甘蔗渣酶解制糖工藝的建立與優(yōu)化

侯慶宇，楊前進(jìn)，金瑞，張濛，田康明，王正祥*

1(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，天津，300457)2(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)

甘蔗渣(sugarcane bagasse)是甘蔗制糖工業(yè)的主要固體副產(chǎn)物，聯(lián)合國糧農(nóng)組織2019年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全世界甘蔗渣產(chǎn)量達(dá)2.7億t，占甘蔗總產(chǎn)量的15%，我國甘蔗種植業(yè)每年約產(chǎn)生2 000萬t甘蔗渣[1-2]。以甘蔗渣為原料，開發(fā)生產(chǎn)動(dòng)物飼料[3]、生物質(zhì)板材[4]和綠色制漿造紙[5]等，已呈現(xiàn)廣闊應(yīng)用前景。甘蔗渣燃燒發(fā)電后的甘蔗渣灰，可用作砂漿或混凝土添加劑，增加抗壓強(qiáng)度[6-7]。有研究表明，經(jīng)化學(xué)修飾后的甘蔗渣對(duì)廢水中的金屬離子具有較好的吸附作用，有可能成為一類新型吸附劑[8]。但是，絕大部分的甘蔗渣仍被簡(jiǎn)單焚燒或丟棄，不僅對(duì)環(huán)境造成污染，對(duì)資源也是極大的浪費(fèi)。

與其他木質(zhì)生物質(zhì)相似，甘蔗渣的基礎(chǔ)組分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，經(jīng)水解可生成可發(fā)酵糖，能作為發(fā)酵生產(chǎn)乙醇、乳酸等大宗產(chǎn)品的原料[9-10]。水解甘蔗渣為可發(fā)酵糖的常用方法包括化學(xué)法和酶解法。其中，化學(xué)法主要包括酸法、堿法和離子液體法等。硫酸由于價(jià)格低廉且水解效果好，常用于酸法水解，但是酸水解過程中生成的糠醛等物質(zhì)會(huì)對(duì)后續(xù)發(fā)酵過程產(chǎn)生抑制作用[11]。堿法水解甘蔗渣可使甘蔗渣纖維內(nèi)部發(fā)生膨脹、化學(xué)鍵斷裂、生成孔隙，有利于后續(xù)水解的進(jìn)行[12]。但酸法和堿法直接制備可發(fā)酵糖存在諸多問題，如原料轉(zhuǎn)化率低、可發(fā)酵糖液需進(jìn)一步純化精制等。離子液體雖然對(duì)纖維素具有良好的溶解性，但因其成本過高，不能廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)[13]。酶解法具有高效、專一、作用條件溫和等特點(diǎn)，被視為最有應(yīng)用前景的生物質(zhì)糖化方法并得到廣泛研究[14]。酶法水解甘蔗渣為可發(fā)酵糖理論上應(yīng)配合使用纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶和蛋白酶等，具體需要就甘蔗渣酶解高效酶制劑篩選及其酶解工藝進(jìn)行系統(tǒng)研究。同時(shí)，降低酶制劑使用成本，也是甘蔗渣作為工業(yè)原料應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)亟待解決的關(guān)鍵問題[15-16]。

我國已經(jīng)能夠規(guī)?；a(chǎn)生物質(zhì)水解酶制劑，包括纖維素酶和木聚糖酶等。由于不同植物來源的生物質(zhì)的組成差異明顯，甘蔗渣中纖維素和半纖維素的組成和結(jié)構(gòu)存在一定特殊性，相關(guān)酶制劑的作用效果也存在一定差異性。為此，本文在分析現(xiàn)有商品酶制劑水解甘蔗渣效果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步尋找新的生物質(zhì)水解酶，通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化獲得酶的最優(yōu)組合，最大程度的提高甘蔗渣的酶解效率并建立酶解工藝，進(jìn)而通過發(fā)酵實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)所獲得的甘蔗渣水解糖直接用做工業(yè)發(fā)酵原料的可行性。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與菌種

甘蔗渣來自中國廣西某糖廠，由廣西科學(xué)院惠贈(zèng)。商品纖維素酶(500 000 U/g)、木聚糖酶(290 000 U/g)，江蘇銳陽生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母膏，英國OXOID公司；其他試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

β-葡萄糖苷酶、外切葡聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶等生產(chǎn)菌株，為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保藏，通過發(fā)酵法進(jìn)行酶液制備[17]。發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)乙醇生產(chǎn)菌種EscherichiacoliB0013-2012PA，為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保藏[18]。

1.2 儀器與設(shè)備

5 L離位磁力攪拌發(fā)酵罐，上海保興公司；UV-1200紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)公司；SBA-40X生物傳感分析儀，濟(jì)南延和公司；1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司。

