王藝月,姜竹茂,錢婧,戴俊健,章建浩*,嚴(yán)文靜*
1(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院,江蘇 南京,210095)2(煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺(tái),264005)
我國(guó)是漁業(yè)養(yǎng)殖大國(guó),由于魚肉質(zhì)鮮美,蛋白質(zhì)含量高,因此廣受消費(fèi)者喜愛。生鮮魚肉在貯藏、運(yùn)輸、加工及銷售過程中,易受微生物影響,造成品質(zhì)破壞進(jìn)而導(dǎo)致腐敗變質(zhì)[1]。普通市場(chǎng)常以整條活魚售賣,并不采用殺菌技術(shù);但一些生鮮超市則是切片售賣,需對(duì)魚片進(jìn)行包裝。盒裝生鮮魚片包裝后需結(jié)合冷鏈運(yùn)輸,但仍存在產(chǎn)品貨架期短且容易微生物超標(biāo)等問題,這些問題限制了行業(yè)的發(fā)展。因此需要對(duì)生鮮魚肉采取加工處理措施,以減少魚肉微生物污染,最終達(dá)到延長(zhǎng)其貨架期的目的。目前,魚肉保鮮常用的技術(shù)主要包括低溫貯藏、添加防腐劑、添加動(dòng)植物源保鮮劑等技術(shù)[2],這些技術(shù)存在保鮮效果不佳、成本高和化學(xué)殘留等問題。因此,尋找一種高效安全、價(jià)格低廉的新型保鮮方式尤為重要。
低溫等離子體(atmospheric cold plasma,ACP)是一種新型的冷殺菌技術(shù),處理過程中不會(huì)產(chǎn)生溫升,具有高效的抗菌特性,且作用后無殘留。ACP在放電過程中產(chǎn)生紫外線、帶電粒子及活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)、活性氮自由基等物質(zhì),這些活性物質(zhì)可以通過蝕刻作用、細(xì)胞膜穿孔與靜電干擾和細(xì)胞大分子氧化3個(gè)途徑,氧化微生物細(xì)胞膜表面的蛋白質(zhì)和脂質(zhì),造成細(xì)胞膜表面形成小孔,隨后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),誘導(dǎo)遺傳物質(zhì)中胸腺嘧啶二聚物的形成從而影響DNA的復(fù)制,最終導(dǎo)致微生物失活[3-4]。
目前利用ACP技術(shù)對(duì)生鮮魚肉的保鮮主要集中在海水魚,ALBERTOS等[5]利用ACP(70、80 kV,5 min)處理包裝后的鯡魚魚片,研究發(fā)現(xiàn)ACP技術(shù)可以減少鯡魚魚片中菌落總數(shù)、假單胞菌和腸桿菌,從而延長(zhǎng)其保鮮效果;汪春玲等[6]曾對(duì)比ACP(70 kV,60 s)和臭氧(0.6 mg/L,5 min)處理對(duì)氣調(diào)羅非魚保鮮品質(zhì)的影響,發(fā)現(xiàn)ACP抑制表面微生物繁殖效果更好,但是在一定程度上促進(jìn)了脂質(zhì)氧化反應(yīng)。淡水魚保鮮的研究相對(duì)較少,而淡水魚在我國(guó)漁業(yè)市場(chǎng)占比更大。同時(shí),組胺與魚肉其他品質(zhì)指標(biāo)之間存在一定關(guān)系,但針對(duì)兩者相關(guān)性的研究較少,因此需要探究組胺和多個(gè)品質(zhì)指標(biāo)之間的相關(guān)性,進(jìn)而對(duì)魚肉新鮮度進(jìn)行評(píng)價(jià)。組胺廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi),具有某些特定的生理功能,但攝入過量會(huì)造成食物中毒,從而影響身體健康[7]。目前有關(guān)組胺的研究多集中在其產(chǎn)生機(jī)制及毒理特性上,關(guān)于降低組胺產(chǎn)生的加工方式的報(bào)道較少。
系統(tǒng)研究ACP對(duì)淡水魚貯藏期間的殺菌效果及安全品質(zhì)影響對(duì)于該技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)以草魚為原料,探究不同電壓(40、50、60和70 kV)條件處理對(duì)貯藏期內(nèi)生鮮魚肉菌落總數(shù)、致病菌數(shù)量及理化品質(zhì)的影響,研究了組胺積累量與品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性,為等離子體技術(shù)在草魚等淡水魚的貯藏和加工等方面的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
草魚(鮮活,體表無傷,體重約為2 kg),南京蘇果超市;平板計(jì)數(shù)瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基,上海海博微生物科技有限公司;NaCl、丙三醇、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸(2-thiobarbituric acid reactive substance,2-TBA),均為分析純,上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;亞油酸、二硫蘇糖醇,均為分析純,南京壽德生物科技有限公司。
