熱處理對(duì)鱘魚肝臟鐵蛋白穩(wěn)定性的影響

丁炳文，馬貴紅，李 筱，朱佳倩，李 蝶，馮穎琳，張志清，李樹紅，馬 翼，李美良,*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625000；2.四川潤(rùn)兆漁業(yè)有限公司，四川 雅安 625000）

鐵蛋白是一種天然的鐵儲(chǔ)存蛋白，廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物體內(nèi)，具有維持生物體內(nèi)的鐵代謝平衡、抗氧化及解毒等功能[1]。典型的鐵蛋白是由24個(gè)亞基組成的高度對(duì)稱的球狀結(jié)構(gòu)，包括蛋白質(zhì)外殼和鐵核兩部分，蛋白外殼內(nèi)外直徑分別約為8 nm和12 nm，鐵核最多可以儲(chǔ)存4 500個(gè)鐵原子[2]。傳統(tǒng)的補(bǔ)鐵制劑因其有效性和安全性受到限制，而鐵蛋白卻能以可溶、無(wú)毒、生物可利用的形式儲(chǔ)存大量的鐵，因此天然的鐵蛋白是一種良好的鐵補(bǔ)充制劑，并且在補(bǔ)鐵實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其對(duì)人體無(wú)毒害作用[3]。

鱘魚是現(xiàn)存淡水魚中體型較大、壽命較長(zhǎng)的魚類之一，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和科學(xué)研究?jī)r(jià)值[4]。我國(guó)是鱘魚養(yǎng)殖大國(guó)，隨著鱘魚養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，鱘魚產(chǎn)品加工量也在迅速增加[5]。然而在鱘魚加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的魚骨、魚皮及內(nèi)臟等下腳料，如果直接丟棄，既污染環(huán)境又浪費(fèi)資源[6]，因而對(duì)其進(jìn)行綜合利用顯得尤為重要。目前關(guān)于鱘魚下腳料研究主要集中在魚骨[7-9]、魚皮[10-12]及內(nèi)臟提取魚油[13]等方面，而對(duì)鱘魚肝臟中蛋白的研究及利用較少，如何對(duì)鱘魚肝臟中蛋白進(jìn)行合理的開發(fā)和利用亟待研究。此外，由于動(dòng)物肝臟中鐵蛋白含量較高且儲(chǔ)存較多的鐵[14]，因此對(duì)鱘魚肝臟中鐵蛋白進(jìn)行研究有助于減少資源浪費(fèi)，并為鱘魚肝臟資源的綜合利用提供參考。同時(shí)，熱處理作為食品資源加工利用的重要手段，其可以影響食品資源的應(yīng)用。有研究表明相較于大多數(shù)蛋白質(zhì)，鐵蛋白具有較高的熱穩(wěn)定性[2]，鱘魚肝臟鐵蛋白作為本課題組新純化的一種魚類肝臟鐵蛋白尚未確定其熱穩(wěn)定性。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于熱處理對(duì)鐵蛋白穩(wěn)定性方面的研究報(bào)道相對(duì)較少，主要集中在植物鐵蛋白[15]和部分動(dòng)物鐵蛋白[16-17]，而關(guān)于魚類肝臟鐵蛋白熱穩(wěn)定性研究鮮有報(bào)道。本研究以鱘魚肝臟鐵蛋白（liver ferritin ofAcipenser baerii，ABLF）為研究對(duì)象，并探究在不同溫度熱處理對(duì)其理化性質(zhì)的影響，以期進(jìn)一步豐富鐵蛋白在熱穩(wěn)定性方面的研究，同時(shí)也為選擇合適熱處理?xiàng)l件應(yīng)用于鱘魚肝臟鐵蛋白制品的加工提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

用于提取鐵蛋白的西伯利亞鱘魚肝臟購(gòu)于四川潤(rùn)兆食品有限公司，于-20 ℃冷凍保存。DE-52弱陰離子交換填料、Sephacryl-S-300凝膠過(guò)濾填料 北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司；菲啰嗪-鈉鹽（純度＞97%） 上海源葉生物科技有限公司；抗壞血酸VC（食品級(jí)）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、考馬斯亮藍(lán)R250 北京索萊寶科技有限公司。其他試劑均為分析純及以上，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

