肌紅蛋白血紅素輔基氧化修飾對(duì)肌球蛋白功能特性及凝膠特性的影響

朱宏星，高田毅，黃 楊，王 鑫，葛慶豐，王道營(yíng),*，孫 沖,*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127）

保水性是評(píng)價(jià)肉品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。肌球蛋白為鹽溶性蛋白，是肌肉中重要的蛋白成分也是形成凝膠的主要成分，對(duì)肉品的保水性起決定性作用[1]。肌球蛋白的分子形態(tài)為一個(gè)桿狀尾部和兩個(gè)球狀頭部，為不對(duì)稱結(jié)構(gòu)，形如“Y”狀，尾部主要由α-螺旋構(gòu)成。在凝膠形成過程中肌球蛋白會(huì)發(fā)生變性，結(jié)構(gòu)展開，蛋白聚合交聯(lián)形成有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。但是，凝膠形成過程極易受蛋白結(jié)構(gòu)變化影響，因此肌球蛋白結(jié)構(gòu)狀態(tài)與凝膠的保水性密切相關(guān)[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)蛋白氧化也與肉品保水性相關(guān)[3]：適度氧化有利于蛋白凝膠形成穩(wěn)定的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)，改善凝膠的功能特性，從而改善肉品質(zhì)地，提高肉品保水性；蛋白的過度氧化則會(huì)形成不利的凝膠結(jié)構(gòu)，降低肉品的品質(zhì)。

肌紅蛋白（myoglobin，Mb）是肉品的主要呈色物質(zhì)，由血紅素輔基和珠蛋白組成。血紅素輔基與珠蛋白之間具有較強(qiáng)的親合力，能夠穩(wěn)定Mb結(jié)構(gòu)[4]。在肉品儲(chǔ)藏與加工過程中，pH值、溫度、內(nèi)源酶等因素的變化都會(huì)對(duì)血紅素輔基與珠蛋白的結(jié)合力產(chǎn)生影響，從而造成Mb構(gòu)象改變，血紅素輔基暴露甚至從Mb中脫落[5-9]，脫落的血紅素輔基會(huì)對(duì)肉品品質(zhì)造成影響。血紅素輔基是肉品中重要的促氧因子，能顯著促進(jìn)氧化的發(fā)生[10]。目前，關(guān)于血紅素輔基功能特性的研究大都集中在血紅素輔基對(duì)脂質(zhì)的氧化作用，關(guān)于血紅素輔基促脂質(zhì)氧化的具體機(jī)理，通過如下過程發(fā)生：一方面，亞鐵血紅素自動(dòng)氧化成高鐵血紅素，生成過氧羥自由基（HOO·）在其誘導(dǎo)脂質(zhì)氧化過程中發(fā)揮重要作用[11-12]；另一方面，血紅素輔基釋放后通過疏水作用力吸附在肌肉細(xì)胞的磷脂膜上，或者血紅素輔基環(huán)上帶正電荷的丙酸酯能通過靜電作用吸附在帶負(fù)電的磷脂頭部從而參與氧化反應(yīng)[13]。前期研究發(fā)現(xiàn)血紅素輔基處理可以使肌球蛋白氧化，蛋白羰基含量上升，巰基交聯(lián)形成二硫鍵，導(dǎo)致肌球蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[14]。目前針對(duì)血紅素輔基對(duì)蛋白氧化的影響，進(jìn)而與肉品品質(zhì)關(guān)聯(lián)性的研究尚未有深入報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)探究血紅素輔基氧化處理導(dǎo)致肌球蛋白結(jié)構(gòu)的改變對(duì)肌球蛋白凝膠特性及保水性的影響，旨在為控制肉品氧化、改善肉品保水性提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三黃雞購自江蘇立華牧業(yè)股份公司；將雞暗處靜置過夜后殺雞快速取出胸肉（胸大肌）用于提取肌球蛋白。