CPS-I型介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體設(shè)備,南京屹潤(rùn)等離子科技有限公司;Beckman Allegra 64R高速冷凍離心機(jī),美國(guó)Beckman公司;MAP-H360復(fù)合氣調(diào)保鮮包裝機(jī),蘇州森瑞保鮮設(shè)備有限公司;UV-2600 紫外分光光度計(jì),日本島津;數(shù)顯式pH計(jì),梅特勒-托利多儀器有限公司;IKA T18 basic高速勻漿機(jī),德國(guó)IKA公司;JA2203 N電子天平,上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;CR-400型全自動(dòng)測(cè)色色差儀,柯尼卡美能達(dá)控股公司。
1.3.1 低溫等離子體發(fā)生裝置
低溫等離子體發(fā)生裝置示意圖如圖1所示。包裝后的樣品置于2個(gè)鋁電極之間,上下電極分別連接到高壓電源和地線,并在電極和樣品之間插入聚乙烯介質(zhì)板。處理時(shí)2個(gè)電極板之間形成的高壓電場(chǎng),將包裝盒內(nèi)的空氣電離產(chǎn)生等離子體。此操作具有殺菌操作簡(jiǎn)單、工作效率高等優(yōu)點(diǎn)。
圖1 等離子體發(fā)生裝置Fig.1 Dielectic barrier discharge system
1.3.2 樣品準(zhǔn)備與處理
將新鮮草魚去除頭、鱗、尾和內(nèi)臟,用無菌水清洗干凈,沿魚脊椎剖成兩半,取背部魚肉。為結(jié)合實(shí)際,在實(shí)驗(yàn)中參考了超市中售賣的盒裝生鮮魚片的魚片厚度,將魚肉切成3 cm×4 cm×0.5 cm 的魚片樣品(約10 g),分5組,每個(gè)處理組30塊魚肉,所有組別均有3盒重復(fù)。隨后放入聚丙烯包裝盒中(155 mm×105 mm×35 mm),用包裝機(jī)進(jìn)行空氣密封包裝,魚肉(g)與盒內(nèi)空氣(cm3)的數(shù)值比為1.89,一些生鮮超市中包裝后的魚肉(g)與盒內(nèi)空氣(cm3)的數(shù)值比為1.72,兩者比例接近。試驗(yàn)組樣品分別用40、50、60和70 kV電壓處理3次(每次60 s,間隔時(shí)間30 s,處理頻率50 Hz);對(duì)照組樣品未經(jīng)等離子體處理。最后將所有的樣品存放于恒溫恒濕箱中(溫度:4 ℃,相對(duì)濕度:85%),每隔2 d 測(cè)量1次各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù),每次重復(fù)3次。
1.3.3 微生物數(shù)量的測(cè)定
參考國(guó)標(biāo)GB/T 9695.19—2008《肉與肉制品取樣方法》[8]的方法并略作修改,取樣時(shí)考慮到魚片堆疊位置不同,分別對(duì)不同堆疊位置的樣品進(jìn)行1∶1(g∶g)取樣混合后進(jìn)行試驗(yàn)。在無菌條件下,將10 g魚肉加入90 mL生理鹽水,均質(zhì)器拍打2 min后,制備1∶10(g∶mL)稀釋液,然后逐步稀釋。菌落總數(shù)按照GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)與菌落總數(shù)測(cè)定》[9];假單胞菌總數(shù)按照SN/T 4044—2014《出口肉及肉制品中假單胞菌屬的計(jì)數(shù)方法》[10];大腸桿菌總數(shù)參照孫艷等[11]的方法進(jìn)行。
1.3.4 pH的測(cè)定
稱取5 g魚肉絞碎,加入45 mL去離子水,用高速均質(zhì)機(jī)均質(zhì)30 s,過濾后取上清液,用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。
1.3.5 感官評(píng)價(jià)
每組3盒魚肉,4 ℃下每隔2 d取樣1次進(jìn)行感官分析。參考侯溫甫等[12]的生魚片感官評(píng)價(jià)方法,以魚肉氣味、色澤、組織形態(tài)及組織彈性為評(píng)價(jià)指標(biāo),5分為品質(zhì)最優(yōu),1分為品質(zhì)最差。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。
表1 生鮮魚肉感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Fresh grass fish fillet sensory evaluation standard
1.3.6 TBA值的測(cè)定