1.3 甘蔗渣的預(yù)處理

將甘蔗渣粉碎后過40目篩，與15 g/L的NaOH按照固液比1∶10(g∶mL)混合，在115 ℃下反應(yīng)60 min，冷卻至室溫后用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0左右。

1.4 酶解方法與酶制劑的篩選

取1 g甘蔗渣預(yù)處理后置于100 mL三角瓶，加酶混合后置于50 ℃水浴振蕩器，在120 r/min下進(jìn)行酶解，定時(shí)取樣分析游離單糖的含量。

向甘蔗渣中加入50 U/g的商品纖維素酶和25 U/g 的商品木聚糖酶作為基礎(chǔ)和對(duì)照組，依次對(duì)β-葡萄糖苷酶、外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶進(jìn)行篩選。利用纖維素酶間的協(xié)同作用，在外切葡聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶篩選時(shí)加入水解效果好的β-葡萄糖苷酶。酶解方法同上，定時(shí)取樣分析游離單糖的含量。

1.5 甘蔗渣水解液發(fā)酵乙醇

用氨水將甘蔗渣水解液pH調(diào)至7.0后加入5 L發(fā)酵罐中，接入10%種子液，控制總體積為2.5 L，在37 ℃ 下開始發(fā)酵。生長階段控制攪拌轉(zhuǎn)速為200～800 r/min、空氣流速為3～7 L/min，培養(yǎng)5 h后關(guān)閉通氣轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵，控制攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min。定時(shí)取樣檢測(cè)葡萄糖、木糖和乙醇濃度，待葡萄糖消耗殆盡且乙醇不再增加時(shí)結(jié)束發(fā)酵。

1.6 分析方法

1.6.1 甘蔗渣組分分析

參考美國可再生能源實(shí)驗(yàn)室(National Renewable Energy Laboratory，NREL)的方法[19]，對(duì)甘蔗渣的組成成分進(jìn)行分析。

1.6.2 酶活力測(cè)定

內(nèi)切葡聚糖酶的酶活力測(cè)定采用黏度法[20]，酶活力定義：在50 ℃和pH 6.0條件下，以CMC-Na為底物，1 min內(nèi)降解1 mg CMC所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。外切葡聚糖酶的酶活力測(cè)定按照文獻(xiàn)[17]方法進(jìn)行，酶活力定義：在50 ℃和pH 5.0條件下，1 min內(nèi)水解CMC-Na產(chǎn)生1 μmol纖維二糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)。β-葡萄糖苷酶的酶活力測(cè)定，以10 mmol/L的纖維二糖為底物，在50 ℃、pH 5.0下反應(yīng)10 min，用生物傳感儀測(cè)定葡萄糖釋放量；酶活力定義：在50 ℃和pH 5.0條件下，1 min 內(nèi)水解纖維二糖反應(yīng)產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.6.3 發(fā)酵產(chǎn)物分析

發(fā)酵過程中定時(shí)取樣，生物傳感儀法檢測(cè)葡萄糖和乙醇含量，高效液相色譜法檢測(cè)木糖含量[21]。色譜柱選擇Prevail Carbohydrate ES 5u(250 mm×4.6 mm)，采用蒸發(fā)光檢測(cè)器，流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)=65∶35，流速為1 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量15 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 商品酶對(duì)甘蔗渣的水解作用

使用NREL推薦方法對(duì)甘蔗渣組分進(jìn)行分析，本研究使用的甘蔗渣樣本含纖維素41.8%、半纖維素21.8%、木質(zhì)素29.6%、灰分6.4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

利用商品纖維素酶和商品木聚糖酶分別對(duì)甘蔗渣進(jìn)行酶解，結(jié)果如圖1所示。隨著商品酶添加量的增加，甘蔗渣中纖維素和半纖維素的水解率也隨之上升。當(dāng)纖維素酶的添加量達(dá)到30 000 U/g甘蔗渣時(shí)，纖維素和半纖維素的水解率分別可達(dá)到90.65%(以葡萄糖計(jì))和97.89%(以木糖計(jì))(圖1-a)；當(dāng)木聚糖酶添加量為25 000 U/g甘蔗渣時(shí)，纖維素和半纖維素的水解率分別為92.84%(以葡萄糖計(jì))和97.32%(以木糖計(jì))，此時(shí)甘蔗渣中的纖維素和半纖維素幾乎被完全水解(圖1-b)?？梢?，在不考慮酶使用成本的前提下，現(xiàn)有商品纖維素酶和木聚糖酶皆可有效水解甘蔗渣；考慮使用成本，降低商品酶用量，則酶解效率和水解率大幅降低，其中纖維素的水解率降低尤為明顯，實(shí)現(xiàn)90%以上半纖維素、17%以上纖維素的水解需要20 000 U/g 的商品纖維素酶或1 000 U/g的商品木聚糖酶(圖1)。因同等活力的商品纖維素酶與商品木聚糖酶價(jià)格接近，故前者使用成本遠(yuǎn)高于后者?？梢?，找尋新的特別是針對(duì)甘蔗渣中纖維素水解的酶制劑并與現(xiàn)有商品酶復(fù)合使用，有可能從根本上解決甘蔗渣酶制劑的專業(yè)性和水解效率不足的問題，而本研究使用的商品木聚糖酶相對(duì)商品纖維素酶具有成本優(yōu)勢(shì)。

