shù)方法，選擇適宜稀釋梯度進(jìn)行BP平板菌落計(jì)數(shù)。

噬菌體對(duì)牛肉中MRSA的抑制作用：參考Huang Chenxi等[31]的方法，將牛肉切成約1 cmh1 cm小塊，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，取出肉塊于一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿中冷卻、晾干；將牛肉分裝到100 mL滅菌錐形瓶中；實(shí)驗(yàn)組加入100 μL 103CFU/mL菌液和100 μL效價(jià)為107、106、105PFU/mL的噬菌體液，最終MOI分別為10 000、1 000、100；對(duì)照組加入100 μL菌液和100 μL SM緩沖液，25 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)并于第0、2、4、6、8、10、12、24小時(shí)取出錐形瓶，加10 mL生理鹽水，充分搖勻后吸取1 mL液體樣品作10 倍比稀釋，在適宜稀釋度進(jìn)行BP平板計(jì)數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。采用Excel2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS 2019軟件進(jìn)行方差分析，Origin 2018軟件進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體初篩菌株的鑒定

如圖1所示，菌株ATCC 43300、MRSA 2和MRSA 29 3 株菌均可在174 bp附近形成特異性mecA條帶，確認(rèn)3 株菌均為MRSA菌株。以MRSA 2和MRSA 29作為后續(xù)噬菌體初篩菌株。

圖1 mecA基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of mecA gene

2.2 噬菌體的分離純化

從奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)采集的污水在經(jīng)過(guò)3次富集后，利用雙層平板法觀察發(fā)現(xiàn)，初篩菌株中在MRSA 2菌株對(duì)應(yīng)的平板上形成了明顯、密集且呈圓形透明的噬菌斑（圖2A）。進(jìn)一步將分離得到的噬菌體經(jīng)過(guò)3～5次純化后，得到斑塊透亮、邊緣整齊、大小均一、形態(tài)一致、純度較高的噬菌體（圖2B），將其命名為P65。經(jīng)測(cè)定，分離的噬菌體效價(jià)為1.11h105PFU/mL，進(jìn)一步增殖后其效價(jià)可達(dá)1.14h108PFU/mL。

圖2 噬菌體在雙層平板上形成的噬菌斑Fig.2 Phage plaque formation on a double-layer plate

2.3 噬菌體P65的理化性質(zhì)

2.3.1 噬菌體透射電鏡觀察

如圖3所示，噬菌體P65頭部呈多面體結(jié)構(gòu)，具有非收縮性細(xì)長(zhǎng)、柔軟的尾部，整體長(zhǎng)度（236f5）nm、頭部直徑（71f2）nm、尾部長(zhǎng)（165f5）nm。根據(jù)馮燁等[32]對(duì)噬菌體的分類標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)所分離的噬菌體屬于有尾噬菌體目長(zhǎng)尾噬菌體科（Siphoviridae）。

圖3 噬菌體P65的形態(tài)Fig.3 Morphology of P65

2.3.2 噬菌體P65的裂解譜

對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的其他16 株MRSA和8 株普通金黃色葡萄球菌進(jìn)行宿主范圍測(cè)定時(shí)，發(fā)現(xiàn)噬菌體P65除對(duì)宿主菌MRSA 2可裂解外，還對(duì)MRSA 24和8 株普通金黃色葡萄球菌具有裂解效果，具體裂解情況如表1所示。

表1 噬菌體P65的裂解譜Table 1 Lysis profile of phage P65

2.3.3 噬菌體P65的最佳MOI

如圖4所示，當(dāng)MOI=1時(shí)，噬菌體P65效價(jià)最低，當(dāng)MOI=0.01時(shí)，其效價(jià)最高，經(jīng)計(jì)算為2.52h108PFU/mL，因此，MOI=0.01為噬菌體P65的最佳MOI。

圖4 噬菌體P65的MOIFig.4 Determination of MOI

2.3.4 噬菌體P65的一步生長(zhǎng)曲線

如圖5所示，噬菌體和宿主菌混合后侵染0～10 min內(nèi)，噬菌體增殖不明顯，可判斷噬菌體P65的潛伏期為10 min；在10 min后噬菌體開始大量增殖，80 min后開始趨于平緩，100 min時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)噬菌體效價(jià)為3.83h109PFU/mL?？梢?，噬菌體P65的裂解周期為90 min；裂解量為35.46 PFU/cell。