參考國(guó)標(biāo)GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定[13]。以樣品空白調(diào)節(jié)零點(diǎn),在532 nm處測(cè)定樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的吸光度值。在標(biāo)準(zhǔn)曲線中,橫坐標(biāo)為丙二醛濃度,縱坐標(biāo)為吸光度值。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品中的TBA值。
1.3.7 組胺含量的測(cè)定
組胺含量的測(cè)定方法參照GB/T 20768—2006《魚和蝦中有毒生物胺的測(cè)定 液相色譜-紫外檢測(cè)法》[14]進(jìn)行。
用SPSS 20.0 軟件對(duì)以上數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用鄧肯多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析(P> 0.05)差異不顯著,(P<0.05)差異顯著。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 9.0 軟件進(jìn)行繪圖。
菌落總數(shù)是評(píng)價(jià)其水產(chǎn)品品質(zhì)及貨架期的一個(gè)重要指標(biāo),當(dāng)菌落總數(shù)超過6 lgCFU/g時(shí),即認(rèn)為水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)[15],導(dǎo)致魚肉腐敗的微生物和酶不止存在于魚肉表面,但由于宰殺過程或暴露在空氣中造成的微生物污染主要集中在魚肉表面。由圖2-a可知,第0天時(shí)未處理組的菌落總數(shù)為5.0 lgCFU/g,等離子體處理后生鮮魚肉的菌落總數(shù)顯著降低(P<0.05),且隨著處理電壓增大呈現(xiàn)菌落總數(shù)顯著下降趨勢(shì)。經(jīng)40、50、60和70 kV電壓處理后,菌落總數(shù)分別減少0.3 lgCFU/g、0.4 lgCFU/g、0.8 lgCFU/g和1.0lgCFU/g。貯藏至4 d時(shí),對(duì)照組菌落總數(shù)達(dá)到6.2 lgCFU/g,處理組均未超過限量(6 lgCFU/g)限度。第6天時(shí),經(jīng)40 kV 和50 kV電壓處理后,樣品表面菌落總數(shù)分別為6.3 lgCFU/g和6.1 lgCFU/g,其余2組未超過限量。第8天時(shí),經(jīng)60 kV和70 kV電壓處理后的樣品表面菌落總數(shù)分別為6.2 lgCFU/g和6.1 lgCFU/g,結(jié)果表明低溫等離子體處理能有效抑制生鮮魚肉中微生物的生長(zhǎng)(P<0.05),延長(zhǎng)生鮮魚肉的貯藏期4 d。同時(shí)由于等離子體具有一定的穿透能力,也可作用于對(duì)魚肉品質(zhì)產(chǎn)生影響的內(nèi)源性酶[16-17],因此ACP技術(shù)可通過殺滅微生物和鈍化酶活力的共同作用,延長(zhǎng)生鮮魚肉貨架期。
假單胞菌是新鮮魚肉貯藏過程中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌[18]。本文研究了低溫等離子體對(duì)生鮮魚肉中假單胞菌的抗菌效果。如圖2-b所示,第0天時(shí),等離子體處理后生鮮魚肉中假單胞菌總數(shù)顯著降低(P<0.05),且電壓越高下降越多,其中70 kV處理組的假單胞菌總數(shù)為2.3 lgCFU/g,相比于對(duì)照組減少了1.2 lgCFU/g。由于假單胞菌是一種好氧微生物,因此貯藏4 d后其生長(zhǎng)呈現(xiàn)減緩的趨勢(shì)。在第8天時(shí),對(duì)照組假單胞菌菌落數(shù)為6.6 lgCFU/g,等離子體處理組分別為6.0 lgCFU/g、5.9 lgCFU/g、5.5 lgCFU/g和5.3lgCFU/g,說明等離子體處理能有效抑制生鮮魚肉中假單胞菌的生長(zhǎng)。
大腸桿菌是一種致病微生物,與捕撈、加工過程中的污染有關(guān)[19]。如圖2-c所示,第0天時(shí),對(duì)照組的大腸桿菌總數(shù)為2.7 lgCFU/g,經(jīng)等離子體處理后,數(shù)量明顯減少,且數(shù)量減少程度與處理電壓高低有關(guān),經(jīng)70 kV處理后減少最多,為1.1 lgCFU/g。當(dāng)貯藏至第8天時(shí),與對(duì)照組相比,處理組中的大腸桿菌菌落數(shù)分別降低了0.8 lgCFU/g、1.0 lgCFU/g、1.3 lgCFU/g、和1.5 lgCFU/g。說明等離子體處理能有效抑制生鮮魚肉中大腸桿菌的生長(zhǎng),這與之前的報(bào)道結(jié)果一致[20-21]。等離子體產(chǎn)生的活性成分可以與細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖和脂多糖發(fā)生碰撞,從而破壞C—O、C—N和C—C等結(jié)構(gòu)鍵[22]。這些活性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后,與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),使微生物死亡[16]。
