葉酸受體陽(yáng)性循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)對(duì)肝細(xì)胞癌病人合并血管侵犯的診斷價(jià)值

林美龍 王文強(qiáng) 李劍 張二雷 黃志勇

肝細(xì)胞癌 (hepatocellular carcinoma,HCC)的血管侵犯與肝切除術(shù)后的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有相關(guān)性[1]。HCC發(fā)生的血管侵犯主要分為大血管侵犯和微血管侵犯(microvascular invasion,MVI)[2]，大血管侵犯主要發(fā)生于門(mén)靜脈、肝靜脈、腔靜脈及其主要分支，其中門(mén)靜脈癌栓(portal vein tumor thrombus group,PVTT)是主要的大血管侵犯形式，常通過(guò)影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)；MVI是指癌細(xì)胞見(jiàn)于內(nèi)皮細(xì)胞襯覆的血管腔內(nèi)，多見(jiàn)于癌旁肝組織內(nèi)的門(mén)靜脈小分支[3]，只能通過(guò)病理檢查發(fā)現(xiàn)。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)是指從原發(fā)腫瘤病灶脫落后進(jìn)入到外周血液循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞[4-6]。葉酸受體(folate receptor,FR)是一種表達(dá)于細(xì)胞膜表面的糖蛋白，它具有很強(qiáng)的組織及腫瘤特異性，在乳腺癌，肺癌，卵巢癌等多種實(shí)體腫瘤的細(xì)胞表面高表達(dá)[7-11]。有研究表明，肝原發(fā)腫瘤細(xì)胞表面的FR也有一定水平的表達(dá)[8]。本文探討FR陽(yáng)性CTCs(FR+-CTCs)與HCC血管侵犯的相關(guān)性及診斷價(jià)值。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

2020年10月～2021年8月我院收治HCC住院病人91例。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理學(xué)檢查確診為HCC；臨床資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重的心肺疾病或器質(zhì)性病變；合并其他腫瘤性疾病；有葉酸服用史。病人已了解且同意加入研究。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求。91例病人的一般資料見(jiàn)表1。根據(jù)術(shù)前影像結(jié)果和術(shù)后病理結(jié)果分為無(wú)血管侵犯(non-vascular invasion,NVI)組30例(32.97%)，MVI組26例(28.57%)，PVTT組35例(38.46%)。

二、方法

FR+-CTCs測(cè)試試劑盒(免疫磁珠負(fù)向篩選+靶向熒光定量PCR法)購(gòu)于南通格諾思博生物科技有限公司。選取試管抽取4ml以上的HCC的病人的外周血液，去除紅細(xì)胞，然后用免疫磁珠的方式去除絕大多數(shù)的白細(xì)胞，剩余樣品中包含F(xiàn)R陽(yáng)性細(xì)胞。使用特異性小分子探針對(duì)FR陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，這種特異性小分子探針由識(shí)別FR的化學(xué)小分子與寡聚核苷酸偶聯(lián)形成。在小分子探針與FR陽(yáng)性細(xì)胞充分結(jié)合后，洗滌去除未結(jié)合的探針；然后洗脫受體結(jié)合的探針，用于后續(xù)定量檢測(cè)。利用熒光定量PCR，對(duì)FR結(jié)合的小分子探針中的寡聚核苷酸進(jìn)行定量檢測(cè)；最終依據(jù)校準(zhǔn)曲線定量檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果

3組病人FR+-CTCs檢測(cè)值的平均水平分別為(10.52±2.21)FU/3 ml，(12.35±2.47)FU/3 ml，(14.79±3.68)FU/3 ml，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) 。根據(jù)Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，不同血管侵犯類(lèi)型的病人的FR+-CTCs檢測(cè)值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中NVI和MVI的FR+-CTCs檢測(cè)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.085)，NVI與PVTT組的FR+-CTCs檢測(cè)值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MVI組和PVTT組的FR+-CTCs檢測(cè)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.068)(圖1)。采用Spearman相關(guān)性分析，F(xiàn)R+-CTCs檢測(cè)值和HCC血管侵犯程度之間具有正相關(guān)性(r=0.499)(P<0.05)。其中FR+-CTCs檢測(cè)值與MVI之間的相關(guān)性為r=0.320(P<0.05)，F(xiàn)R+-CTCs檢測(cè)值與PVTT之間的相關(guān)性為r=0.571(P<0.05)。

圖1 91例HCC不同血管侵犯類(lèi)型的FR+-CTCs分布范圍

繪制FR+-CTCs的ROC曲線，計(jì)算ROC曲線下面積(AUC)，F(xiàn)R+-CTCs診斷HCC有無(wú)血管侵犯的AUC為0.769(95%CI為0.668～0.869，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中約登指數(shù)為0.439，臨界值為12.35 FU/3 ml，敏感度為0.672，特異度為0.767。FR+-CTCs診斷MVI的AUC為0.579，P=0.312,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。FR+-CTCs診斷PVTT的AUC為0.830(95%CI為0.733～0.928,P<0.05)，其中約登指數(shù)為0.562，臨界值為11.8 FU/3 ml，敏感度為0.829，特異度為0.733(圖2)。

A．91例病人發(fā)生血管侵犯的ROC曲線;B．26例病人發(fā)生MVI的ROC曲線;C．35例病人發(fā)生PVTT的ROC曲線圖2 FR+-CTCs在HCC不同血管侵犯類(lèi)型的診斷效能

