固定化木瓜蛋白酶的應用進展

黃秋嵐 田程飄 唐桓偉 單彬 龐新華

摘 要：木瓜蛋白酶是來自于熱帶、亞熱帶水果番木瓜的蛋白酶，經(jīng)固定化后可以增強其功能特性，有利于進一步開發(fā)與利用。固定化木瓜蛋白酶應用范圍廣泛，在多個領域中均有應用，但是同時也存在著研究水平較低、應用程度較淺的問題，因此還可以做更深入、全面的開發(fā)，將其優(yōu)秀的酶學性質發(fā)揮到各個行業(yè)中。本文簡述了木瓜蛋白酶的固定化方法及固定化木瓜蛋白酶在食品、醫(yī)藥等行業(yè)的應用，以期為木瓜蛋白酶今后的研究與利用提供參考。

關鍵詞：番木瓜;木瓜蛋白酶;固定化

中圖分類號：S668.2 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A

Application Progress of Immobilized Papain

HUANG Qiulan，TIAN Chengpiao，TANG Huanwei，SHAN Bin*，PANG Xinhua

（Guangxi Subtropical Crops Research Institute/ Key Laboratory for Quality and Safety?Control of Subtropical Fruit and Vegetable，Ministry of Agriculture and Rural?Affairs，Nanning，Guangxi 530001，China）

Abstract：Papain is a kind of proteases derived from tropical and subtropical fruit papaya. After being immobilized，papain’s functional properties could be enhanced，and is conducive to further development and application. Immobilized papain has a wide range of applications in many fields. But there are problems of low levels of research and application. Therefore，more in-depth and comprehensive development should be done，and the application of enzymatic characteristics would play a role in various industries. This article briefly reviews the immobilization method of papain and the application of immobilized papain in food，medicine and other industries，providing reference for the future research and utilization of papain.

Key? words：Carica Papaya;Papain;immobilization

番木瓜（Carica papaya）又名木瓜、萬壽果、乳果，是番木瓜科番木瓜屬的多年生小喬木，在我國南方地區(qū)具有很大的栽培面積[1]。據(jù)廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所番木瓜創(chuàng)新團隊統(tǒng)計，廣西地區(qū)的番木瓜的種植面積約4000 hm2，占全國種植面積的60%左右。木瓜蛋白酶（EC：3.4.22.2）是來源于熱帶水果番木瓜的一類含巰基的蛋白水解酶，在番木瓜果樹的根、莖和葉中都廣泛存在[2]，在未成熟果實的新鮮乳汁中尤為豐富[3]。木瓜蛋白酶是由212個氨基酸組成的單肽鏈內切酶，其中第25位的半胱氨酸殘基和第158位的組氨酸殘基位于其活性中心[4]。木瓜蛋白酶具有較高的熱穩(wěn)定性、pH適用范圍廣、底物專一性低等特點，是一種常見的生物催化劑，可用于肉類嫩化、蠶絲脫膠及提高飼料品質等。我國的木瓜蛋白酶產(chǎn)業(yè)處于起步階段，而市場的需求量較大，因此其具有很大的發(fā)展空間和強勁的發(fā)展勢頭，值得深入研究。

由于酶的蛋白質特性，使得酶在催化反應過程中往往短時間、單次使用后就喪失活性，失去催化能力，無法進行重復利用。采取適當方法將酶固定至特定的載體，可以增強酶穩(wěn)定性、延長貯藏期、易于分離回收、提高利用率和縮短反應時間，有利于降低生產(chǎn)成本，通過固定化，木瓜蛋白酶的酶學特性也可以獲得顯著的提升。本文對固定化木瓜蛋白酶在不同行業(yè)中的應用進行綜述，以期為固定化木瓜蛋白酶的開發(fā)與應用提供一定的借鑒。