血紅素輔基 美國(guó)Sigma公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、尿素、β-巰基乙醇（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FE20/FG2 pH計(jì)、AL電子天平 瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；T-25型數(shù)顯勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司；多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek儀器有限公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell垂直電泳系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；JS-680C全自動(dòng)凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司；UniCenMR臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Herolab公司；SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；NICOMP Z3000納米粒度電位儀美國(guó)PSS公司；MCR302旋轉(zhuǎn)流變儀 奧地利Anton Paar公司；TMS-TOUCH物性測(cè)定儀 美國(guó)FTC公司；MesoMR23-060H-1低場(chǎng)核磁共振成像與分析系統(tǒng) 蘇州紐邁分析儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

參考Hayakawa等[15]的方法并略作改動(dòng)。將新鮮雞胸肉置于冰浴中快速降溫，剔除筋膜和脂肪，切碎后與提取液A（0.5 mol/L KCl、0.1 mol/L KH2PO4、50 mmol/L K2HPO4、5 mmol/L EDTA-2Na、4 mmol/L焦磷酸鈉，pH 6.5）以1∶3（g/mL）混合，5 000hg冰浴條件下勻漿5 s。將勻漿液在冰浴條件下進(jìn)行超聲處理，超聲功率200 W，工作時(shí)間1 s，間隔時(shí)間3 s，超聲時(shí)長(zhǎng)10 min。將超聲后并已攪拌20 min的勻漿液離心（4 ℃、5 000hg、10 min），用三層紗布過濾得上清液。用10 倍體積的預(yù)冷超純水對(duì)濾液進(jìn)行稀釋，4 ℃條件下混勻靜置4 h后去除上清液得沉降物。將沉降物離心（4 ℃、8 000hg、10 min）得沉淀，沉淀與提取液B（0.3 mol/L KCl、20 mmol/L K2HPO4、20 mmol/L KH2PO4，pH 7.0）以1∶3（g/mL）混勻20 min，再離心（4 ℃、10 000hg、20 min）得上清液。上清液加10 倍體積的預(yù)冷超純水混勻，4 ℃靜置過夜后離心（4 ℃、8 000hg、10 min）除上清液，收集沉淀，即為粗肌球蛋白。粗肌球蛋白與透析液（0.6 mol/L KCl、20 mmol/L K2HPO4、20 mmol/L KH2PO4，pH 7.5）以1∶3（g/mL）溶解并于透析袋（mw=10 kDa）中透析16 h，得到的溶液10 000hg離心20 min，上清液即為肌球蛋白溶液。用雙縮脲法測(cè)定肌球蛋白的蛋白濃度。

提取的肌球蛋白的純度通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）系統(tǒng)測(cè)定。

1.3.2 血紅素輔基的配制

準(zhǔn)確稱取血紅素輔基粉末0.163 g，用30 mmol/L NaOH溶液配制成濃度為10 mmol/L儲(chǔ)備液，避光保存[16]。用磷酸鹽緩沖液（0.6 mol/L KCl、20 mmol/L K2HPO4、20 mmol/L KH2PO4，pH 7.5）將儲(chǔ)備液稀釋成濃度為0.4、1.0、1.5、3.0 mmol/L的血紅素輔基溶液，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 血紅素輔基介導(dǎo)肌球蛋白氧化體系的構(gòu)建

向肌球蛋白沉淀中等體積混合血紅素輔基溶液（濃度分別為0、0.4、1.0、1.5、3.0 mmol/L），4 ℃避光條件下孵育16 h，將氧化后的肌球蛋白混合液用20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L K2HPO4、20 mmol/L KH2PO4，pH 7.5）進(jìn)行稀釋，4 ℃、10 000hg離心20 min得到不同氧化程度的肌球蛋白沉淀[17]。實(shí)驗(yàn)所需肌球蛋白濃度通過磷酸鹽緩沖液（0.6 mol/L KCl、20 mmol/L K2HPO4、20 mmol/L KH2PO4，pH 7.5）調(diào)整。