圖5 噬菌體P65的一步生長(zhǎng)曲線Fig.5 One-step growth curve of phage P65

2.3.5 pH值對(duì)噬菌體P65效價(jià)的影響

如圖6所示，在pH 2時(shí)噬菌體P65全部失活；當(dāng)pH 4、6、7、8、10時(shí)噬菌體P65耐受性變化較小，在pH 12時(shí)其活性受到明顯抑制。本實(shí)驗(yàn)分離的噬菌體P65具有一定的耐酸堿性，且最適pH值為8。

圖6 pH值對(duì)噬菌體效價(jià)的影響Fig.6 Effect of pH on phage titer

2.3.6 溫度對(duì)噬菌體P65效價(jià)的影響

如圖7所示，噬菌體P65在不同溫度水浴中處理1 h后，其活性受溫度影響顯著。噬菌體P65的最適生長(zhǎng)溫度為30～45 ℃，當(dāng)溫度高于45 ℃時(shí)，噬菌體活性開始下降；當(dāng)溫度為70 ℃時(shí)，噬菌體失活。本實(shí)驗(yàn)分離到的噬菌體P65耐高溫性一般，耐受溫度為65 ℃。

圖7 溫度對(duì)噬菌體效價(jià)的影響Fig.7 Effect of temperature on phage titer

2.3.7 紫外線照射對(duì)噬菌體P65效價(jià)的影響

如圖8所示，噬菌體P65在紫外線照射處理后，其活性逐漸呈下降趨勢(shì)，紫外線照射處理70 min后，噬菌體P65效價(jià)由0 min的1.91h108PFU/mL降至2.65h104PFU/mL。

圖8 紫外線照射對(duì)噬菌體效價(jià)的影響Fig.8 Effect of ultraviolet radiation on phage titer

2.4 噬菌體P65的應(yīng)用效果探索

2.4.1 不同MOI噬菌體對(duì)宿主菌的裂解效果

如圖9A所示，陽(yáng)性對(duì)照曲線10 h內(nèi)一直保持上升趨勢(shì)；與陽(yáng)性對(duì)照相比，不同MOI噬菌體均可很好地抑制宿主菌MRSA 2的生長(zhǎng)。0～2 h內(nèi)，由于噬菌體數(shù)量較少，實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組差異不明顯；但3 h后實(shí)驗(yàn)組OD600nm明顯下降，與陽(yáng)性對(duì)照組差異顯著（P＜0.01），說(shuō)明期間噬菌體抑菌效果好。如圖9B所示，噬菌體對(duì)宿主菌控制效果較好，細(xì)菌培養(yǎng)液澄清。

圖9 不同MOI噬菌體對(duì)宿主菌MRSA 2的裂解曲線（A）和裂解效果（B）Fig.9 Influence of MOI on the lytic effect of phage P65 on the host MRSA 2

2.4.2 噬菌體對(duì)細(xì)菌被膜的清除效果

如圖10所示，噬菌體P65對(duì)宿主菌MRSA 2和MRSA 24的生物被膜形成均有較好的清除作用。生物被膜經(jīng)噬菌體處理培養(yǎng)4 h后，MRSA 2和MRSA 24的OD630nm分別由0 h的0.935、0.966降低至0.364、0.340，此時(shí)被膜清除率分別為61.0%、64.8%，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，OD630nm逐漸降低，培養(yǎng)48 h，MRSA 2和MRSA 24的被膜清除率分別達(dá)91.3%和92.2%，清除效果非常明顯。

圖10 噬菌體P65對(duì)細(xì)菌生物被膜的清除效果Fig.10 Effect of phage treatment on the removal of bacterial biofilms at different culture times