a-纖維素酶水解蔗渣；b-木聚糖酶水解蔗渣圖1 商品酶對(duì)甘蔗渣的水解作用Fig.1 Bagasse hydrolysis by commercial enzymes

2.2 甘蔗渣新酶的優(yōu)選

β-葡萄糖苷酶的主要底物為纖維二糖及纖維寡糖，可消除纖維素酶水解產(chǎn)物對(duì)纖維素酶的抑制作用，在纖維素水解中發(fā)揮重要且特殊的作用[22]。為此，以50 U/g商品纖維素酶和25 U/g商品木聚糖酶為基礎(chǔ)和對(duì)照組，對(duì)多種β-葡萄糖苷酶的協(xié)同水解作用進(jìn)行篩選，結(jié)果匯總于圖2。10種β-葡萄糖苷酶對(duì)商品酶水解纖維素皆有協(xié)同作用，以BgA的協(xié)同作用最好，葡萄糖釋放率較對(duì)照組提高了69.57%(2.34%/1.38%)。

圖2 β-葡萄糖苷酶的篩選Fig.2 Screening of β-glucosidases

外切葡聚糖酶從纖維素分子的末端水解釋放纖維二糖、葡萄糖和纖維寡糖，不同的外切葡聚糖酶的水解效率、底物結(jié)構(gòu)和產(chǎn)物形成種類等皆不同[23]。通過篩選，獲得3種具有較好協(xié)同水解作用的外切葡聚糖酶，其中CbhC的水解效果最好，葡萄糖釋放率較只添加BgA時(shí)提高了38.24%(3.29%/2.38%)(圖3)。

圖3 外切葡聚糖酶的篩選Fig.3 Screening of exo-glucanases

同樣，通過篩選獲得了16種內(nèi)切葡聚糖酶具有協(xié)同水解甘蔗渣纖維素的作用，其中EnglA、EglD和En3gA的作用最為明顯(圖4)。

圖4 內(nèi)切葡聚糖酶的篩選Fig.4 Screening of endoglucanases

2.3 酶組合與優(yōu)化

考慮用酶成本，以商品木聚糖酶(1 000 U/g)為基礎(chǔ)，進(jìn)一步確認(rèn)篩選得到的三類新酶與商品酶組合使用的協(xié)同效果，將BgA、CbhC、EnglA、En3gA和EglD 分別與商品酶復(fù)配，再進(jìn)行甘蔗渣水解實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 復(fù)合酶水解甘蔗渣結(jié)果Table 1 Bagasse hydrolysis by compound enzymes

可以看出，β-葡萄糖苷酶BgA與商品木聚糖酶復(fù)合水解時(shí)纖維素的水解率提高了16.52%，CbhC在與商品酶和BgA復(fù)合水解時(shí)纖維素的水解率較商品酶單獨(dú)作用時(shí)提高了22.68%，半纖維素水解率也分別提高了3.20%和4.43%。內(nèi)切葡聚糖酶在初期篩選時(shí)有一定的水解效果，但是當(dāng)商品酶的添加量增加后，重組內(nèi)切葡聚糖酶與商品酶復(fù)配時(shí)，兩者間的協(xié)同作用不明顯，這可能是由于商品酶制劑中內(nèi)切葡聚糖酶的占比多，當(dāng)商品酶的添加量增大時(shí)，內(nèi)切葡聚糖酶將纖維素長鏈水解為短鏈后，占比相對(duì)較少的外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶不足以將短鏈纖維素完全酶解成葡萄糖，此時(shí)反應(yīng)體系內(nèi)纖維二糖的積累會(huì)對(duì)酶解反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，降低酶解效率[24]?？梢姡?葡萄糖苷酶BgA和外切葡聚糖酶CbhC與本研究中使用的商品酶具有最優(yōu)的協(xié)同作用，而內(nèi)切葡聚糖酶的協(xié)同作用不顯著。