1.3.4 血紅素輔基氧化修飾肌球蛋白凝膠的制備

調(diào)整不同氧化程度的肌球蛋白樣品質(zhì)量濃度為35 mg/mL，稱取相同體積蛋白樣品置于小燒杯中，用聚乙烯（polyethylene，PE）保鮮膜封口。將裝有蛋白樣品的燒杯置于水浴鍋內(nèi)，20 ℃恒溫20 min后，勻速升溫至85 ℃（升溫速率1.5 ℃/min），保溫20 min。加熱完成后，取出樣品在室溫條件下放置至常溫，然后于4 ℃貯存過夜備用。每個(gè)處理組平行3次。

1.3.5 肌球蛋白溶解度及粒徑的測(cè)定

根據(jù)Liu Ru等[18]的方法略作修改，確定肌球蛋白的溶解度。將5 mg/mL氧化肌球蛋白溶液在4 ℃、離心10 min，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定離心前后肌球蛋白的質(zhì)量濃度，溶解度按下式計(jì)算：

使用納米激光粒度分析儀測(cè)定肌球蛋白的粒徑。調(diào)整肌球蛋白溶液質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，檢測(cè)3次后進(jìn)行信息采集，每個(gè)樣品平行采集3次，取平均圖譜。

1.3.6 肌球蛋白乳化活性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

采用濁度法測(cè)定肌球蛋白的乳化性質(zhì)[19]。調(diào)整肌球蛋白質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，取4 mL置于離心管中，并加入1 mL大豆油，10 000hg均質(zhì)1 min，立即從距離心管底5 mm處取勻漿液50 μL，加入到5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的SDS溶液中，振蕩混勻后于500 nm處測(cè)定吸光度記為A0；靜置10 min后在相同的位置再次取勻漿液50 μL，加入到5 mL SDS溶液中，振蕩混勻后測(cè)定吸光度記為A10。以0.1% SDS溶液為空白對(duì)照，乳化活性和乳化穩(wěn)定性計(jì)算公式如下：

式中：A0、A10為乳狀液在500 nm處第0、10分鐘的吸光度；φ為乳化液的油體積分?jǐn)?shù)（φ=0.2）；C為乳化前的蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL）。

1.3.7 肌球蛋白流變特性

參考Diedericks等[20]的方法略作修改。取一定量的肌球蛋白溶液置于動(dòng)態(tài)流變儀的載物臺(tái)上，設(shè)置圓形平板與載物臺(tái)間距為1 000 μm，并用液體石蠟封住樣品。實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置如下：振動(dòng)頻率0.1 Hz，應(yīng)變力為2%，以2 ℃/min的升溫速率從20 ℃加熱到80 ℃。

1.3.8 肌球蛋白凝膠強(qiáng)度

取肌球蛋白凝膠樣品置于質(zhì)構(gòu)儀載物臺(tái)上，設(shè)置參數(shù)：應(yīng)變力0.1 N，測(cè)試速率30 mm/min，形變量50%，穿刺距離10 mm，室溫條件下測(cè)定[2]。

1.3.9 凝膠持水力（water-holding capacity，WHC）

采用離心法測(cè)定凝膠WHC[21]。將制備好的蛋白凝膠置于離心管后，4 ℃、10 000hg離心15 min，記錄離心前后離心管的質(zhì)量以及空離心管質(zhì)量。計(jì)算公式如下：

總而言之，GPS系統(tǒng)具有數(shù)據(jù)測(cè)量的高效性、準(zhǔn)確性和科學(xué)性，減少了工作流程中浪費(fèi)的大量人力、財(cái)力、物力?，F(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了GPS技術(shù)和地理信息系統(tǒng)的結(jié)合，二者的應(yīng)用也為人們的工作和生活帶來了極大的便利。在未來的日子里，研究人員還要不斷完善GPS技術(shù)，為各行業(yè)提供準(zhǔn)確有效的數(shù)據(jù)支持。