圖2 不同電壓對(duì)貯藏期生鮮魚肉微生物數(shù)量的影響Fig.2 Effects of different voltages on microbial population values of grass carp fillets
表2 不同電壓對(duì)貯藏期生鮮魚肉pH的影響Table 2 Effects of different voltages on pH values of grass carp fillets
由10名經(jīng)過專門培訓(xùn)的評(píng)定人員逐項(xiàng)進(jìn)行打分,平均分?jǐn)?shù)如圖3所示。在貯藏過程中,所有組別的感官品質(zhì)分值隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而有所下降,這表明在貯藏期間魚肉的新鮮度在逐漸下降。在貯藏前2 d,處理組和對(duì)照組感官品質(zhì)分值無顯著差異(P> 0.05)。貯藏至第4天時(shí),對(duì)照組感官品質(zhì)分值為18.4±0.17,處理組分值分別為20.4±0.1、20.9±0.1、0.8±0.1和20.5±0.1,結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,處理組能更好地保持魚肉的感官特性。貯藏結(jié)束時(shí)(第8天),經(jīng)ACP處理的樣品總體評(píng)分高于對(duì)照組,相較于照組存在顯著差異(P<0.05)。從魚肉整體品質(zhì)的變化來看,等離子體處理在保持魚肉整體品質(zhì)方面具有優(yōu)勢(shì)。
圖3 不同電壓對(duì)貯藏期生鮮魚肉感官品質(zhì)評(píng)分的影響Fig.3 Effects of different voltages on the sensory evaluation of grass carp fillets
由于魚肉富含不飽和脂肪酸,易受到ROS的攻擊降解生成丙二醛,丙二醛和TBA會(huì)發(fā)生反應(yīng)生成粉色化合物;因此,TBA值一直以來被認(rèn)為是反映水產(chǎn)品脂肪氧化程度的重要指標(biāo)[26]。如圖4所示,對(duì)照組魚肉TBA的初始值為0.24 mg/kg。與對(duì)照組相比,40 kV等離子體處理后,魚肉TBA值并無顯著性差異(P>0.05);當(dāng)處理電壓超過50 kV時(shí),樣品的TBA值顯著升高(P< 0.05),且隨著處理電壓的增加,TBA值呈逐漸升高的趨勢(shì)。當(dāng)電壓達(dá)到70 kV時(shí),TBA值為0.3 mg/kg,與對(duì)照組相比增加了1.3倍。在整個(gè)貯藏期間,對(duì)照組及處理組的TBA值均呈上升趨勢(shì),且處理組TBA值始終高于對(duì)照組。在第8天時(shí),對(duì)照組的TBA值為0.6 mg/kg,與對(duì)照組相比,與經(jīng)40、50和60 kV 處理組樣品的TBA值無顯著差異(P>0.05),而70 kV處理組的TBA值增加了0.1 mg/kg(P<0.05)。這是由于CP處理過程中產(chǎn)生的自由基加速了過氧化物的產(chǎn)生,使得處理組TBA值較大增加[19]。根據(jù)GREENE等[27]的研究,當(dāng)鮮肉中TBA值大于0.6 mg/kg時(shí),會(huì)對(duì)肉的品質(zhì)產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)中,貯藏至第8天時(shí),各組TBA值均超過限度。
圖4 不同電壓對(duì)貯藏期生鮮魚肉TBA值的影響Fig.4 Effects of different voltages on the TBA of grass carp fillets