BioLogic DuoFlow Maximizer 20蛋白純化系統(tǒng)、Dio-Gel-2000凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；TGL 16M高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；MICRO 17微量離心機(jī)、Varioskan flash全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、Nicoletl iS10傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 美國(guó)Thermo Scientific公司；HH-601超級(jí)恒溫水浴鍋 金壇榮華儀器有限公司；Zetasizer Nano ZS納米粒度儀 英國(guó)Malvern儀器有限公司；JEM-2000透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM） 日本電子株式會(huì)社；SPECORD 200 PLUS紫外-可見分光光度計(jì) 德國(guó)耶拿公司。

1.3 方法

1.3.1 ABLF的分離純化及表征

1.3.1.1 ABLF的分離純化

參考饒承冬[18]的方法并稍作修改。通過(guò)65 ℃熱變性、30%～60%硫酸銨溶液分級(jí)沉淀、DEAE-52弱陰離子交換層析、Sephacryl-S-300凝膠過(guò)濾層析等技術(shù)從鱘魚肝臟中分離純化得到ABLF。通過(guò)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（native-polyacrylamide gel electrophoresis，Native-PAGE）測(cè)定ABLF的表觀分子質(zhì)量，電泳條件為8%分離膠4 ℃條件下5 mA運(yùn)行12 h。通過(guò)十二烷基硫酸鈉-變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)ABLF的純度及亞基種類，電泳條件為12%分離膠、25 ℃、120 V運(yùn)行1 h。電泳結(jié)束后凝膠均采用考馬斯亮藍(lán)染色液R-250染色2 h，并用脫色液進(jìn)行脫色。采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣品。鐵蛋白中鐵含量的測(cè)定采用Ferrozine法[19]，磷含量測(cè)定采用磷鉍鉬藍(lán)分光光度法[20]。

1.3.1.2 TEM分析

ABLF的TEM制樣參考Yang Rui[21]和Li Meiliang[22]等的方法并稍作修改。采用磷鎢酸負(fù)染色法，使用SEM以80 kV在20 nm比例尺下觀察并拍攝成像。TEM圖片采用Nano Measurer 1.2軟件進(jìn)行粒徑分析，將圖片導(dǎo)入軟件，設(shè)置比例尺后從中隨機(jī)選出50個(gè)納米粒子，測(cè)量每個(gè)納米粒子的蛋白殼及鐵核的直徑，并應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差分析[23]。

1.3.2 熱處理對(duì)ABLF穩(wěn)定性的影響

1.3.2.1 熱處理對(duì)ABLF溶解度和鐵含量的影響

參考Tang Jiaying等[15]的方法并稍作修改。將純化后的ABLF樣品溶液調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度至0.6 mg/mL于25 mmol/L Tris-HCl（pH 7.25）中，分別取3 mL置于5 支離心管中并編號(hào)（0、1、2、3、4），接著將離心管分別置于60、70、80、90、100 ℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行熱處理15 min。冷卻至室溫后，5 000 r/min離心10 min后取上清液，進(jìn)行SDS-PAGE分析。測(cè)定上清液蛋白濃度，透析后測(cè)定鐵含量。

1.3.2.2 熱處理對(duì)ABLF粒徑穩(wěn)定性的影響

采用Zetasizer Nano ZS納米粒度儀對(duì)經(jīng)過(guò)熱處理后的ABLF溶液進(jìn)行測(cè)定，參考Li Han等[16]的測(cè)試方法并稍作修改。具體操作如下：將熱處理后的ABLF樣品上清液過(guò)0.45 μm的水系濾膜（減少大顆粒和氣泡的干擾），樣品測(cè)定溫度固定在25 ℃，散射光角度固定在90°，測(cè)量時(shí)間為120 s，進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)量后取平均值進(jìn)行分析，粒徑數(shù)據(jù)導(dǎo)出后采用Origin作圖。

1.3.2.3 FTIR分析

以溴化鉀壓片為空白背景，將凍干樣品與溴化鉀（1∶50，m/m）充分研磨并壓縮成薄片，采用FTIR儀在25 ℃條件下，分辨率4 cm-1，波數(shù)范圍4 000～400 cm-1進(jìn)行掃描32次。參考李萌[24]和暢鵬[25]等的方法，用PeakFit V4.12軟件對(duì)酰胺I帶（波數(shù)范圍1 600～1 700 cm-1）進(jìn)行分析。