2.4.3 噬菌體在食品中的初步應(yīng)用效果

2.4.3.1 噬菌體對(duì)脫脂牛乳中MRSA 2的抑制效果

如圖11所示，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組MRSA 2菌落數(shù)不斷上升，在第24小時(shí)菌落數(shù)達(dá)9.25（lg（CFU/mL））；MOI=100組的抑菌效果和對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；MOI=10 000、MOI=1 000組在0～6 h內(nèi)，菌落數(shù)呈下降趨勢(shì)，在第6小時(shí)菌落數(shù)較對(duì)照組分別減少了2.68、1.99（lg（CFU/mL））；6 h后所有實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)均呈上升趨勢(shì)?？梢姡删w在牛乳貯藏前期具有較明顯的抑菌作用，且噬菌體濃度越高，抑菌效果越好，但隨時(shí)間延長(zhǎng)噬菌體的抑菌效果可能受牛乳中成分的影響而減弱。

圖11 噬菌體在脫脂牛乳中的抑菌效果Fig.11 Antibacterial effect of phage P65 in skimmed milk contaminated with MRSA 2

2.4.3.2 噬菌體對(duì)牛肉中MRSA 2的抑制作用

如圖12所示，在0～24 h內(nèi)，對(duì)照組菌落數(shù)由3.32（lg（CFU/mL））增至7.05 （lg（CFU/mL））；MOI=10 000組抑菌效果比較明顯，第12小時(shí)菌落數(shù)較對(duì)照組（6.75（lg（CFU/mL）））減少了2.60（lg（CFU/mL））。MOI=1 000組在第12小時(shí)較對(duì)照組減少了2.08（lg（CFU/mL））；MOI=100組抑菌效果相對(duì)最差。

圖12 牛肉中噬菌體的抑菌效果Fig.12 Antibacterial effect of phage P65 in beef contaminated with MRSA 2

3 討 論

噬菌體在養(yǎng)殖業(yè)、食品工業(yè)、檢測(cè)技術(shù)、醫(yī)療業(yè)等領(lǐng)域都有較好的應(yīng)用前景[21-22]。2006年，美國(guó)食品藥品管理局允許在食品加工過(guò)程中使用一定數(shù)量的噬菌體，開啟了噬菌體在食品應(yīng)用中的關(guān)鍵一步[33]；在后續(xù)噬菌體研究中，科研人員發(fā)現(xiàn)噬菌體在乳、肉、蔬菜等方面均具有較好的抗菌效果[34]，表明未來(lái)噬菌體在食品生產(chǎn)加工中應(yīng)用潛力巨大。