式中：m0為離心管的質(zhì)量/g；m1為離心前離心管與凝膠的總質(zhì)量/g；m2為離心后離心管與凝膠的總質(zhì)量/g。

1.3.10 肌球蛋白凝膠低場(chǎng)核磁共振測(cè)定

采用低場(chǎng)核磁共振成像與分析系統(tǒng)對(duì)肌球蛋白凝膠進(jìn)行測(cè)定以確定凝膠樣品的橫向弛豫時(shí)間（T2）[22]。將2 g樣品放入圓柱形玻璃管（直徑15 mm）中。參數(shù)設(shè)置如下：測(cè)量溫度32 ℃，質(zhì)子共振頻率22.6 MHz，使用25 mm線圈，r值為200 μs，等待時(shí)間為4 000 ms，脈沖個(gè)數(shù)為15 000，兩個(gè)峰值間隔為0.25 ms，掃描次數(shù)為16，反演迭代次數(shù)為100 000，采用CPMG序列進(jìn)行測(cè)量，每組3次平行。

1.3.11 肌球蛋白凝膠分子間作用力的測(cè)定

根據(jù)Yang Xiaoyu等[23]的方法并作修改，通過不同溶劑破壞肌球蛋白凝膠形成過程中的分子作用力。NaCl溶液（0.6 mol/L）破壞離子鍵，低濃度尿素（1.5 mol/L）可破壞氫鍵，高濃度尿素（8 mol/L）可同時(shí)破壞氫鍵和疏水相互作用，而β-巰基乙醇（0.5 mol/L）會(huì)破壞二硫鍵。將樣品分別溶解在以下溶劑中，以分析血紅素輔基誘導(dǎo)的肌球蛋白凝膠形成過程中不同分子作用的貢獻(xiàn)。選擇的4種溶劑為S1：0.6 mol/L NaCl；S2：0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素；S3：0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素；S4：0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+0.5 mol/Lβ-巰基乙醇。將樣品（0.5 g）溶解在5 mL的不同溶劑中，勻漿后離心（8 000hg、4 ℃、15 min）。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)量濃度。離子鍵、氫鍵、疏水作用和二硫鍵的貢獻(xiàn)分別以S1、S2-S1、S3-S2、S4-S3的溶解度表示。

1.3.12 肌球蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的觀察

參考Zheng Jiabao等[24]的方法用掃描電子顯微鏡在10 kV的掃描電壓下觀察肌球蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。將同樣大小的凝膠在液氮中快速冷凍，冷凍后的樣品通過真空冷凍干燥機(jī)干燥，將樣品截面朝上逐個(gè)粘貼在掃描電鏡樣品臺(tái)上，表面噴金鍍膜后于放大500 倍條件下觀察肌球蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，結(jié)果表示為 fs。數(shù)據(jù)分析采用軟件IBM SPSS Statistics 25.0，運(yùn)用單因素（方差分析法）ANOVA-Tukey對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素檢驗(yàn)分析，P＜0.05，差異顯著，采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 血紅素輔基對(duì)肌球蛋白溶解度及粒徑的影響

在肉品加工中處于高度溶解狀態(tài)的蛋白能表現(xiàn)出良好的保水性[25]。由圖1A可知，0.2～0.5 mmol/L血紅素輔基處理下，肌球蛋白溶解度基本無變化；血紅素輔基濃度繼續(xù)升高，肌球蛋白溶解度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，當(dāng)濃度提高至1.5 mmol/L，溶解度降低了28.13%。粒徑大小可用來表明肌球蛋白的聚集程度。由圖1B可知，肌球蛋白在添加血紅素輔基后，肌球蛋白的粒徑增大，血紅素濃度增加至1.0～1.5 mmol/L后，肌球蛋白的粒徑顯著增大（P＜0.05）。肌球蛋白溶解度與粒徑結(jié)果表明適度的氧化導(dǎo)致肌球蛋白交聯(lián)聚集，形成可溶性聚集體，肌球蛋白仍表現(xiàn)出良好的溶解狀態(tài)，但其平均粒徑有所增大。在高濃度氧化攻擊下，蛋白發(fā)生過度氧化，蛋白分子交聯(lián)聚集，大量不溶性的聚集體的形成降低了蛋白的溶解性并且導(dǎo)致了肌球蛋白平均粒徑顯著增大（P＜0.05）[26]。