1.3.3 熱處理溫度對(duì)ABLF鐵釋放速率的影響

為探究25～65 ℃條件下溫度對(duì)ABLF鐵釋放速率的影響，ABLF釋放動(dòng)力學(xué)的研究參考劉玉茜等[26]的方法并稍作修改。將300 μL相同蛋白濃度1 μmol/L的ABLF溶液分別置于25、35、45、55、65 ℃的水浴條件下15 min，取出后迅速與10 μL的0.1 mol/L菲啰嗪以及10 μL的0.1 mol/L的VC快速混勻后，在波長(zhǎng)562 nm處進(jìn)行測(cè)定，觀察吸光度隨時(shí)間的變化，每個(gè)樣品運(yùn)行1 500 s，循環(huán)時(shí)間0.5 s，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.4 ABLF貯藏穩(wěn)定性分析

將1 μmol/L的鱘魚肝臟鐵蛋白1 mL（緩沖液為25 mmol/L pH 7.25 Tris-HCl），分別置于4 ℃和25 ℃的條件下，靜置數(shù)天后，取20 μL不同時(shí)間點(diǎn)的ABLF蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE以比較其貯藏穩(wěn)定性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)采用SPSS軟件，結(jié)果以 fs，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ABLF的分離純化

2.1.1 DE-52弱陰離子交換柱層析

在本實(shí)驗(yàn)室前期探索最優(yōu)的條件下，對(duì)鱘魚肝臟鐵蛋白粗提液進(jìn)行DE-52弱陰離子交換層析，層析檢測(cè)過(guò)程曲線和電泳驗(yàn)證結(jié)果如圖1所示。從圖1A可以看出，層析過(guò)程有3個(gè)蛋白峰I、II、III。圖1B為層析過(guò)程的SDS-PAGE結(jié)果，泳道2對(duì)應(yīng)的是65 ℃熱處理和30%～60%硫酸銨溶液沉淀后的粗蛋白提取液，由電泳條帶可知其鐵蛋白含量較多但仍有很多雜蛋白存在。泳道3對(duì)應(yīng)峰I的電泳圖，電泳條帶顯示其含有大量的雜蛋白。泳道4是線性洗脫即峰III對(duì)應(yīng)的電泳結(jié)果，其幾乎不含鐵蛋白條帶。泳道1為0.05 mol/L NaCl洗脫峰II的電泳結(jié)果，條帶中幾乎不含雜蛋白，因此將峰II對(duì)應(yīng)樣品進(jìn)行超濾濃縮備用。

圖1 DE-52弱陰離子交換層析（A）及SDS-PAGE結(jié)果（B）Fig.1 DE-52 anion exchange chromatogram (A) and SDS-PAGE results (B)

2.1.2 Sephacryl-S-300凝膠過(guò)濾層析結(jié)果及電泳分析

將上一步超濾濃縮的蛋白液進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，洗脫液為含有0.15 mol/L NaCl的25 mmol/L Tris-HCl pH 7.5的緩沖液，層析實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，只有一個(gè)蛋白峰，猜測(cè)是目標(biāo)蛋白峰單體，收集樣品并對(duì)其進(jìn)一步電泳驗(yàn)證。Native-PAGE顯示ABLF在經(jīng)過(guò)Sephacryl-S-300純化后幾乎被純化至均一程度（圖3A），其表觀相對(duì)分子質(zhì)量約為480 kDa，SDS-PAGE顯示純化后的蛋白達(dá)到電泳純，并且ABLF是由2個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量分別為20.8 kDa的H亞基和20.2 kDa的L亞基構(gòu)成（圖3B），電泳結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果[18]一致，純化后的ABLF符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，經(jīng)計(jì)算鱘魚肝臟中ABLF的提取率為30.77 mg/kg。采用Ferrozine法和磷鉍鉬藍(lán)分光光度法分別對(duì)ABLF的鐵含量和磷含量進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)計(jì)算1分子ABLF的含鐵和含磷分別為473.77個(gè)和19.68個(gè)，相較于哺乳動(dòng)物，ABLF含有較高的鐵磷比[27]。