草魚肌肉組織中的氨基酸易受微生物產(chǎn)生的脫羧酶催化,發(fā)生脫羧反應(yīng)從而產(chǎn)生組胺[28]。國(guó)標(biāo)中規(guī)定水產(chǎn)品中組胺含量應(yīng)小于20 mg/100g[29]。經(jīng)不同電壓處理后,生鮮魚肉中組胺含量隨貯藏時(shí)間變化如圖5所示。由圖5可看出,魚肉中組胺含量隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸積累。對(duì)照組組胺含量增加速率較快,在第4天時(shí)達(dá)到22.8 mg/100g,超過國(guó)標(biāo)規(guī)定限量。經(jīng)ACP處理后的魚肉組胺含量顯著降低(P<0.05),處理電壓越高,組胺含量減少越多,并且在整個(gè)貯藏期中均未超過20 mg/100g。在貯藏初期,對(duì)照組和處理組組胺含量分別為(6.0±0.2)、(5.9±0.3)、(6.0±0.2)、(5.8±0.2)和(5.7±0.3) mg/100g。貯藏后期,ACP處理組的組胺含量增長(zhǎng)速率低于對(duì)照組。貯藏至第8天時(shí),處理組組胺含量遠(yuǎn)低于國(guó)標(biāo)規(guī)定,相比對(duì)照組分別減少了53.8%、58.1%、60.5%和66.6%,表明ACP處理能顯著降低魚肉中的組胺含量。微生物與水產(chǎn)品中大部分生物胺的產(chǎn)生與變化有很大的相關(guān)性[30]。因此經(jīng)ACP處理后,魚肉中與產(chǎn)生組胺相關(guān)的微生物顯著降低,從而導(dǎo)致貯藏期間ACP處理組組胺含量增加較為緩慢。
圖5 不同電壓對(duì)貯藏期聲響魚肉組胺含量的影響Fig.5 Effects of different voltages on histamine content of grass carp fillets
為探究貯藏過程中組胺含量變化與其他新鮮度品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)間的關(guān)系,根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果對(duì)其進(jìn)行皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析,結(jié)果如表3所示。在貯藏過程中,各組組胺含量與菌落總數(shù)、大腸桿菌總數(shù)、假單胞菌總數(shù)、pH、感官評(píng)價(jià)、TBA值均呈極顯著相關(guān)(P<0.01),說明組胺積累的同時(shí)會(huì)導(dǎo)致其他品質(zhì)指標(biāo)發(fā)生變化,這說明組胺含量可作為生鮮魚肉貨架期的參考指標(biāo)。同時(shí),其他品質(zhì)指標(biāo)的變化情況,也會(huì)為生鮮魚肉組胺安全性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。
表3 不同電壓處理后生鮮魚肉中組胺含量與各品質(zhì) 指標(biāo)的相關(guān)性Table 3 Correlation of content of histamines in grass carp fillets with each quality index with different voltages
本實(shí)驗(yàn)以草魚為對(duì)象,研究了低溫等離子體處理對(duì)生鮮魚肉殺菌效果及品質(zhì)的影響經(jīng)等離子體處理后,貯藏期間生鮮魚肉的微生物數(shù)量、理化指標(biāo)的變化,目的是探索該技術(shù)在水產(chǎn)品保鮮方面的可行性,得出以下結(jié)論:
(1)低溫等離子體處理可以有效抑制生鮮草魚肉中微生物的生長(zhǎng),并且隨著處理電壓的增大其抑菌抗菌效果增強(qiáng),當(dāng)電壓達(dá)到70 kV時(shí)可使菌落總數(shù)、假單胞菌總數(shù)和大腸菌群數(shù)數(shù)分別降低1.0 lgCFU/g、1.1 lgCFU/g和1.2 lgCFU/g。貯藏至第4天時(shí),對(duì)照組菌落總數(shù)達(dá)到6.2 lgCFU/g,經(jīng)40 kV和50 kV處理后的生鮮魚肉在第6天時(shí)超過閾值(6.0 lgCFU/g),分別為6.3 lgCFU/g和6.1 lgCFU/g;第8天時(shí),60 kV和70 kV處理組菌落總數(shù)超過限量。
(2)低溫等離子體處理可顯著降低貯藏期間生鮮魚肉中組胺含量,對(duì)照組組胺含量在第4天超過限量(20 mg/100g);生鮮魚肉的TBA值在可接受范圍內(nèi)會(huì)有所上升,在第8天時(shí)所有組別TBA值均超過限量;等離子體處理后魚肉的pH略有下降,但不會(huì)對(duì)魚肉的感官品質(zhì)產(chǎn)生顯著影響。
(3)組胺與其他品質(zhì)指標(biāo)之間存在極顯著相關(guān)性(P<0.01),由于生鮮魚肉感官品質(zhì)在可接受的食用范圍內(nèi)也可能存在組胺安全性風(fēng)險(xiǎn),因此對(duì)其安全性和品質(zhì)評(píng)價(jià)時(shí)可結(jié)合多個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)。
綜合分析,低溫等離子體處理能延長(zhǎng)生鮮魚肉貨架期4 d,并且對(duì)生鮮魚肉品質(zhì)不會(huì)產(chǎn)生顯著影響。由此可見,低溫等離子體冷殺菌技術(shù)不僅可應(yīng)用于生鮮草魚肉殺菌保鮮,同時(shí)在其他生鮮水產(chǎn)品安全及品質(zhì)控制方面也具有廣闊的應(yīng)用前景。