參照多重PCR片段分析法進(jìn)行實時熒光PCR法對ABCB1三等位基因測定結(jié)果讀取方法的確定

張 燕 ，蒙卓成 ，邢 歡 ，崔小花 ，楊 柳 ，鄭 璇 ，戴尊孝

（1.西安市精神衛(wèi)生中心，陜西 西安 710100；2.西安市藥學(xué)（精神衛(wèi)生）重點(diǎn)實驗室，陜西 西安 710100

精神障礙是一種長期困擾患者的慢性疾病，治療時需要藥物在腦內(nèi)發(fā)揮作用，但因為血腦屏障的存在，藥物是難以進(jìn)入腦內(nèi)起到療效的。ABCB1是一種藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體［1-2］，它在人體大腦的毛細(xì)血管中廣泛表達(dá)［3-4］，可以影響p-糖蛋白活性［5］，而p-糖蛋白存在于血腦屏障中，在控制血液和大腦之間的物質(zhì)傳遞起著重要作用［6］，可以改變血組織屏障中擠壓回血液中的藥物數(shù)量［7-11］，影響藥物濃度［12-14］，從而影響藥物的療效。本研究中的ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體主要涉及抗精神病藥物腦內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)問題。ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因突變會影響其轉(zhuǎn)運(yùn)功能［15-16］，使藥物無法正常發(fā)揮療效，其中rs2032582是研究最廣泛的突變位點(diǎn)［17］，通常會存在三等位基因，本研究主要針對rs2032582位點(diǎn)的突變（C.2677T＞G），雖然三等位基因存在比例較低，但影響不容忽視。

實時熒光PCR法操作簡單、人為誤差小，是目前臨床上的主流檢測方法，對于等位基因的檢測結(jié)果，實時熒光PCR法可準(zhǔn)確判讀。但由于ABCB1存在三等位基因，采用實時熒光PCR法會在結(jié)果讀取方面存在一定困難。多重PCR片段分析可以得到整個序列的直接信息，具有較高的準(zhǔn)確度，是直接有效檢測基因突變的方法［18］，該方法具有測序精度高、測序長度長等特點(diǎn)；不足之處在于其成本高、通量低、耗時長［19］。故本研究采用多重PCR片段分析法作為對照方法，將實時熒光PCR法的結(jié)果讀取方法進(jìn)行明晰，以期實現(xiàn)臨床對ABCB1三等位基因準(zhǔn)確、簡便且低廉的檢測。

1 材料與方法

1.1 樣本

收集西安市精神衛(wèi)生中心2020年3月-2021年3月ABCB1樣本2 794例，按照t檢驗中對樣本數(shù)量的規(guī)定，在理想狀態(tài)下，樣本數(shù)多于120，認(rèn)為其具有正態(tài)分布特征，可以代表群體樣本。根據(jù)120個樣本在所收集的樣本中占比接近5%，且考慮到實驗過程中誤差或樣本脫落，故按照5%的比例進(jìn)行抽樣，即抽取樣本139例，認(rèn)為此抽樣方式能代表樣本的分布情形。

1.2 試劑與儀器

Taq Man rs2032582 T試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司）；Taq Man rs2032582 A試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司）；SNPscanTM分型試劑盒（蘇州天昊生物科技有限公司）；HI-DI（美國ABI公司）；Gen?eScanTM-500（美國ABI公司）。

StepOne Plus實時熒光PCR分析儀（賽默飛世爾科技有限公司）；FR-110紫外分析裝置（上海復(fù)日科技有限公司）；凝膠成像儀（上海復(fù)日科技有限公司）；FR-250電泳儀（上海復(fù)日科技有限公司）；多用途水平電泳槽（北京百晶生物科技有限公司）；BG-Power 300電泳儀（北京百晶生物科技有限公司）；BG-submix cell電泳槽（北京百晶生物科技有限公司）；2720 Thermal CyclerPCR分析儀（美國ABI公司）；Milli-Q Academic超純水儀（美國Millipore公司）；ABI3730XL測序儀（美國ABI公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時熒光PCR法

