基于GEO數(shù)據(jù)庫構(gòu)建精神分裂癥miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

何 梅，游 旭，楊云斌，李艷萍，張麗芬，盧自祥，張云橋，龍 青，馬 曉，曾 勇*

（1.紅河州第二人民醫(yī)院，云南 紅河 654300；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院，云南 玉溪 653100

精神分裂癥是一種臨床表現(xiàn)復(fù)雜、多種因素所致的嚴(yán)重的慢性精神疾?。?］。研究顯示，異常的神經(jīng)傳遞與精神分裂癥的大部分臨床癥狀有關(guān)［2］。而小型非編碼 RNA（Small non-coding RNA，miRNA）與疾病的病理機制密切相關(guān)［3-5］，這種只有20～22個核苷酸的miRNA作為表觀遺傳之一，不僅在哺乳動物的腦組織內(nèi)廣泛參與基因的表達［6］，而且它作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子積極參與各種疾病的基因表達過程［7-8］。研究表明，miRNA與神經(jīng)精神疾病（如精神分裂癥）具有很強的關(guān)聯(lián)性［9-10］。雖然國內(nèi)外對精神分裂癥的病因研究（如遺傳基因多態(tài)性、差異基因表達水平、神經(jīng)影像等）積累了很多研究成果，但是至今精神分裂癥的診斷仍然依賴于癥狀學(xué)，有別于其他疾病可以采用病理、檢驗、影像等輔助手段作出客觀的診斷。而在實際臨床工作中，醫(yī)務(wù)人員的診療水平以及患者癥狀的時空變化可能會造成對精神分裂癥的誤診或漏診。因此，迫切需要識別出精神分裂癥客觀的分子診斷標(biāo)志物以及揭示疾病發(fā)病的分子調(diào)控機制，為其早期的準(zhǔn)確診斷和治療提供客觀依據(jù)。當(dāng)今，生物信息學(xué)是利用計算機和專用軟件，從整體層面揭示疾病發(fā)生機制的研究方法［11］。而GEO數(shù)據(jù)庫是由美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Informa?tion，NCBI）建立，可免費提供大量的基因表達數(shù)據(jù)，例如芯片和高通量測序基因表達數(shù)據(jù)集。本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫中精神分裂癥患者和健康對照樣本（腦組織和外周血）的比較，整合生物信息學(xué)方法篩選出差異表達基因，并構(gòu)建可能導(dǎo)致精神分裂癥發(fā)生的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以期闡明疾病的發(fā)生過程，為精神分裂癥分子遺傳學(xué)發(fā)病機制的探索提供參考。

1 資料和方法

1.1 資料獲取

通過NCBI網(wǎng)站中GEO Datasets進入GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds），檢索“miRNA AND schizophrenia”，限制研究種屬為Homo sapiens，篩選出GPL16016平臺所提供的GSE54578數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集的研究對象為15例健康對照組和15例精神分裂癥患者的外周血單核細胞；同樣，在GEO數(shù)據(jù)庫搜索精神分裂癥患者死后大腦組織樣本中mRNA的表達數(shù)據(jù)集，篩選出GPL6244平臺所提供的GSE145554數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集的研究對象為12例精神分裂癥患者和12例健康對照組的死后大腦扣帶回錐體神經(jīng)細胞（淺層皮質(zhì)和深層皮質(zhì)）。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血中差異表達miRNA的識別

利用GEO數(shù)據(jù)庫中的GEO2R在線分析工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r）識別精神分裂癥外周血中差異表達的miRNA，篩選條件限制為P＜0.05和|logFC|＞1，logFC＜0的差異基因為下調(diào)的基因，而logFC＞0的差異基因為上調(diào)的基因。按照P值以及差異倍數(shù)識別miRNA的差異表達情況。