2.4 復(fù)合酶水解甘蔗渣工藝條件的優(yōu)化

在50 ℃和pH 5.0的條件下，水解甘蔗渣24 h，以商品木聚糖酶(1 000 U/g)為基礎(chǔ)，改變BgA的添加量，測(cè)定甘蔗渣中纖維素的水解率，結(jié)果如圖5-a所示。隨著BgA添加量的增加，纖維素的水解率也隨之升高；當(dāng)酶添加量為12 000 U/g時(shí)，纖維素水解率達(dá)到67.01%；繼續(xù)增加BgA添加量，水解率增幅減緩。以1 000 U/g商品酶和12 000 U/g BgA為基礎(chǔ)，改變CbhC的添加量，測(cè)定纖維素的水解率(圖5-b)。當(dāng)CbhC添加量為0.175 U/g時(shí)纖維素的水解率為 76.44%，繼續(xù)增加用酶量，水解率沒有明顯提高。在此水解條件下，甘蔗渣中纖維素的水解率較只添加1 000 U/g商品酶時(shí)提高了59.42%。

a-BgA的添加量;b-CbhC的添加量圖5 酶添加量對(duì)纖維素水解率的影響Fig.5 Effect of enzyme doses on hydrolysis rate of cellulose

在上述最優(yōu)酶添加量下，考察了不同酶解時(shí)間對(duì)酶解效率的影響，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)水解時(shí)間達(dá)到36 h后，半纖維素水解率可達(dá)到93.56%，此時(shí)纖維素的水解率為81.31%，這是由于半纖維素較纖維素更易溶于水或在水中發(fā)生溶脹，更易與酶發(fā)生水解反應(yīng)。繼續(xù)延長酶解時(shí)間，半纖維素的水解率增幅明顯減緩，而纖維素在60 h時(shí)水解率達(dá)到90.16%，延長酶解時(shí)間后水解率增幅減慢，因此選擇60 h為最適酶解時(shí)間。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)水解率的影響Fig.6 Effect of time on hydrolysis rate in enzymatic hydrolysis

至此，本研究獲得了可以與現(xiàn)有商品酶復(fù)合作用以提高甘蔗渣酶解效率的新酶分子及其最優(yōu)酶組合并對(duì)酶解工藝進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化的甘蔗渣酶解工藝：商品酶1 000 U/g、BgA 12 000 U/g和CbhC 0.175 U/g，在50 ℃、pH 5.0和120 r/min條件下水解60 h。此時(shí)甘蔗渣中纖維素的水解率為90.16%(以葡萄糖計(jì))，半纖維素的水解率為95.65%(以木糖計(jì))。在此復(fù)合酶的作用下，甘蔗渣中的纖維素和半纖維素均接近完全水解。

2.5 甘蔗渣水解液發(fā)酵生產(chǎn)乙醇

為檢驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝制得的甘蔗渣水解液不經(jīng)純化精制直接應(yīng)用于發(fā)酵的可行性，以其為碳源，在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖7所示。厭氧發(fā)酵階段消耗葡萄糖71.26 g/L，乙醇總產(chǎn)量為30.30 g/L，轉(zhuǎn)化率為42.52%，達(dá)到理論轉(zhuǎn)化率的82.92%；底物總轉(zhuǎn)化率為12.63 g/100g甘蔗渣。

本研究中采用的發(fā)酵菌種為木糖不代謝型[18]，菌種代謝葡萄糖為菌體和乙醇后，木糖幾乎全部保留在發(fā)酵液中，木糖回收率為99.52%?？稍趯⑵咸烟寝D(zhuǎn)化為乙醇的同時(shí)，從甘蔗渣酶解液中高效回收木糖，用于后續(xù)木糖的同步生產(chǎn)及木糖醇的制備[18]。

圖7 蔗渣水解液作為碳源發(fā)酵產(chǎn)乙醇Fig.7 Ethanol fermentation using bagasse hydrolysate as carbon source

3 結(jié)論

本研究揭示，β-葡萄糖苷酶BgA和外切葡聚糖酶CbhC對(duì)現(xiàn)有商品酶水解甘蔗渣具有最優(yōu)的協(xié)同作用效果，可大幅降低商品酶的添加量并顯著提高甘蔗渣的水解效率。使用本研究獲得的酶制劑及其酶解條件，所制得的甘蔗渣水解液可以直接作為發(fā)酵碳源，應(yīng)用于乙醇發(fā)酵和木糖同步回收。

4 致謝

廣西科學(xué)院為本研究提供了寶貴原材料和實(shí)驗(yàn)方法；俄羅斯科學(xué)院聯(lián)邦研究中心(Federal Research Centre of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia)的Pavel Volkov博士在本研究過程中給予了寶貴幫助，在此一并致以衷心的感謝。