1 木瓜蛋白酶的固定化方法簡介

各方面研究者經(jīng)過多年的探索與實踐，總結出不少有效的酶固定化方法，包括傳統(tǒng)的包埋法、吸附法、交聯(lián)法和結合法以及新型的膜固定化[5]、微波輔助固定化[6]、無載體固定化[7]等。其中常用于木瓜蛋白酶的固定化方法有吸附法、包埋法、載體交聯(lián)法等[8]。李琳[9]利用改性后的竹材料作為載體，經(jīng)吸附及共價結合兩種方法共同作用，對木瓜蛋白酶進行固定，獲得的固定化木瓜蛋白酶具有操作穩(wěn)定性提高，耐貯存、耐堿及耐高溫等特點。Baidamshina等[10]將木瓜蛋白酶固定至中等分子量（200 kDa）和高分子量（350 kDa）殼聚糖基質上，得到的固定化木瓜蛋白酶表現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性和更長的半衰期。韋美蘋等[11]采用金屬螯合的方式將木瓜蛋白酶固定于磁性粒子，固定后的木瓜蛋白酶可以有效地降解黑螞蟻蛋白。對比游離酶，固定化后的酶具有易再生，再生后酶活穩(wěn)定等優(yōu)點。這些研究結果均表明固定化后的木瓜蛋白酶的熱穩(wěn)定性、耐堿性等酶學性質可以得到進一步的優(yōu)化和提高，這一特性有利于其在各個領域中更好地發(fā)揮作用。

2 固定化木瓜蛋白酶的應用

2.1 固定化木瓜蛋白酶在食品行業(yè)的應用

牛蒡是我國傳統(tǒng)的藥食同源植物，營養(yǎng)價值高，其中的牛蒡多糖具有抗氧化性、抗凝血性、降血糖等多種生物活性，具有很高的食用和保健價值。以殼聚糖為載體，在合適的工藝條件下對木瓜蛋白酶進行處理，可以得到固定化木瓜蛋白酶。利用此固定化木瓜蛋白酶提取牛蒡多糖（提取參數(shù)：pH 6.5，時間8 h，料液比1：20，加酶量1.8 g/g），最終獲得11.04%的提取率，并且固定化酶在重復使用5次后仍保留50%以上的酶活力。該研究為牛蒡多糖的提取摸索出一個行之有效的方法，也為其它藥食同源植物說的生物活性成分提取提供了一個借鑒[12]。

果汁、啤酒等飲料在低溫與長期放置的過程中，會出現(xiàn)冷渾濁（Chill haze）現(xiàn)象，影響產(chǎn)品的品質。早在20世紀90年代，我國就有學者利用固定化酶對飲料的冷渾濁問題進行研究。徐鳳彩等[13]將處理后的尼龍固定木瓜蛋白酶用來處理啤酒。經(jīng)固定化木瓜蛋白酶處理后的啤酒渾濁度下降了2～11倍，蛋白質含量比未處理的啤酒下降了55%，同時啤酒還能保持原有風味，延長低溫保藏時間，冷渾濁現(xiàn)象得到明顯改善。除了利用尼龍作為載體外，還可以用殼聚糖固定化木瓜蛋白酶對啤酒進行處理。姜涌明等[14]利用殼聚糖作為載體，以戊二醛作為交聯(lián)劑，得到的固定化木瓜蛋白酶對啤酒進行澄清實驗。實驗結果表明，經(jīng)最佳條件下制備所得殼聚糖固定化木瓜蛋白酶處理后的啤酒，蛋白質濃度從56.5 mg/L降至2.7 mg/L，澄清效果顯著，有利于提高啤酒的質量及商業(yè)價值。

殼聚糖固定化的木瓜蛋白酶同樣也能應用在果汁澄清中。Yava<E：＼H盤的＼2017年廣西熱作＼2022年＼第1期＼28.jpg>er[15]利用N，N-亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)甲基丙烯酸2-羥乙酯和戊二醛交聯(lián)的冷凍凝膠化殼聚糖對木瓜蛋白酶進行固定化，并將固定化木瓜蛋白酶用于蘋果果汁澄清處理。在pH 值4.08反應條件下對蘋果汁進行澄清，固定化木瓜蛋白酶的澄清率達到了31.4%的水平，而游離的木瓜蛋白酶的澄清率僅為14.7%，遠低于固定化酶，與僅用冷凍凝膠化殼聚糖的澄清率（12.5%）接近。Leila等[16]利用磁性納米顆粒對木瓜蛋白酶進行固定化研究，使用游離的木瓜蛋白酶與固定化木瓜蛋白酶對石榴汁進行實驗。在50 ℃下，游離木瓜蛋白酶與固定化木瓜蛋白酶在第14 d時石榴汁的渾濁度為44.2、44.7，顯著低于未作處理的石榴汁渾濁度（92.7）。其中固定化木瓜蛋白酶在重復使用10次后仍保留40%左右的酶活力，在保存20 d后仍保留了接近80%的酶活力，遠高于游離的木瓜蛋白酶。在食品安全問題日益受到重視的環(huán)境下，來源于水果的木瓜蛋白酶非常契合食品行業(yè)的安全需求，這一特點有利于其在食品行業(yè)中廣泛使用。木瓜蛋白酶經(jīng)過固定化后，隨著耐熱性、耐堿性、可再生等優(yōu)點的顯現(xiàn)與放大，獲得了更多的青睞，這有利于進一步拓寬木瓜蛋白酶在食品行業(yè)中的應用范圍。