圖2 Sephacryl-S-300凝膠過(guò)濾層析Fig.2 Sephacryl-S-300 gel filtration chromatogram

圖3 純化后ABLF的Native-PAGE（A）和SDS-PAGE（B）圖Fig.3 Native-PAGE pattern (A) and SDS-PAGE pattern (B) of purified ABLF

2.2 ABLF的納米結(jié)構(gòu)觀察及粒徑表征

典型的鐵蛋白通常分子質(zhì)量較大（400～550 kDa），故其對(duì)應(yīng)的分子尺寸也相對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)較大，鐵蛋白分子的內(nèi)徑通常為7～8 nm，外徑12～13 nm，厚度2～2.5 nm[2]。TEM是觀察和分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相對(duì)直接的方法之一，由于鐵蛋白內(nèi)部的鐵核中含有大量的鐵氧化物晶體因而其呈現(xiàn)出較高的電子密度特征，因此其經(jīng)磷鎢酸負(fù)染色后在TEM下可以觀察到鐵蛋白的基本分子結(jié)構(gòu)特征[28]。從圖4A可以看出，純化所得ABLF是由低電子密度的淺色蛋白外殼和高電子密度的深黑色鐵核組成的球狀分子。采用Nano Measurer 1.2軟件對(duì)TEM圖片進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果為ABLF的外徑（12.35f1.22）nm，內(nèi)徑為（5.82f1.03）nm，與典型的鐵蛋白尺寸大小相符。由圖4B可知，經(jīng)DLS測(cè)定并對(duì)測(cè)得的峰進(jìn)行Gauss擬合得到的ABLF粒徑為（14.92f0.03）nm，與TEM結(jié)果基本一致。綜上可說(shuō)明純化所得ABLF具有典型的鐵蛋白分子結(jié)構(gòu)特征和完整的納米球狀結(jié)構(gòu)。

圖4 ABLF的TEM（A）和粒徑分布（B）圖Fig.4 TEM (A) and DLS (B) of ABLF

2.3 熱處理對(duì)ABLF穩(wěn)定性的影響

2.3.1 熱處理后的ABLF樣品圖及SDS-PAGE圖

從圖5A可以看出，60～80 ℃熱處理后的ABLF樣品仍保持較好的穩(wěn)定性，而經(jīng)100 ℃熱處理后的ABLF樣品明顯看出底部有棕紅色沉淀。觀察圖5B中各泳道的條帶顏色可知：60～80 ℃熱處理后樣品條帶灰度未有明顯變化，當(dāng)經(jīng)90 ℃熱處理后電泳條帶存在由灰度變淺的現(xiàn)象，而100 ℃熱處理后條帶灰度變淺十分明顯。電泳圖條帶灰度深淺常作為蛋白含量變化的參考，因此可以推測(cè)溫度升高到一定程度后引起ABLF發(fā)生聚集溶解度降低，鐵含量降低。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，分別對(duì)不同溫度熱處理后的樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)量濃度和鐵含量測(cè)定。

圖5 不同溫度熱處理15 min后的樣品圖（A）及其SDS-PAGE圖（B）Fig.5 Pictures (A) and SDS-PAGE (B) patterns of ABLF treated at different temperatures for 15 min

2.3.2 熱處理對(duì)ABLF溶解度和鐵含量影響

鐵蛋白亞基之間存在大量的氫鍵和鹽橋[29]賦予了其較高的熱穩(wěn)定性能夠耐受較高的溫度（70～80 ℃）不變性。由圖6可知，ABLF樣品的蛋白質(zhì)量濃度隨熱處理溫度升高整體呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，在60～80 ℃范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)量濃度下降的速率較慢，表明ABLF的溶解度受此范圍內(nèi)溫度的影響較小。隨著溫度的進(jìn)一步升高造成ABLF變性，原本處于分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露增強(qiáng)，親水基團(tuán)在表面的分布相對(duì)減少，蛋白粒子不能與水相溶失去水膜引起分子間互相碰撞而聚集沉淀，并且經(jīng)100 ℃熱處理后的ABLF溶解度顯著降低，與圖5中經(jīng)100 ℃熱處理后的樣品有明顯蛋白沉淀這一結(jié)論一致。由圖6可知，經(jīng)60 ℃和70 ℃熱處理后的ABLF的鐵含量并未有明顯差異，相比之下在80 ℃對(duì)ABLF熱處理15 min導(dǎo)致其鐵含量相比于60 ℃熱處理的樣品顯著下降，從（468.55f13.76）μmol/L下降至（349.74f12.36）μmol/L，ABLF的鐵含量損失了約25%。當(dāng)熱處理的溫度升高至90 ℃，相較于60 ℃熱處理?yè)p失的鐵含量占ABLF鐵總量的47%，這可能是較高溫度對(duì)ABLF熱處理可能會(huì)導(dǎo)致蛋白聚集或結(jié)構(gòu)破壞。與Tang Jiaying等[15]的研究結(jié)果一致。