1.2.2 差異表達miRNA下游靶向基因和上游轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測

FunRich在線軟件工具（http：//www.funrich.org/）可以提供如轉(zhuǎn)錄因子、生物學(xué)過程、細胞組成成分、分子功能和蛋白質(zhì)互作功能等注釋。本研究利用該軟件分別獲取差異表達miRNA的下游靶向基因和上游轉(zhuǎn)錄因子的信息。

1.2.3 大腦組織樣本中差異表達mRNA數(shù)據(jù)處理

利用GEO2R分別對淺層和深層的錐體神經(jīng)細胞mRNA表達值進行差異表達分析，納入差異表達mRNA的標(biāo)準(zhǔn)參照提供數(shù)據(jù)集的原始論文：P＜0.05、logFC＞0為上調(diào)的差異基因，logFC＜0為下調(diào)的差異基因［12］。

1.2.4 目標(biāo)mRNA的確定

鑒于miRNA具有抑制或降解其靶向mRNA的生物學(xué)功能，將外周血上調(diào)的miRNA所預(yù)測的靶向基因與大腦樣本中下調(diào)的基因取交集基因，下調(diào)miRNA所預(yù)測的靶向基因與大腦樣本中上調(diào)的基因取交集基因，最終將交集基因確定為目標(biāo)mRNA。

1.2.5 目標(biāo)mRNA的GO和KEGG通路富集分析

基因本體論（Gene Ontology，GO）是一種對生物數(shù)據(jù)信息整合和利用的重要工具，其涵蓋3個經(jīng)典領(lǐng)域：生物過程、細胞成分和分子功能；京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）是研究基因組、生物途徑、疾病、化學(xué)品和藥物的高層次功能數(shù)據(jù)庫；利用Omicshare在線工具（https：//www.omicshare.com/）對目標(biāo)mRNA進行GO注釋和KEGG通路富集分析以揭示目標(biāo)mRNA所參與的人體生物學(xué)功能以及富集的重要通路。

1.2.6 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)與miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

利用String在線軟件（https：//string-db.org/）構(gòu)建目標(biāo)mRNA的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（Proteinprotein interaction network，PPI）信息，將各蛋白映射至String數(shù)據(jù)庫，在綜合得分≥0.15的條件下建立互作網(wǎng)絡(luò)，具有互作關(guān)系的目標(biāo)mRNA被認(rèn)為在精神分裂癥的發(fā)病機制中可能存在更強的關(guān)聯(lián)，最終構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié) 果

2.1 芯片數(shù)據(jù)中差異表達miRNA的識別

采用GEO2R在線工具對GSE54578數(shù)據(jù)集中15例健康對照組和15例精神分裂癥患者的外周血單核細胞miRNA表達值進行差異分析，共識別出29個顯著差異表達的上調(diào)miRNA，其中前10個上調(diào)miRNA的差異倍數(shù)和P值見表1。

表1 外周血單核細胞中篩選出前10個顯著差異表達的上調(diào)miRNA

2.2 差異表達miRNA靶向基因和轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測

采用FunRich在線工具對29個差異表達的miRNA進行差異分析，最終篩選出8個具有靶向基因的miRNA。轉(zhuǎn)錄因子是一組能與目標(biāo)基因5`端上游特定序列專一性結(jié)合，保證目標(biāo)基因能夠在特定的時間與空間中表達的蛋白質(zhì)分子，其通過改變宿主細胞的基因表達可促進疾病的發(fā)生。因此，利用FunRich在線工具預(yù)測差異表達miRNA的上游轉(zhuǎn)錄因子，獲取前10個差異顯著的轉(zhuǎn)錄因子：EGR1、SP1、POU2F1、SP4、NKX6-1、ZFP161、FOXA1、MEF2A、SOX1、HOXA5。見表2。