2.2 固定化木瓜蛋白酶在醫(yī)藥行業(yè)的應用

固定化木瓜蛋白酶在醫(yī)藥領域的應用也取得了值得關注的進展。貓爪草是毛茛科植物小毛茛的干燥塊根，是一種常見的中藥材，其多糖具有豐富的生物活性，例如抗炎癥、抗腫瘤、抗氧化和免疫調節(jié)等[17-19]，具有較高的醫(yī)療保健價值。廖啟元等[20]采用固定化木瓜蛋白酶，在固定化酶用量12%、酶解溫度60 ℃、酶解時間2 h、pH值6.0的最佳工藝下脫除貓爪草粗多糖當中的蛋白質，最終獲得的多糖保留率為73.2%，蛋白脫除率為71.3%，有效地降低了蛋白質對貓爪草多糖作用的干擾，該研究也為今后的中草藥有效活性成分的提取純化提供了一個可參考的方法。

固定化木瓜蛋白酶對創(chuàng)傷處理有一定的作用[21]。Vasconcelos等[22]將木瓜蛋白酶固定至過氧化細菌纖維素（ OxBC ）膜上，經(jīng)OxBC膜固定的木瓜蛋白酶在模擬發(fā)炎的皮膚上可以延長此膜的作用時間，該特性可以提高OxBC膜在去除慢性皮膚傷口中的化膿和壞死組織的作用效果，為未來的醫(yī)療用生物敷料提供了一種新的可能。

抗原結合片段（Antigen-binding fragment， Fab）可以作為抗體藥物對某些特定疾病進行治療，目前已有多種Fab類抗體藥物通過了美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準[23]。Armutcu等[24]利用冷凍凝膠固定化木瓜蛋白酶生物反應器對人免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）抗體進行消化處理，并對消化產(chǎn)物做定性研究。實驗結果顯示IgG的消化率達到80.6%，其中Fab片段的比例為37.84%，是消化產(chǎn)物中含量最高的片段。此研究說明固定化木瓜蛋白酶通過消化免疫球蛋白可以有效地獲得具有治療作用的Fab片段。除了上述研究外，還有大量報道指出固定化木瓜蛋白酶在臨床治療上取得了顯著的成果，這對木瓜蛋白酶在醫(yī)藥行業(yè)的深入研究具有重要意義。

生物醫(yī)藥因具有資源足、跨學科、成本低等特點獲得了迅速的發(fā)展，是當前科研熱點之一。木瓜蛋白酶作為一種植物來源的天然產(chǎn)物目前在該行業(yè)已經(jīng)表現(xiàn)出了一定的利用價值，經(jīng)固定化后其性能獲得提升，這有利于進一步挖掘它更多的功能與利用途徑，以期在生物制藥、臨床醫(yī)療上取得更多有突破性的成果。

2.3 固定化木瓜蛋白酶在其它行業(yè)的應用

2.3.1 生物肽制備

生物活性肽一般指由氨基酸經(jīng)過不同組成和排列構成的，分子量小于6000 D的多肽，具有較高的生物活性及生物相容性[25-28]，同時還具有抗菌、抗疲勞、免疫調節(jié)[29]等功能，在日常保健及臨床研究中都發(fā)揮著重要作用。大豆肽是大豆蛋白水解產(chǎn)生的短肽，具有降血壓、降膽固醇和抗氧化等生理功能[30]。曹玉華等[31]以殼聚糖作為載體，利用戊二醛交聯(lián)把木瓜蛋白酶進行固定化，在55 ℃、pH 7.8、底物濃度2.0～3.0 mg/mL和0.2 mL/min的水解條件下成功地制備出大豆肽，最終獲得的產(chǎn)物水解度為42.6%，酶解液中大豆肽的含量為1.453 mg/mL?？寡趸木哂幸种苹钚匝醯男纬?、清除自由基和分解過氧化物等活性的功能[32]，是一種天然的抗氧化劑，具有較高的安全性。楊久興[33]利用自制介孔材料L-MCM-41作為載體用以固定木瓜蛋白酶，對扇貝蛋白進行水解制備抗氧化扇貝肽。實驗結果顯示，固定化酶水解后獲得的扇貝肽具有很高的抗氧化活性，高于非固定化酶。利用固定化酶水解所得到的扇貝肽還原力最大值約為游離酶所制扇貝肽的2倍，并大大縮短了酶解時間。刁文錦等[34]利用超大孔聚甲基丙烯酸縮水甘油酯作為載體對木瓜蛋白酶進行固定化，用于催化酵母蛋白制作酵母抗氧化肽。在固定化木瓜蛋白酶的催化下，得到的水解產(chǎn)物最高的抗氧化活力為81.2 mol TE/g，遠高于蔬菜和水果的抗氧化活力。此外，在重復使用了20次后，固定化木瓜蛋白酶仍保留著35%的初始酶活力。