圖6 不同溫度熱處理15 min后的樣品蛋白質(zhì)量濃度及相應(yīng)的鐵含量Fig.6 Protein concentrations and iron contents of ABLF treated at different temperatures for 15 min

2.3.3 熱處理對(duì)ABLF粒徑的影響

ABLF粒徑隨熱處理溫度的變化情況如圖7所示。DLS結(jié)果表明，未經(jīng)熱處理ABLF粒徑主要集中在12 nm處，表明此時(shí)的ABLF單分散性較好；隨著熱處理溫度升高，ABLF在100 nm處增加了一個(gè)粒徑分布區(qū)域，這表明形成了大的聚集體，12 nm處的粒徑峰向右略微偏移且占總體粒徑分布的比例下降。當(dāng)熱處理溫度為60 ℃和70 ℃時(shí)，ABLF的單分散性受溫度影響較小，這是由于鐵蛋白亞基間存在大量的鹽橋和氫鍵使得其具有良好的熱穩(wěn)定性。然而隨著溫度進(jìn)一步升高，ABLF單分散性下降，并且聚集的大分子逐漸增加形成了溶解度較低的蛋白聚集體，這與ABLF樣品圖和溶解度的研究結(jié)果一致。在Tang Jiaying[15]和Li Han[16]等的研究中，較高溫度（70～100 ℃）熱處理會(huì)導(dǎo)致豌豆種子鐵蛋白和重組牡蠣鐵蛋白形成大尺寸的蛋白聚集體，與本研究所得的結(jié)果相吻合。為進(jìn)一步揭示溫度變化對(duì)ABLF影響的原因，對(duì)不同溫度熱處理后的樣品進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

圖7 不同溫度熱處理15 min后的樣品粒徑分布圖Fig.7 Particle size distribution of ABLF treated at different temperatures for 15 min

2.3.4 熱處理對(duì)ABLF二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圖8為不同溫度熱處理?xiàng)l件下ABLF的FTIR圖。酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化較為敏感，因此通常被用來(lái)分析相應(yīng)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，此區(qū)域圖譜的變化主要是受蛋白結(jié)構(gòu)中C＝O伸縮振動(dòng)及肽鍵中CüN伸縮振動(dòng)等影響[30]。FTIR分析采用PeakFit V4.12軟件，依次進(jìn)行基線矯正、平滑、去卷積、二階導(dǎo)數(shù)擬合處理，酰胺I帶中1 646～1 664 cm-1為α-螺旋特征結(jié)構(gòu)、1 637～1 645 cm-1為無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)[31]，根據(jù)對(duì)應(yīng)的特征峰及峰面積計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量。

圖8 不同溫度熱處理ABLF的FTIR圖Fig.8 FTIR spectra of ABLF subjected to heat treatment at different temperatures