配制 10 μL 反應(yīng)體系，包括 Master Mix 5 μL，DME assay Mix 0.25 μL，去離子水3.75 μL，DNA樣本1 μL［20］。上PCR儀，擴(kuò)增程序為：60℃、30 s，95℃、10 min，進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)（95℃、15 s，60℃、1.5 min），循環(huán)40次，60℃、30 s，反應(yīng)結(jié)束，輸出結(jié)果［21-23］。

1.3.2 多重PCR片段分析法

樣本擴(kuò)增：配制10 μL連接反應(yīng)預(yù)混合液，包括10×Ligase Buffer 2 μL，Ligase 0.5 μL，Probe Mix 1 μL，去離子水6.5 μL。進(jìn)行連接反應(yīng)，在1 μL DNA樣本中加入10 μL連接反應(yīng)預(yù)混合液，輕微震蕩混勻，3 000 r/min離心30 s，然后上PCR儀，94℃、1 min，58℃、4 min，循環(huán)4次，94℃、2 min，最后降溫至72℃結(jié)束連接反應(yīng)。

多重?zé)晒釶CR反應(yīng)［24］：配制20 μL反應(yīng)體系，包括2×PCR Master Mix 10 μL，Primer Mix Ⅰ or Ⅱ 1 μL，樣本擴(kuò)增溶液1 μL，去離子水8 μL，輕微震蕩混勻，3 000 r/min離心30 s，然后上PCR儀，95℃、2 min。第一次PCR反應(yīng)：94℃、20 s，62℃、40 s，72℃、1.5 min，循環(huán)9次。第二次PCR反應(yīng)：94℃、20 s，57℃、40 s，72℃、1.5 min，循環(huán)25次，68℃、60 min，最后降溫至4℃結(jié)束多重?zé)晒釶CR反應(yīng)［25］。

片段測序：將多重?zé)晒釶CR產(chǎn)物稀釋10倍后，取1 μL與0.5 μL Liz 500 Size Standard、8.5 μL Hi-Di混勻，95℃、5 min，上測序儀測定。

1.4 統(tǒng)計方法

實時熒光PCR的結(jié)果采用StepOne Software v2.2.3進(jìn)行處理，分別以循環(huán)數(shù)和熒光強(qiáng)度值的對數(shù)作為橫縱坐標(biāo)并繪制擴(kuò)增曲線，數(shù)據(jù)分析采用擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期對應(yīng)的Ct值進(jìn)行對比分析；多重PCR片段分析的結(jié)果采用GeneMapper 6進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)分析采用堿基峰位圖中對應(yīng)的研究峰位進(jìn)行對比分析。

2 結(jié) 果

2.1 實時熒光PCR法與多重PCR片段分析法讀取結(jié)果

139例樣本中，包括120例等位基因及19例三等位基因。實時熒光PCR法與多重PCR片段分析法對120例等位基因樣本的讀取結(jié)果完全一致。兩種方法對19例三等位基因樣本的讀取結(jié)果見表1。

表1 實時熒光PCR法與多重PCR片段分析法對三等位基因分析結(jié)果

2.2 三等位基因讀取結(jié)果的確定

采用實時熒光PCR法測定19例ABCB1三等位基因的結(jié)果，以多重PCR片段分析結(jié)果作為對照進(jìn)行解讀，將Ct值（PCR擴(kuò)增進(jìn)入指數(shù)增長期所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)）作為實時熒光PCR讀取依據(jù)，重新確定ABCB1三等位基因的分型結(jié)果。

2.2.1 T/A/G基因分型讀取結(jié)果的確定

2.2.1.1 T/A/G基因分型判讀為G/G型

圖1中，圖1a中G堿基與T堿基Ct值分別為21和23，圖1b中G堿基與A堿基Ct值分別為21和24，Ct值小的堿基含量高。圖1a△Ct.a（∣Ct.G－Ct.T∣）=2，圖1b△Ct.b（∣Ct.G－Ct.A∣）=3，兩圖△Ct值的差值＜3（∣△Ct.a－△Ct.b∣=1），故將圖1a和圖1b中含量高的堿基組合作為判讀結(jié)果，判讀基因型為G/G型。