2.3.2 紡織行業(yè)

木瓜蛋白酶可用于蠶絲脫膠、皮革軟化、羊毛防皺[35-36]等紡織工藝，經(jīng)固定化后其優(yōu)點可以進一步放大。Xue等[37]利用1，2，4-苯三甲酸酐和均苯四酸對木瓜蛋白酶進行化學修飾后固定至活化棉織物，得到的固定化修飾酶的熱穩(wěn)定性、耐堿、耐洗滌性均有明顯提高。當去污劑濃度為20 mg/ml時，固定化的均苯四甲酸木瓜蛋白酶的活性仍保持其原始活性的40%左右，而天然木瓜蛋白酶幾乎被抑制。此工作證明了棉織物固定化改性木瓜蛋白酶在功能性紡織品領域具有潛在的應用價值。

2.3.3 化工行業(yè)

在洗滌劑中加入酶或酶制劑也能起到催化作用。酶將某些有機污垢分解為小分子后，可以提高污垢的水溶性從而去除污垢，蛋白酶則是最早在洗滌劑中應用的酶[38]。Sangeetha等[39]將經(jīng)過鄰苯二甲酸改性處理后的木瓜蛋白酶固定至玉米淀粉凝膠上，得到的固定率為98%，遠高于高嶺土等其它載體。經(jīng)固定后的改性木瓜蛋白酶保留的酶活力為78%左右，同時其熱穩(wěn)定性、最適pH值均有提高。當添加至洗衣粉中時，對比游離的木瓜蛋白酶，固定化酶具有更高的酶活力。此實驗結果表明了固定化后的改性木瓜蛋白酶在家用洗衣粉上應用潛力。隨著人們環(huán)保意識的提高，對化工行業(yè)的要求也隨之提高。木瓜蛋白酶是植物來源酶，不會造成環(huán)境污染，是環(huán)境友好型催化劑，經(jīng)固定化后可重復利用更減少了廢棄物的排放，這與綠色發(fā)展理念相契合，同時也有利于其在化工行業(yè)的開發(fā)與應用。

3 展望

我國番木瓜種植面積廣泛，木瓜蛋白酶的利用歷史長，適用范圍廣，具有廣闊的開發(fā)前景。其中固定化木瓜蛋白酶與游離的木瓜蛋白酶相比，具有更廣泛的pH適用范圍及更高的熱穩(wěn)定性，并且可以重復利用，能有效降低使用成本，提高生產(chǎn)效率和提高番木瓜的市場附加值。

基于以上特點，固定化木瓜蛋白酶在各領域的應用都取得了一定的成績，但是目前木瓜蛋白酶及其固定化的研究程度較低，實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應用的能力仍比較有限，現(xiàn)階段的成果難以滿足我國迅速發(fā)展的工業(yè)需求。這也說明在木瓜蛋白酶及其固定化上仍有較大的發(fā)展空間與生產(chǎn)價值，因此亟待相關研究人員開發(fā)出更多的利用手段，例如固定化方法的創(chuàng)新、酶專用品種的選育、酶的生物合成、酶的分離純化等，進而能更全面、高效地發(fā)揮木瓜蛋白酶的作用，提高番木瓜的附加值，拓寬番木瓜資源利用途徑，進一步促進番木瓜產(chǎn)業(yè)的增長，加快我國的亞熱帶特色農業(yè)現(xiàn)代化建設步伐。

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作者簡介：黃秋嵐（1994-），碩士，現(xiàn)主要從事生物技術相關工作。

*通信作者：單彬（1986-），碩士，高級實驗師，主要從事熱帶、亞熱帶水果種質資源利用研究工作，E-mail：zzbj219@163.com。

收稿日期：2022-01-03