隨著熱處理溫度的升高，ABLF的α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量逐漸減少，當(dāng)熱處理溫度升至80 ℃時(shí)，ABLF的α-螺旋相對(duì)含量由52.1%下降至45.8%，隨著溫度進(jìn)一步上升，ABLF結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降，當(dāng)溫度升至100 ℃，ABLF中α-螺旋相對(duì)含量為30.9%，相較于60 ℃熱處理降低了21.2%，而無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量整體呈增加的趨勢(shì)。Tang Jiaying等[15]報(bào)道了60 ℃熱處理后豌豆種子鐵蛋白相較于未經(jīng)熱處理的樣品二級(jí)結(jié)構(gòu)變化不明顯，而經(jīng)90 ℃和100 ℃熱處理后，其α-螺旋相對(duì)含量分別下降至47%和25%，無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量分別則上升至27%和33%；Li Han等[16]報(bào)道了熱處理牡蠣鐵蛋白造成其α-螺旋相對(duì)含量降低，當(dāng)熱處理溫度升高至90 ℃，相較于未經(jīng)熱處理的牡蠣鐵蛋白α-螺旋相對(duì)含量降低了29.8%，二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化明顯；Yang Rui等[32-33]也報(bào)道了一定溫度的熱處理能夠降低大豆種子鐵蛋白和紅豆種子鐵蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋相對(duì)含量，以上報(bào)道與本研究結(jié)果吻合。結(jié)果表明，鐵蛋白的變性主要是因?yàn)棣?螺旋的變化，由于α-螺旋是靠氫鍵維持，熱變性導(dǎo)致α-螺旋中氫鍵斷裂發(fā)生解旋，α-螺旋相對(duì)含量降低導(dǎo)致鐵蛋白的剛性和彈性結(jié)構(gòu)發(fā)生變化（鐵蛋白由24個(gè)亞基組成，而亞基主要是由α-螺旋構(gòu)成[2]），影響整體蛋白的穩(wěn)定性，因此這很好的解釋了ABLF在經(jīng)熱處理后溶解度、鐵含量及粒徑的變化。

2.4 熱處理溫度對(duì)ABLF鐵釋放速率的影響

已有文獻(xiàn)報(bào)道，鐵蛋白鐵還原釋放特性是反應(yīng)鐵蛋白通道微環(huán)境變化的重要指標(biāo)[34]，為探究溫和條件下溫度對(duì)鐵蛋白通道微環(huán)境的影響，本研究比較25～65 ℃范圍內(nèi)對(duì)VC誘導(dǎo)的ABLF還原釋放速率和鐵釋放總量的變化，結(jié)果如圖9所示。圖9A表明：在同一溫度下，當(dāng)VC濃度和ABLF濃度保持不變時(shí)，吸光度隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，但隨后在相同時(shí)間間隔內(nèi)，增加程度卻是逐漸降低，推測(cè)原因是：VC有較強(qiáng)的還原性，其分子質(zhì)量較小可以通過(guò)ABLF的由親水性殘基組成的三重軸通道進(jìn)入鐵蛋白內(nèi)腔（動(dòng)物鐵蛋白中，三重軸通道由親水殘基構(gòu)成，四重軸通道由疏水性殘基組成[35]；動(dòng)物鐵蛋白中三重軸通道控制鐵離子的進(jìn)出[36-37]，將ABLF鐵核中的Fe3+還原成Fe2+并釋放出來(lái)，F(xiàn)e2+與菲啰嗪反應(yīng)生成在562 nm處具有紫外吸收的[Fe(ferrozine)3]2+螯合物導(dǎo)致吸光度不斷增加，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)反應(yīng)底物——鐵核中的鐵減少，ABLF鐵釋放速率逐漸降低。在相同時(shí)間范圍內(nèi)，隨著溫度的升高（25～65 ℃），吸光度增加程度上升，F(xiàn)e2+釋放速率逐漸升高（圖9A），并且鐵釋放總量逐漸增加（圖9B）。由此可見，一定溫度范圍內(nèi)，ABLF的鐵釋放速率與溫度呈正相關(guān)，溫度越高鐵釋放速率越快。Yang Rui等[32]報(bào)道了在20～60 ℃范圍內(nèi)，大豆種子鐵蛋白鐵還原釋放初始速率隨溫度上升逐漸升高，而超過(guò)70 ℃時(shí)初始速率顯著降低（P＜0.05）；胡曉慧等[38]進(jìn)行溫度和pH值影響魟魚肝鐵蛋白釋放鐵速率的研究，結(jié)果表明鐵還原釋放速率在30～45 ℃范圍內(nèi)隨溫度上升逐漸增加，以上研究結(jié)果均與本研究相似。綜合以上分析，在一定溫度范圍內(nèi)，鐵蛋白軸通道隨著溫度升高而變大，進(jìn)入鐵蛋白內(nèi)部的反應(yīng)物增多，因此ABLF鐵還原釋放速率增加。

圖9 溫度對(duì)VC誘導(dǎo)的ABLF還原釋放吸光度變化（A）及其釋放鐵總量的變化（B）Fig.9 Effect of heat treatment temperature on absorbance of ABLF induced by VC (A) and total amount of iron released (B)