圖1c中，175.78位置的G堿基峰遠(yuǎn)高于175.01位置的T堿基峰，173.84位置幾乎沒有A堿基峰，故判讀基因型為G/G型。

圖1 T/A/G基因分型判讀為G/G型兩種方法對比圖

2.2.1.2 T/A/G基因分型判讀為T/G型

圖2中，圖2a中G堿基與T堿基Ct值分別為23和19，圖2b中G堿基與A堿基Ct值分別為21和24，Ct值小的堿基含量高。圖2a△Ct.a（∣Ct.G－Ct.T∣）=4，圖2b△Ct.b（∣Ct.G－Ct.A∣）=3，兩圖△Ct值的差值＜3（∣△Ct.a－△Ct.b∣=1），故將圖2a和圖2b中含量高的堿基組合作為判讀結(jié)果，判讀基因型為T/G型。

圖2c中，175.78位置的G堿基峰等高于175.01位置的T堿基峰，173.84位置幾乎沒有A堿基峰，故判讀基因型為T/G型。

圖2 T/A/G基因分型判讀為T/G型兩種方法對比圖

2.2.1.3 T/A/G基因分型判讀為T/A型

圖3中，圖3a中G堿基與T堿基Ct值分別為25和21，圖3b中G堿基與A堿基Ct值分別為27和21，Ct值小的堿基含量高。圖3a△Ct.a（∣Ct.G－Ct.T∣）=4，圖3b△Ct.b（∣Ct.G－Ct.A∣）=6，兩圖△Ct值的差值＜3（∣△Ct.a－△Ct.b∣=2），故將圖3a和圖3b中含量高的堿基組合作為判讀結(jié)果，判讀基因型為T/A型。

圖3c中，明顯存在175.01位置的T堿基峰和173.84位置的A堿基峰，幾乎沒有175.78位置的G堿基峰，故判讀基因型為T/A型。

圖3 T/A/G基因分型判讀為T/A型兩種方法對比圖

2.2.2 G/T/A基因分型讀取結(jié)果的確定

2.2.2.1 G/T/A基因分型判讀為A/A型

圖4中，圖4a中G堿基與T堿基Ct值分別為25和22，圖4b中G堿基與A堿基Ct值分別為26和20，Ct值小的堿基含量高，但圖4a△Ct.a（∣Ct.G－Ct.T∣）=3，圖4b△Ct.b（∣Ct.G－Ct.A∣）=6，兩圖△Ct值的差值=3（∣△Ct.a－△Ct.b∣=3），故此種情況認(rèn)為Ct值最小的A堿基具有絕對優(yōu)勢。當(dāng)∣△Ct.a－△Ct.b∣=3，將圖4a和圖4b中含量最高的堿基純合型作為判讀結(jié)果，判讀基因型為A/A型。

圖4c中，明顯存在173.84位置的A堿基峰，幾乎沒有175.01位置的T堿基峰和175.78位置的G堿基峰，故判讀基因型為A/A型。

圖4 G/T/A基因分型判讀為A/A型兩種方法對比圖

2.2.2.2 G/T/A基因分型判讀為T/A型

圖5中，圖5a中G堿基與T堿基Ct值分別為22和19，圖5b中G堿基與A堿基Ct值分別為24和19，Ct值小的堿基含量高。圖5a△Ct.a（∣Ct.G－Ct.T∣）=3，圖5b△Ct.b（∣Ct.G－Ct.A∣）=5，兩圖△Ct值的差值＜3（∣△Ct.a－△Ct.b∣=2），故將圖5a和圖5b中含量高的堿基組合作為判讀結(jié)果，判讀基因型為T/A型。