討論

CTCs作為一種新型液體活檢，已經(jīng)在多種腫瘤病人的外周血液中檢測(cè)出，并且顯著高于健康人[12]。Cheng等[13]研究表明，CTCs對(duì)HCC具有診斷價(jià)值，與甲胎蛋白聯(lián)合檢測(cè)可以提升HCC診斷的有效性。有研究表明，通過(guò)上皮細(xì)胞黏附分子陽(yáng)性的免疫靶點(diǎn)來(lái)識(shí)別并檢測(cè)CTCs，發(fā)現(xiàn)其計(jì)數(shù)的動(dòng)態(tài)變化與疾病變化進(jìn)展相關(guān)[14]。Yan等[15]利用體內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)CTCs的數(shù)量變化，提出CTCs可以作為預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展和監(jiān)測(cè)療效的標(biāo)志物。而且高計(jì)數(shù)量的上皮細(xì)胞黏附分子陽(yáng)性CTCs預(yù)示著HCC有更高的復(fù)發(fā)率和更差的生存率[16]。HCC發(fā)生血管侵犯時(shí)，腫瘤細(xì)胞可從原發(fā)病灶遷移至血管內(nèi)，形成微血管癌栓或者PVTT，導(dǎo)致HCC切除術(shù)后5年復(fù)發(fā)率可高達(dá)40%～70%[17]。原發(fā)病灶的腫瘤細(xì)胞侵襲血管后脫落而形成CTCs是造成肝內(nèi)外播散或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要原因。近年來(lái)，隨著對(duì)腫瘤表面特異性標(biāo)志物的研究，發(fā)現(xiàn)FR具有很強(qiáng)的組織及腫瘤特異性，在卵巢癌、腎癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌和胰腺癌等腫瘤中有明顯的表達(dá)，但在正常組織幾乎不表達(dá)。因此，F(xiàn)R作為一種新型的靶點(diǎn)來(lái)檢測(cè)CTCs具有很大潛力[8]。利用FR檢測(cè)CTCs在非小細(xì)胞肺癌，前列腺癌和大腸癌等惡性腫瘤上已得到應(yīng)用，同時(shí)對(duì)多種腫瘤的診斷和預(yù)測(cè)療效具有重要的臨床意義[18-20]。

本研究結(jié)果表明，F(xiàn)R+-CTCs的檢測(cè)值與HCC的血管侵犯程度呈正相關(guān)，血管侵犯程度越嚴(yán)重，其檢測(cè)值越高，特別是發(fā)生PVTT的FR+-CTCs檢測(cè)值對(duì)比NVI的檢測(cè)值增加更明顯。FR+-CTCs對(duì)PVTT的預(yù)測(cè)價(jià)值較高，但是對(duì)MVI的預(yù)測(cè)價(jià)值較低，無(wú)法通過(guò)FR+-CTCs數(shù)值的差異將NVI和MVI區(qū)別開(kāi)來(lái)。由于HCC的CTCs的FR表達(dá)量不太高，導(dǎo)致HCC不同程度的血管侵犯的FR+-CTCs檢測(cè)存在一定困難和遺漏，這可能是導(dǎo)致MVI預(yù)測(cè)價(jià)值較低的一個(gè)重要因素。

HCC常可出現(xiàn)PVTT或門(mén)靜脈血栓(portal vein thrombosis,PVT)，臨床上通過(guò)影像學(xué)來(lái)對(duì)二者進(jìn)行鑒別也有一定困難，存在一定的診斷誤差[21-22]。有研究表明，HCC合并PVTT的發(fā)生率高達(dá)44.0%～62.2%[23]；HCC通常合并肝硬化，由于血流動(dòng)力學(xué)的改變，也容易出現(xiàn)PVT，單純肝硬化病人PVT發(fā)生率為5%～20%[24-25]，但在肝硬化合并HCC病人中PVT發(fā)生率可高達(dá)35%[26-27]。這時(shí)可以參考FR+-CTCs的數(shù)值對(duì)其加以區(qū)分，如果FR+-CTCs較高，特別是高于臨界值11.8 FU/3 ml，應(yīng)該注意血管侵犯的可能性。

血管侵犯與肝切除術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)率高有密切相關(guān)性，術(shù)前作出是否有血管侵犯的準(zhǔn)確診斷對(duì)于制定合理的手術(shù)方法，優(yōu)化肝切除范圍，盡早開(kāi)展全身靶向及免疫治療具有重要意義。本檢測(cè)手段具有無(wú)創(chuàng)，簡(jiǎn)便，快速的優(yōu)點(diǎn)，可以在一定程度上彌補(bǔ)現(xiàn)有影像學(xué)檢查和病理學(xué)檢查滯后的短板。本研究為單中心研究，納入樣本量相對(duì)不多；FR+-CTCs的檢測(cè)數(shù)值也受多因素影響，包括檢測(cè)儀器，試劑活性和純度等。將來(lái)需要開(kāi)展多中心、大樣本量的研究，進(jìn)一步深入研究FR+-CTCs檢測(cè)在對(duì)MVI的預(yù)測(cè)作用，探討治療前后包括手術(shù)、靶向和免疫治療前后病人FR+-CTCs水平的變化，分析FR+-CTCs水平的變化與病人預(yù)后的相關(guān)性。