2.5 ABLF在不同溫度條件下的貯藏穩(wěn)定性分析

如圖10A所示，25 ℃貯藏的ABLF在第9天左右電泳條帶相較于前7 d的電泳條帶顏色明顯變淺，這表明ABLF在第9天存在較為明顯的降解。由圖10B可以看出，4 ℃貯藏的ABLF在近2個(gè)月后電泳條帶顏色深淺沒有變化即蛋白降解不明顯，這表明ABLF在4 ℃條件下具有良好的貯藏穩(wěn)定性，因此若將ABLF應(yīng)用于補(bǔ)鐵制劑領(lǐng)域應(yīng)將其置于4 ℃冷藏以延長(zhǎng)其保質(zhì)期。Fu Xiaoping等[39]關(guān)于大豆種子鐵蛋白（soya bean seed ferritin，SSF）貯藏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明切除了EP（extension peptide）肽段的SSF穩(wěn)定性提高，并且EP-1（H-1亞基）具有明顯的絲氨酸蛋白酶樣活性。Yun Shaojun等[40]報(bào)道了蠶豆種子鐵蛋白（broad bean seed ferritin，BBSF）在4 ℃貯藏條件下15 d開始出現(xiàn)明顯降解，Yang Haixia等[41]報(bào)道了豌豆種子鐵蛋白在4 ℃貯藏5 d左右亞基出現(xiàn)降解，而在相同實(shí)驗(yàn)條件下，動(dòng)物鐵蛋白和重組人H鏈鐵蛋白穩(wěn)定性較植物鐵蛋白好。與天然的SSF和BBSF相比，ABLF在4 ℃的貯藏穩(wěn)定性大于二者，分析原因是ABLF是動(dòng)物鐵蛋白不含植物鐵蛋白特有的EP肽段，因此其降解速率相對(duì)于具有絲氨酸蛋白酶活性EP肽段的植物鐵蛋白較慢，即其具有良好的貯藏穩(wěn)定性。

圖10 ABLF分別在25 ℃（A）和4 ℃（B）貯藏條件下的SDS-PAGE穩(wěn)定性比較Fig.10 Comparison of the stability of ABLF at 25 (A) and 4 ℃ (B) by SDS-PAGE analysis

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分離純化制備了電泳純ABLF，并研究熱處理對(duì)魚類肝臟鐵蛋白穩(wěn)定性的影響。研究發(fā)現(xiàn)隨著熱處理溫度的升高（60～100 ℃），ABLF溶解度和鐵含量逐漸下降，并且其單分散性下降的同時(shí)伴隨著蛋白聚集體的增加。通過(guò)FTIR分析，熱處理過(guò)程中ABLF二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致了其溶解度、鐵含量和粒徑分布的改變。在升溫過(guò)程中，熱變性導(dǎo)致ABLF的α-螺旋中氫鍵斷裂發(fā)生解旋，α-螺旋相對(duì)含量降低，無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量增加，蛋白彈性和剛性結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致ABLF發(fā)生聚集形成溶解度較低的聚集體，溶解度下降并伴隨鐵含量的下降。而在60～80 ℃時(shí)，ABLF受溫度影響變化較小，說(shuō)明此溫度范圍內(nèi)ABLF的穩(wěn)定性相對(duì)較高。ABLF的鐵釋放速率在25～65 ℃條件下隨溫度的升高而增加，分析與其他鐵蛋白[32,38]一樣，ABLF的軸通道在較為溫和的條件下隨溫度升高而增大。此外，ABLF在4 ℃條件下的貯藏穩(wěn)定性大于25 ℃，主要原因是其不含具有絲氨酸蛋白酶活性EP肽段，因而其貯藏穩(wěn)定性高于植物鐵蛋白[39-41]。本研究豐富了熱處理對(duì)鐵蛋白穩(wěn)定性的研究，研究結(jié)果表明熱處理溫度導(dǎo)致ABLF二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變是影響其穩(wěn)定性的重要原因。由此可見，在選擇熱處理?xiàng)l件應(yīng)用于ABLF加工時(shí)，溫度應(yīng)盡量控制在80 ℃及以下，可以保持其穩(wěn)定性。以上發(fā)現(xiàn)將有利于鱘魚肝臟資源的綜合利用及鐵蛋白在食品加工領(lǐng)域的應(yīng)用。