表2 8個上調(diào)的差異表達miRNA所靶向mRNA的數(shù)目

2.3 目標(biāo)mRNA的識別

鑒于miRNA/mRNA呈負(fù)反饋調(diào)控關(guān)系，將8個上調(diào)miRNA所靶向的mRNA分別與GSE145554數(shù)據(jù)集中大腦扣帶回淺層皮質(zhì)和深層皮質(zhì)錐體神經(jīng)細胞所篩選的下調(diào)mRNA取交集基因。結(jié)果顯示：大腦扣帶回淺層皮質(zhì)有57個mRNA，深層皮質(zhì)有190個mRNA，共247個下調(diào)的差異表達mRNA；hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-151a-5p和hsa-miR-4429的靶基因與深淺皮層下調(diào)mRNA均無交集基因；hsa-miR-182-5p的靶基因與深淺皮層下調(diào)mRNA具有6個交集基因（L1CAM、NRN1、AK3、LSM14A、RNF144B、GCNT1），hsa-miR-96-5p的靶基因與下調(diào)mRNA具有5個交集基因（AK3、GINM1、TM9SF4、RLIM、GCNT1），hsa-miR-146a-5p的靶基因與下調(diào)mRNA具有1個交集基因（KBTBD4），hsa-miR-155-5p的靶基因與下調(diào)mRNA具有2個交集基因（LSM14A、KRAS），hsa-miR-15a-5p的靶基因與下調(diào)mRNA具有 8個交集基因（PELI2、NRN1、CD28、RNF144B、RASSF5、CCDC85C、ARHGDIA、TBP）。共5個miR?NA與17個下調(diào)mRNA具有互作關(guān)系，這17個mRNA被確定為目標(biāo)mRNA。見圖1。

圖1 5個miRNA與17個下調(diào)mRNA的互作關(guān)系

2.4 目標(biāo)mRNA的GO和KEGG通路富集分析

GO注釋結(jié)果顯示：生物過程中，靶基因顯著富集于內(nèi)分泌信號通路、X染色體失活調(diào)節(jié)劑量補償、前腦星形膠質(zhì)細胞分化與發(fā)育、軸突發(fā)生正調(diào)控、蛋白質(zhì)多泛素化以及Toll信號通路的調(diào)控等；細胞組成成分中，靶基因顯著富集于免疫突觸、雄性原核、轉(zhuǎn)錄因子TFIIA復(fù)合物、雌性原核、轉(zhuǎn)錄前啟動復(fù)合體、信使核糖核蛋白復(fù)合物以及軸突生長；分子功能中，靶基因顯著富集于三磷酸核苷腺苷酸激酶活性、泛素蛋白連接酶活性、Rho GDP解離抑制劑活性、TFIIB類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素蛋白轉(zhuǎn)移酶活性以及軸突導(dǎo)向受體活性。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示：靶基因主要富集于非小細胞肺癌、T細胞受體信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、細胞衰老、軸突引導(dǎo)、病毒致癌作用、Rap1信號通路、HTLV-I感染以及Ras信號通路等。

2.5 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

將目標(biāo)mRNA導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，獲得17個節(jié)點和11個邊緣的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。這11個蛋白均有其靶向的miRNA，hsa-miR-15a-5p可靶向CD28、RNF144B、RASSF5、ARHGDIA、TBP；hsa-miR-96-5p靶向AK3、TM9SF4、RLIM、GCNT1；hsa-miR-155-5p靶向 KRAS；hsa-miR-182-5p靶向 L1CAM、AK3、RNF144B、GCNT1。最終構(gòu)建精神分裂癥miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。見圖2、圖3。