本研究分離1 株能夠裂解MRSA的噬菌體P65，通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)P65屬于有尾噬菌體目長(zhǎng)尾噬菌體科；其初始效價(jià)為1.1h105PFU/mL，與涂尊方[35]和范錦戴[36]等分離的噬菌體相比效價(jià)較低，可能是由于菌株間存在差異性；經(jīng)進(jìn)一步優(yōu)化增殖后，噬菌體P65效價(jià)提高到1.14h108PFU/mL。裂解譜測(cè)定發(fā)現(xiàn)噬菌體P65可裂解2 株MRSA和8 株金黃色葡萄球菌，裂解譜相對(duì)較窄。噬菌體P65的最佳MOI為0.01，與鞠磊等[37]分離噬菌體qdsa002的MOI一致，與阮紅日等[16]分離噬菌體vB_SauM_RS MOI有差異，分析原因可能與不同宿主菌株差異有關(guān)。由一步生長(zhǎng)曲線可知噬菌體P65潛伏期為10 min、裂解周期為90 min、裂解量為35.46 PFU/cell，與Xu Yue[38]和Wang Zhaofei[39]等分離的噬菌體裂解特性相似。溫度和pH值是影響噬菌體活性的關(guān)鍵因素，本研究中噬菌體P65與葛志毅等[40]分離的噬菌體vB_SauS_SAP3對(duì)pH值和溫度的耐受性相似。噬菌體P65最適溫度為30～45 ℃，在70 ℃基本失活；pH 4～10時(shí)噬菌體活性較穩(wěn)定，pH 2時(shí)噬菌體基本失活，說(shuō)明噬菌體P65耐酸性不強(qiáng)。因此，可考慮將噬菌體與堿性消毒劑聯(lián)合使用效果更好。噬菌體P65隨著紫外線照射時(shí)間延長(zhǎng)，其活性逐漸下降，照射70 min后，P65效價(jià)由初始1.91h108PFU/mL降低至2.65h104PFU/mL，對(duì)比于龍等[27]對(duì)大腸桿菌噬菌體研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)噬菌體P65對(duì)紫外線耐受性較強(qiáng)，可能與噬菌體自身特性有關(guān)。錢新杰等[41]分離的噬菌體PNJ1809-13、PNJ1809-13對(duì)細(xì)菌生物被膜的清除率為78%和30%，本研究中成熟生物被膜經(jīng)P65（108PFU/mL）處理，僅處理4 h，MRSA 2、MRSA 24的被膜清除率分別為61.0%和64.8%，處理48 h清除率分別高達(dá)91.3%和92.2%，說(shuō)明本研究分離的噬菌體P65對(duì)MRSA的生物被膜清除率高、效果好。賈靜靜[29]報(bào)道提高牛奶中噬菌體的效價(jià)可有效殺滅致病菌。本研究中，噬菌體P65并不能完全殺滅牛奶中MRSA，在0～6 h內(nèi)，MOI=10 000組和MOI=1 000組的MRSA菌落數(shù)均減少，且效價(jià)越高，抑菌效果越好；但6 h后對(duì)MRSA的清除效果不明顯，分析原因可能是牛乳中的成分對(duì)細(xì)菌起到保護(hù)作用，影響了噬菌體的裂解效果。在牛肉抑菌實(shí)驗(yàn)中， MOI=10 000、MOI=1000組抑菌效果較明顯，在第12小時(shí)菌落數(shù)比對(duì)照組分別減少了2.60、2.08（lg（CFU/mL）），而MOI=100組效果相對(duì)較差。盡管噬菌體對(duì)牛肉和脫脂牛乳中MRSA均具一定的抑菌效果，但并未能徹底殺滅致病菌，原因可能與食物基質(zhì)有關(guān)，牛肉中的脂肪[42]或牛乳中的乳清蛋白、抗病毒活性成分干擾噬菌體[43]。未來(lái)還需進(jìn)一步探索P65對(duì)不同食物基質(zhì)中MRSA的清除效果。

噬菌體作為一種天然抗菌劑，在自然界中廣泛存在，具有裂解周期短、不易引起耐藥性、特異性強(qiáng)等許多優(yōu)勢(shì)，在抗菌方面應(yīng)用潛力巨大。但噬菌體宿主范圍窄是噬菌體應(yīng)用的一大難題。目前，解決噬菌體宿主范圍窄的問(wèn)題通常是由多種宿主范圍不同的噬菌體混合制成“噬菌體雞尾酒”治療細(xì)菌感染。但宿主受體類型的鑒定耗時(shí)、耗力，會(huì)增加噬菌體制劑選配的成本和時(shí)間。因此噬菌體庫(kù)的建立將有利于加速宿主受體的鑒定，促進(jìn)噬菌體宿主受體在“噬菌體雞尾酒”選配和噬菌體治療中發(fā)揮更大作用。目前，已有部分噬菌體庫(kù)陸續(xù)建立[44]，但仍需要完善。此外，對(duì)噬菌體尾絲或尾針上的受體結(jié)合蛋白可變區(qū)域進(jìn)行突變，可以獲得宿主范圍更廣的突變噬菌體，感染更多種類的細(xì)菌，而不會(huì)影響它們的裂解活性[45]，因此基因工程噬菌體是未來(lái)噬菌體治療的重要研究方向。聯(lián)合應(yīng)用其他抗菌劑也一定程度彌補(bǔ)了噬菌體的不足，但不是所有復(fù)合法都優(yōu)于噬菌體的單獨(dú)使用，因此一種合理的復(fù)合減菌方式仍有待探索[46]。此外，我國(guó)缺乏噬菌體產(chǎn)品生產(chǎn)和制造的標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)法規(guī)，需建立一套完善的噬菌體應(yīng)用安全評(píng)價(jià)體系以保證噬菌體生產(chǎn)應(yīng)用中每個(gè)環(huán)節(jié)的安全性。

本研究以MASR菌株為宿主菌，從奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)不同環(huán)境污水中成功分離到的烈性噬菌體P65，可裂解MASR和其他金黃色葡萄球菌，為噬菌體作為天然抗菌劑的應(yīng)用奠定一定基礎(chǔ)。