呼吸道合胞病毒與肺炎衣原體感染肺炎患兒的外周血淋巴細胞亞群特征比較

曾瑞梅 吳亞平

肺炎是兒童較常發(fā)生的一種呼吸道感染性疾病，具有發(fā)病迅速、易感染等特點，約有10%的患兒可進展為重癥肺炎，是7歲以下兒童死亡的一個主要病因［1］。細菌、病毒、支原體、衣原體感染均可能引起小兒肺炎，不同病原體感染誘發(fā)的免疫發(fā)展方向可能存在較大差異，采取的治療措施也不同，但患兒早期臨床表現(xiàn)可能無明顯特異性，僅根據(jù)臨床表現(xiàn)并不能明確病原體類型，增加了臨床對癥治療難度，影響治療效果［2］。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）與肺炎衣原體（chlamydia pneumoniae，CP）感染是引起小兒肺炎的常見原因，發(fā)病率高但患兒死亡率較低［3］。目前，臨床關于細菌性肺炎、支原體肺炎及多種病毒性肺炎的研究較多，但關于RSV和CP感染小兒肺炎的免疫影響比較鮮有報道。因為免疫治療能夠有效降低RSV、CP引發(fā)的呼吸道感染發(fā)病率，了解RSV和CP感染所致肺炎患兒的外周血淋巴細胞亞群特征，分析兩種病原體的免疫反應作用機制，對于發(fā)展靶向免疫治療有著積極意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年1月至2020年12月桐廬縣第一人民醫(yī)院收治的肺炎患兒1,000例。（1）納入標準：年齡≤12歲；符合《諸福棠實用兒科學》［4］中的小兒肺炎診斷標準，有呼吸道感染病史、呼吸道感染癥狀及體征；胸部X線片可見肺炎影像；病原體檢測明確為單一病原體感染，RSV或CP；無其他系統(tǒng)器官感染。（2）排除標準：吸入性肺炎、先天性疾病及濕肺；混合感染；近3個月接受過抗感染治療者；臨床資料不完整。其中，男童584例，女童416例；年齡0.25～11（6.58±4.05）歲；入院時均有發(fā)熱（≥38.5 ℃）、咳嗽、流涕等癥狀；RSV感染496例（急性感染299例、慢性感染197例），CP感染504例（急性感染328例、慢性感染176例），病程≤1個月為急性感染，病程＞1個月為慢性感染。另選取同期在本院進行健康體檢兒童（性別、年齡相匹配）100例作為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有研究對象家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法 （1）在病程第3～5天采集患兒外周靜脈血3 mL，對照組兒童在體檢時采集靜脈血標本，以3,000 r/min離心10 min，分離血清后使用抗凝真空管保存2份，置于-70 ℃的冰箱中待檢。（2）一份血清標本使用CANTO Ⅱ型流式細胞儀（美國BD公司）及淋巴細胞亞群試劑盒測定T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞各表型的百分比，T淋巴細胞表型包括CD3+、CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD4+，計算CD4+/CD8+，B淋巴細胞包括CD3-CD19+，自然殺傷細胞為CD3-CD56/16+。采用比例計算淋巴細胞的絕對計數(shù)，計算公式：總淋巴細胞計數(shù)×某表型淋巴細胞百分比。（3）另一份血清采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定血清轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、白細胞介素-17（IL-17）、干擾素-γ（IFN-γ）、白細胞介素-10（IL-10）水平，試劑盒均由R&D公司提供，操作均嚴格按照試劑盒說明書進行，在450 nm酶標儀下讀取吸光度，并制作標準曲線，計算TGF-β1、IL-17、IFN-γ、IL-10水平。

1.3 觀察指標 （1）三組兒童的外周血淋巴細胞亞群（T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞）絕對計數(shù)；（2）三組兒童的血清TGF-β1、IL-17、IFN-γ、IL-10水平；（3）急性感染及慢性感染患兒的細胞因子水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以例數(shù)/百分比表示，采用χ2檢驗。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，采用方差分析或t檢驗；不符合正態(tài)分布以 ［M（P25，P75）］表示，采用非參數(shù)檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組的一般資料比較 三組兒童的性別、年齡、感染程度、感染史比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 RSV感染、CP感染患兒與健康兒童的一般資料比較

2.2 三組的外周血淋巴細胞亞群絕對計數(shù)比較 三組的外周血CD3+、CD3+CD8+、CD3-CD19+絕對計數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。三組的CD3+CD4+、CD4+/CD8+、CD3-CD56/16+絕對計數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），組內(nèi)兩兩比較顯示對照組的CD4+/CD8+絕對計數(shù)明顯低于RSV組和CP組（P＜0.05），RSV組的CD3+CD4+、CD4+/CD8+絕對計數(shù)均比CP組更高，CD3-CD56/16+比CP組更低（P＜0.05），CP組的CD3+CD4+絕對計數(shù)與對照組接近（P＞0.05），CD3-CD56/16+高于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 三組的外周血淋巴細胞亞群絕對計數(shù)比較［M（P25，P75）］

2.3 三組的血清細胞因子水平比較 三組的血清細胞因子水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。組內(nèi)兩兩比較顯示，對照組的TGF-β1、IL-17、IFN-γ、IL-10水平均低于另外兩組（P＜0.05），RSV組與CP組的血清TGF-β1水平接近（P＞0.05）。RSV組的血清IL-17、IL-10水平比CP組更高，IFN-γ水平比CP組更低（P＜0.05）。見表3。