圖2 目標(biāo)mRNA的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析圖

圖3 精神分裂癥miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

3 討 論

腦組織和外周血中的miRNA對其靶向基因調(diào)控失調(diào)可能是精神分裂癥的發(fā)病機制之一［13-16］。本研究對GEO數(shù)據(jù)庫中的精神分裂癥外周血單核細胞miRNA數(shù)據(jù)集進行差異分析，共識別出29個上調(diào)的差異表達miRNA，但最終篩選出8個具有靶向mRNA的miRNA。由于轉(zhuǎn)錄因子和miRNA之間可發(fā)揮相互的調(diào)控作用［17］，并共同對mRNA的轉(zhuǎn)錄及翻譯產(chǎn)生影響，這種生物過程被認(rèn)為是細胞代謝的調(diào)節(jié)劑［18］。本研究利用FunRich在線工具預(yù)測出miRNA的前10個顯著差異的轉(zhuǎn)錄因子，其中EGR1是精神分裂癥的易感基因：EGR1表達異?？赡芘c精神分裂癥的發(fā)病密切相關(guān)［19］；EGR1的功能表現(xiàn)為積極參與突觸可塑性和突觸傳遞，且EGR1所參與的突觸調(diào)控網(wǎng)絡(luò)失衡是導(dǎo)致精神分裂癥發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)［20］。因此，推測EGR1作為上游轉(zhuǎn)錄因子參與8個miRNA的基因表達可能是精神分裂癥的發(fā)病原因之一。

8個差異表達miRNA的靶基因與GSE145554數(shù)據(jù)集所獲取的差異表達mRNA取交集基因，共篩選出17個下調(diào)的目標(biāo)mRNA。GO功能注釋分析顯示：它們積極參與神經(jīng)系統(tǒng)的生物學(xué)功能，如正向調(diào)控軸突的發(fā)生、前腦星形膠質(zhì)細胞的分化及發(fā)育；KEGG通路富集分析顯示：靶向基因積極參與人體的重要信號通路，其中4條信號通路與精神分裂癥密切相關(guān)，如Ras信號通路、Rap1信號通路、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路以及軸突引導(dǎo)信號通路，與既往研究結(jié)果一致［21-24］。這些目標(biāo)mRNA均具有精神分裂癥潛在分子標(biāo)志物的可能。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示：17個目標(biāo)蛋白只有11個具有互作關(guān)系，而在7個目標(biāo)蛋白構(gòu)成最大的互作網(wǎng)絡(luò)中，KRAS原癌基因為核心基因，CD28為免疫相關(guān)基因。已有研究顯示，KRAS原癌基因與精神分裂癥具有相關(guān)性，其剪切變體與少突膠質(zhì)細胞維持軸突的髓鞘功能相關(guān)［25］；精神分裂癥與健康對照組的樣本中參與MAPK通路的KRAS存在差異表達水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義［26］。同時，免疫功能與精神分裂癥的相關(guān)性研究顯示：循環(huán)細胞因子、氧化應(yīng)激和炎癥因子標(biāo)志物所致的免疫功能障礙與精神分裂癥具有明顯關(guān)聯(lián)，而這種免疫障礙可能是精神分裂癥從首發(fā)精神病演變?yōu)槁圆B(tài)的主要原因［27］。而本研究所識別的CD28參與的免疫功能也可能誘發(fā)精神分裂癥［28-30］。因此，本研究連接度最高的2個基因（KRAS與CD28）可以做為精神分裂癥的易感基因。而且，miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果顯示，hsa-miR-15a-5p靶向調(diào)控 CD28，hsa-miR-155-5p靶向調(diào)控 KRAS。KRAS與 ARHGDIA、TM9SF4、TBP、RASSF5、L1CAM、CD28具有蛋白互作關(guān)系，CD28與KRAS、TBP、L1CAM具有蛋白互作關(guān)系，結(jié)果表明，miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與疾病的發(fā)生機制是錯綜復(fù)雜的，且不是單一的某個基因就可以決定疾病的病理過程。

本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫并整合生物信息學(xué)方法構(gòu)建精神分裂癥miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究方法為探索精神分裂癥的發(fā)病機制提供了一定參考價值。本研究局限性在于：①GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE54578和GSE145554數(shù)據(jù)集原始樣本數(shù)量較少；②缺乏在精神分裂癥大樣本中對miRNA和mRNA實施表達量驗證；③缺乏在體外細胞系中驗證miRNA-mRNA的互作關(guān)系。