圖5c中，明顯存在175.01位置的T堿基峰和173.84位置的A堿基峰，幾乎沒有175.78位置的G堿基峰，故判讀基因型為T/A型。

圖5 G/T/A基因分型判讀為T/A型兩種方法對比圖

2.2.3 G/A/T基因分型讀取結(jié)果的確定

圖6中，圖6a中G堿基與T堿基Ct值分別為30和19，圖6b中G堿基與A堿基Ct值分別為24和21，Ct值小的堿基含量高，但圖6a△Ct.a（∣Ct.G－Ct.T∣）=11，圖6b△Ct.b（∣Ct.G－Ct.A∣）=3，兩圖△Ct值的差值＞3（∣△Ct.a－△Ct.b∣=8），故此種情況認(rèn)為 Ct值最小的 T堿基具有絕對優(yōu)勢。當(dāng)∣△Ct.a－△Ct.b∣≥3，將圖6a和圖6b中含量最高的堿基純合型作為判讀結(jié)果，判讀基因型為T/T型。

圖6c中，明顯存在175.01位置的T堿基峰，幾乎沒有173.84位置的A堿基峰和175.78位置的G堿基峰，故判讀基因型為T/T型。

圖6 G/A/T基因分型判讀為T/T型兩種方法對比圖

3 討 論

通過對19例ABCB1三等位基因樣本進(jìn)行兩種方法判讀結(jié)果的對比，總結(jié)出實時熒光PCR法檢測ABCB1基因的讀取原則：當(dāng)∣∣Ct.G－Ct.T∣－∣Ct.GCt.A∣∣＜3時，分別讀取兩組堿基實時熒光PCR擴(kuò)增曲線圖中Ct值最小的堿基，將其組合形成判讀結(jié)果。當(dāng)∣∣Ct.G－Ct.T∣－∣Ct.G－Ct.A∣∣≥3，讀取兩組堿基實時熒光PCR擴(kuò)增曲線圖中Ct值最小的堿基，其純合型即為判讀結(jié)果。

根據(jù)讀取原則，將19例三等位基因的實時熒光PCR法結(jié)果重新判讀，結(jié)果修正為：1例G/G，1例A/A，4例T/G，5例T/A，8例T/T，與多重PCR片段分析法判讀結(jié)果一致。

在人體中，三等位基因的存在比例相對較低，本研究中的樣本比例組成也可體現(xiàn)這一點(diǎn)。但當(dāng)人體內(nèi)存在三等位基因且存在的堿基突變比例較高時，突變的堿基在進(jìn)行基因表達(dá)時或許會占優(yōu)勢，人體的相關(guān)功能就會受到影響。存在這種高比例的堿基突變時，實時熒光PCR檢測方法不能明確判斷哪個堿基占優(yōu)勢，所以不便出具基因報告。

在判斷何種堿基占優(yōu)勢時，可觀察實時熒光PCR擴(kuò)增曲線的Ct值，Ct值越小，相應(yīng)堿基的含量所占比例較高。但當(dāng)存在三等位基因時，一個位點(diǎn)會存在三個堿基，就會有兩種不同的擴(kuò)增曲線圖，在判斷何種堿基占優(yōu)勢時，就要結(jié)合兩個擴(kuò)增曲線圖進(jìn)行對比分析，分析比較兩圖之間的△Ct值的差值。在擴(kuò)增曲線圖中，當(dāng)堿基進(jìn)入指數(shù)增長期，每進(jìn)行一個循環(huán)，堿基的量便會翻番，當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)進(jìn)行3次以后，堿基的量會相差23倍，這時就可以判斷何種堿基在表達(dá)時占絕對優(yōu)勢。所以，在本研究中，當(dāng)兩者擴(kuò)增曲線的△Ct值相差3及3以上，均判讀為Ct值最小的堿基為純合子；當(dāng)兩者擴(kuò)增曲線的△Ct值相差3以下，分別讀取兩組實時熒光PCR擴(kuò)增曲線圖中Ct值小的堿基，將其組合形成雜合子。

隨著技術(shù)不斷進(jìn)步，實時熒光PCR技術(shù)與其他分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合使定量極微量的基因表達(dá)成為可能，熒光標(biāo)記核酸化學(xué)技術(shù)和寡核苷酸探針雜交技術(shù)的發(fā)展以及實時熒光PCR技術(shù)的應(yīng)用，使得實時熒光PCR技術(shù)有一個足夠的基礎(chǔ)為廣大臨床診斷實驗室所接受［26-27］，未來實時熒光PCR法有望成為進(jìn)行基因檢測研究的主要工具。