圖1 血紅素輔基濃度對(duì)肌球蛋白溶解度（A）和粒徑（B）的影響Fig.1 Effect of hemin prosthetic group concentration on solubility (A) and particle size (B) of myosin

2.2 血紅素輔基對(duì)肌球蛋白乳化活性及乳化穩(wěn)定性的影響

乳化性可以通過乳化活性和乳化穩(wěn)定性表達(dá)，乳化活性反映了蛋白在水油界面的吸附能力，乳化穩(wěn)定性反映蛋白保持乳化體系中水油界面穩(wěn)定狀況的重要指標(biāo)[27]。如圖2所示，0.2～1.0 mmol/L血紅素輔基處理的肌球蛋白溶液乳化活性差異不顯著（P＞0.05）；當(dāng)血紅素輔基濃度在0.2～0.5 mmol/L之間時(shí)，肌球蛋白乳化穩(wěn)定性有所提高；當(dāng)血紅素輔基濃度達(dá)1.5 mmol/L時(shí)，乳化活性與乳化穩(wěn)定性顯著降低（P＜0.05）。肌球蛋白乳化特性結(jié)果表明低濃度血紅素輔基對(duì)肌球蛋白氧化程度不高，肌球蛋白部分解折疊，疏水基團(tuán)暴露有利于其在油滴表面形成穩(wěn)定的蛋白膜[28]，同時(shí)疏水氨基酸與親水、親油氨基酸暴露并相互影響，導(dǎo)致肌球蛋白乳化活性變化不顯著（P＞0.05）[29]；高濃度血紅素輔基處理下肌球蛋白過度氧化，變性程度加劇，分子交聯(lián)形成大量不溶性的蛋白聚集體，蛋白分子穩(wěn)定性降低，難以形成穩(wěn)定的界膜，同時(shí)蛋白與脂肪間的交聯(lián)能力降低，乳狀液分層加快，表現(xiàn)出乳化活性和乳化穩(wěn)定性的降低[30]。

圖2 血紅素輔基濃度對(duì)肌球蛋白乳化活性（A）和乳化穩(wěn)定性（B）的影響Fig.2 Effect of hemin prosthetic group concentration on emulsifying activity (A) and emulsion stability of myosin (B)

2.3 血紅素輔基對(duì)肌球蛋白凝膠流變學(xué)特性的影響

儲(chǔ)能模量（G’）又稱彈性模量，用來反映凝膠過程中的彈性部分，可以反映凝膠的質(zhì)構(gòu)及微觀結(jié)構(gòu)等性質(zhì)。損耗模量（G’’）代表凝膠的黏度，一般與G’的變化趨勢(shì)一致[31]。如圖3所示，不同濃度血紅素輔基處理后肌球蛋白G’和G’’的變化趨勢(shì)相似，且G’值始終高于G’’值，表明肌球蛋白的彈性及凝膠狀特性在黏彈性中占主導(dǎo)地位。未添加血紅素輔基的肌球蛋白，其G’值在53 ℃和60 ℃有2個(gè)轉(zhuǎn)變峰：53 ℃為肌球蛋白凝膠的形成期，此階段主要是肌球蛋白分子頭部的變性與聚合，隨后蛋白尾部解折疊，溫度升高使得低溫凝膠網(wǎng)絡(luò)被破壞，流動(dòng)性增強(qiáng)，G’值降低，隨著溫度繼續(xù)升高，肌球蛋白最終形成不可逆的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[16]。添加適量的血紅素輔基后（0.2～0.5 mmol/L），肌球蛋白第1個(gè)轉(zhuǎn)變峰不明顯，這可能是因?yàn)檠t素輔基氧化導(dǎo)致肌球蛋白結(jié)構(gòu)部分展開，從而削弱了肌球蛋白的頭部聚集，使得肌球蛋白在加熱初期的聚集模式由頭部聚集為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐晕膊拷宦?lián)為主[32]。隨后肌球蛋白G’值逐漸增大，原因主要是血紅素輔基氧化進(jìn)一步促進(jìn)了肌球蛋白分子解折疊，巰基氧化形成二硫鍵，蛋白分子發(fā)生交聯(lián)，最終形成了良好的網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu)；當(dāng)血紅素輔基濃度增加至1.5 mmol/L時(shí)，60 ℃峰幾乎消失，曲線變得平緩，這主要是由于高添加量的血紅素輔基造成肌球蛋白過度氧化變性，蛋白過度解折疊，疏水基團(tuán)嚴(yán)重暴露，同時(shí)蛋白大量聚集，蛋白穩(wěn)定性降低，不利于肌球蛋白加熱后進(jìn)一步交聯(lián)形成有序的三維網(wǎng)狀凝膠結(jié)構(gòu)。

圖3 血紅素輔基濃度對(duì)肌球蛋白流變學(xué)特性的影響Fig.3 Effect of hemin prosthetic group concentration on rheological properties of myosin

2.4 血紅素輔基對(duì)肌球蛋白凝膠強(qiáng)度的影響

通過熱誘導(dǎo)作用形成肌球蛋白凝膠，其蛋白的凝膠特性與保水性有關(guān)[33]。由圖4可知，隨著氧化程度加深，肌球蛋白凝膠強(qiáng)度發(fā)生顯著改變。低濃度血紅素輔基（0.2～0.5 mmol/L）處理的蛋白凝膠，其凝膠強(qiáng)度較未處理組顯著提高（P＜0.05）；而高濃度血紅素輔基（1.5 mmol/L）氧化處理后，其凝膠強(qiáng)度顯著下降（P＜0.05）。肌球蛋白凝膠強(qiáng)度結(jié)果表明：低濃度血紅素輔基對(duì)肌球蛋白凝膠的形成更為有利，這主要是由于適度氧化可以提高蛋白的溶解性，使蛋白結(jié)構(gòu)伸展，分子交聯(lián)形成可溶性聚合物，蛋白的凝膠特性得到改善，蛋白的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)強(qiáng)度得到提高。但過度氧化會(huì)使蛋白溶解度大大降低，由于蛋白的過度解旋，導(dǎo)致疏水基團(tuán)的大量暴露，分子聚集形成不溶性聚合物，溶脹不充分，不利于凝膠體系的形成[33]，這也與肌球蛋白流變學(xué)結(jié)果相符合。

圖4 血紅素輔基濃度對(duì)肌球蛋白凝膠強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of hemin prosthetic group concentration on gel strength of myosin gels

2.5 血紅素輔基對(duì)肌球蛋白凝膠持水性的影響

如圖5所示，添加0.2～0.5 mmol/L血紅素輔基后，肌球蛋白凝膠的持水性提高了14.42%；當(dāng)血紅素添加量提高至1.0～1.5 mmol/L后，肌球蛋白凝膠WHC顯著降低（P＜0.05）。持水性的結(jié)果表明適度氧化能夠增強(qiáng)肌球蛋白疏水相互作用，導(dǎo)致蛋白分子交聯(lián)聚集形成可溶性聚集體，這一變化有助于加熱過程中肌球蛋白尾部的有序聚集，形成規(guī)則的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提高肌球蛋白凝膠束縛水分的能力[34]；高濃度血紅素輔基的過度氧化則降低了肌球蛋白的溶解度，破壞了肌球蛋白的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，肌球蛋白發(fā)生變性并過度聚集形成大量不溶性的聚集體，不利于穩(wěn)定的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，對(duì)水分的截留能力弱，水分流失嚴(yán)重，保水能力差。

圖5 血紅素輔基濃度對(duì)肌球蛋白凝膠持水性的影響Fig.5 Effect of hemin prosthetic group concentration on water-holding capacity of myosin gels

2.6 血紅素輔基對(duì)肌球蛋白凝膠水分分布的影響

如圖6所示，肌球蛋白凝膠中4種狀態(tài)水分的橫向弛豫時(shí)間T2分別在0～5、8～30、147～534、1 417～3 765 ms之間，分別表示強(qiáng)結(jié)合水（T2b）、弱結(jié)合水（T21）、不易流動(dòng)水（T22）和自由水（T23）[35]。其中T22信號(hào)最強(qiáng)，T23其次，表明肌球蛋白凝膠中的水分主要以不易流動(dòng)水與自由水的形式存在。有關(guān)研究表明弛豫時(shí)間T2與凝膠中水分子的游離程度呈正相關(guān)，即弛豫時(shí)間越小，蛋白與水分子結(jié)合越緊密，水分自由度越低；反之弛豫時(shí)間越長(zhǎng)，則水分與蛋白結(jié)合力越弱，水分越容易流失[36]。添加了血紅素輔基的肌球蛋白，其T2弛豫時(shí)間和峰比例均發(fā)生了明顯變化：0.2～0.5 mmol/L血紅素輔基處理肌球蛋白凝膠后，T22和T23減小，不易流動(dòng)水峰面積比例P22顯著增高（P＜0.05）、自由水峰面積比例P23顯著降低（P＜0.05）；1.0～1.5 mmol/L血紅素輔基處理后肌球蛋白凝膠T2提高，不易流動(dòng)水峰面積比例P22顯著降低（P＜0.05），自由水峰面積比例P23顯著增高（P＜0.05）。這些結(jié)果說明了血紅素輔基適度氧化導(dǎo)致肌球蛋白更多極性基團(tuán)的暴露，水的親和力增強(qiáng)，有助于肌球蛋白形成密集有序的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，鎖住更多的水分，降低凝膠中水分的流動(dòng)性[37]，血紅素輔基高度氧化導(dǎo)致肌球蛋白結(jié)構(gòu)過度展開，大量的疏水基團(tuán)暴露出來，蛋白分子發(fā)生聚集，同時(shí)高度氧化導(dǎo)致肌球蛋白發(fā)生變性，穩(wěn)定性降低，不利于有序穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，自由水流動(dòng)性增強(qiáng)，表現(xiàn)出凝膠持水率的降低。

圖6 不同濃度血紅素輔基對(duì)肌球蛋白凝膠水分分布的影響Fig.6 Effect of hemin prosthetic group concentration on moisture distribution of myosin gels

2.7 血紅素輔基對(duì)肌球蛋白凝膠分子間相互作用的影響

凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是蛋白與蛋白、蛋白與水分子之間二硫鍵、氫鍵和疏水相互作用達(dá)到平衡的結(jié)果[38]。凝膠中添加不同的變性劑，能夠破壞維持凝膠穩(wěn)定的分子間作用力，提高蛋白的溶解度。在熱誘導(dǎo)肌球蛋白形成凝膠的過程中，熱可以破壞維持蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力，蛋白在變性再聚集過程中又形成了新的分子間作用力穩(wěn)定凝膠結(jié)構(gòu)[39]。由圖7所示，維持肌球蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的主要作用力為疏水相互作用和二硫鍵，添加了0.2 mmol/L血紅素輔基后，疏水相互作用和二硫鍵含量顯著增加（P＜0.05），當(dāng)血紅素輔基濃度提高至1.0 mmol/L后，蛋白凝膠中的疏水相互作用和二硫鍵含量開始降低。肌球蛋白凝膠分子間作用力的變化表明低濃度的血紅素輔基氧化導(dǎo)致蛋白疏水基團(tuán)與巰基部分暴露，疏水相互作用增強(qiáng)，游離巰基結(jié)合形成二硫鍵，此時(shí)蛋白開始聚集，肌球蛋白結(jié)構(gòu)在加熱前展開的程度更大，這有利于穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。而過度氧化使蛋白變性過度，結(jié)構(gòu)大量展開，蛋白分子間發(fā)生過度交聯(lián)聚集，肌球蛋白在加熱前已變形成大量的聚集體，這不利于熱誘導(dǎo)過程中蛋白分子的交聯(lián)，因此形成粗糙、無序、不穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

圖7 血紅素輔基濃度對(duì)肌球蛋白凝膠化學(xué)作用力的影響Fig.7 Effect of hemin prosthetic group concentration on chemical forces of myosin gels

2.8 血紅素輔基對(duì)肌球蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)肌球蛋白凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描電鏡研究有助于深入了解氧化對(duì)蛋白凝膠形成過程的影響[40]。肌球蛋白凝膠的狀態(tài)與蛋白持水性呈現(xiàn)相關(guān)性。未處理的肌球蛋白凝膠存在明顯的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖8A）；當(dāng)添加血紅素輔基濃度為0.2～0.5 mmol/L時(shí)（圖8B、C），肌球蛋白凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更為明顯，表面更平整，孔隙細(xì)膩且形狀規(guī)則均勻，結(jié)構(gòu)致密，有較好的成膠能力。致密均勻的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有助于水分的截留，這與凝膠的保水性結(jié)果一致；當(dāng)添加血紅素輔基濃度為1.0～1.5 mmol/L時(shí)（圖8D、E），蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)逐漸不清晰，結(jié)構(gòu)粗糙松散，孔隙變大，分布不均，肌球蛋白凝膠結(jié)構(gòu)發(fā)生斷裂。這一結(jié)果表明高濃度的血紅素輔基使肌球蛋白過度氧化，導(dǎo)致蛋白變性，結(jié)構(gòu)過度展開，蛋白分子間疏水性聚集導(dǎo)致蛋白過度交聯(lián)，阻礙了肌球蛋白熱誘導(dǎo)聚集交聯(lián)以及二硫鍵的形成，從而使蛋白膠束分布不均勻，不能形成良好的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，截留水分子的能力變?nèi)酰憩F(xiàn)出保水性降低的現(xiàn)象。

圖8 血紅素輔基濃度對(duì)肌球蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.8 Effect of hemin prosthetic group concentration on the microstructure of myosin gels

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，隨著血紅素輔基濃度的增加，肌球蛋白溶解度呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，粒徑增加，這是由于血紅素輔基氧化肌球蛋白造成蛋白結(jié)構(gòu)展開，蛋白分子發(fā)生聚集。低濃度血紅素輔基（0.2～0.5 mmol/L）處理后有助于提高肌球蛋白乳化穩(wěn)定性，改善肌球蛋白凝膠強(qiáng)度，同時(shí)提高凝膠中不易流動(dòng)水的比例，提升凝膠束縛水的能力；高濃度血紅素輔基（1.0～1.5 mmol/L）處理后，肌球蛋白結(jié)構(gòu)大量展開并過度聚集，肌球蛋白變性加劇，降低了蛋白的乳化特性，因此肌球蛋白凝膠呈現(xiàn)粗糙的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，凝膠保水性下降，凝膠品質(zhì)降低。在此基礎(chǔ)上，對(duì)血紅素輔基處理后肌球蛋白熱誘導(dǎo)凝膠形成過程中分子間作用力變化的研究表明，穩(wěn)定肌球蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的主要作用力為疏水相互作用和二硫鍵，適度氧化有利于肌球蛋白凝膠形成過程中疏水相互作用及二硫鍵的形成，凝膠網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定提高性；過度氧化的肌球蛋白在加熱前已大量聚集，不利于熱誘導(dǎo)過程中疏水相互作用以及二硫鍵的形成、分子的聚集以及穩(wěn)定有序的凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。