表3 三組的血清細胞因子水平比較［pg/mL，（±s）］

表3 三組的血清細胞因子水平比較［pg/mL，（±s）］

組別 n TGF-β1 IL-17 IFN-γ IL-10 RSV組 496 63.84±12.01 103.95±33.57 66.25±7.69 68.97±10.84 CP組 504 61.78±9.28 55.24±32.96 112.47±25.58 23.55±6.32對照組 100 30.36±8.69 23.05±13.25 36.77±10.27 16.02±5.27 F值 7.036 13.628 23.658 10.996 P值 0.037 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 急慢性感染患兒的血清細胞因子水平比較 RSV組和CP組急性感染患兒的血清TGF-β1、IL-17、IL-10、IFN-γ水平均高于慢性感染患兒，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表4 急慢性感染患兒的血清細胞因子水平比較［pg/mL，（±s）］

表4 急慢性感染患兒的血清細胞因子水平比較［pg/mL，（±s）］

組別 n TGF-β1 IL-17 IFN-γ IL-10 RSV組 急性 299 74.78±11.95 127.69±23.45 70.36±7.26 75.84±9.22慢性 197 50.21±13.66 85.29±24.64 40.25±6.32 55.21±9.76 t值 13.658 24.669 16.928 20.958 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 CP組 急性 328 66.57±8.42 63.28±18.49 133.54±26.69 31.48±7.25慢性 176 50.04±9.17 48.04±15.97 101.52±24.48 18.27±5.93 t值 16.669 18.054 12.908 9.962 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

RSV和CP是小兒呼吸道感染的主要病原體。RSV是一種單鏈RNA病毒，其在感染季節(jié)內(nèi)及感染季節(jié)之間可以發(fā)生廣泛變異，能引起患兒不同程度的肺部感染，病情嚴重時可造成毛細支氣管炎，部分患兒還可能進展為長期慢性氣道疾病［5］。雖然最初的RSV僅在鼻咽內(nèi)復制，但其可逐步傳播至下呼吸道引發(fā)下呼吸道感染。RSV被證實對Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮細胞均有嗜性，能通過感染肺泡上皮細胞來影響氣體交換及肺泡表面活性劑的產(chǎn)生［6］。RSV糖蛋白能夠輔助RSV進入細胞，抑制核因子-κb的激活，調(diào)節(jié)宿主免疫應答，協(xié)助病毒逃離中和抗體。臨床認為RSV感染引起的肺部疾病嚴重程度與機體抗病毒T細胞反應密切相關［7］。CP是一種細胞內(nèi)寄生菌，是人類常見的呼吸道致病菌，常引起鼻竇炎、咽炎、肺炎、支氣管炎、支氣管哮喘等急性呼吸道感染。另有研究指出，CP的持續(xù)性感染還可能增加動脈硬化、急性心肌梗死、盆腔炎等疾病的發(fā)生風險［8］。國外的一項調(diào)研結(jié)果顯示，CP在社區(qū)獲得性肺炎病因中排名第二［9］。

研究顯示，CP感染可引起以細胞免疫為主的免疫應答，機體免疫系統(tǒng)主要通過各種免疫應答反應來對病原體的侵襲進行防御，其中體液免疫利用血清抗體發(fā)揮防御作用，細胞免疫則能有效清除病原體。各種免疫應答途徑會讓機體的淋巴細胞亞群呈現(xiàn)不同變化，而兒童對感染的免疫反應通常要比成人更為活躍。在機體受到病原體侵襲時，T細胞會收到來自于抗原提呈細胞呈遞的外源性抗原肽，T淋巴細胞被激活后，CD4+T淋巴細胞會促進T細胞向效應細胞轉(zhuǎn)化，并釋放活性物質(zhì)增加B細胞和巨噬細胞的活性，進而引發(fā)免疫損傷［10］。CD8+T細胞活化后會產(chǎn)生細胞毒性，其在脫顆粒作用下釋放顆粒酶B、穿孔素，從而對靶細胞造成損傷。本研究顯示，RSV組和CP組的CD4+/CD8+絕對計數(shù)較健康對照組增高，表明不論是RSV感染還是CP感染均會引起不同程度的免疫功能紊亂，具體表現(xiàn)為CD8+T細胞減少。本研究中RSV感染與CP感染患兒比較，RSV組的外周血CD3+CD4+、CD4+/CD8+絕對計數(shù)更高，CD3-CD56/16+百分比更低。有研究指出，不論病原體是病毒還是細菌，均會造成外周血CD3+、CD8+T淋巴細胞減少，CD4+/CD8+T淋巴細胞升高［11］，因為患兒的肺部受到病原體感染后發(fā)生免疫功能失調(diào)，機體對抗原的殺傷力減弱，體液免疫水平下調(diào)，所以不能有效地將病原菌清除體外。RSV與CP感染引起的外周血淋巴細胞亞群變化存在差異，與國內(nèi)相關報道結(jié)論有類似之處［12］。本研究結(jié)果顯示，相較于RSV感染，CP組NK細胞百分比更高。NK細胞參與機體的固有免疫，會對病原體和被感染細胞產(chǎn)生直接的殺傷作用，并且還能通過促進IFN-γ的分泌來調(diào)節(jié)細胞免疫，NK細胞減少可造成IFN-γ分泌減少，造成Th1/Th2免疫失衡。進一步的血清細胞因子檢測發(fā)現(xiàn)，CP組的血清IFN-γ水平高于RSV組，可能是因為CP是一種細胞內(nèi)細菌，感染單核細胞、巨噬細胞引發(fā)的特異性細胞免疫反應表現(xiàn)為淋巴細胞增殖、IFN-γ分泌。研究證實，CP感染能夠減少繼發(fā)感染，因為該免疫過程是由CD4+T細胞反應所介導，而CD4+T細胞識別的抗原能夠在隨后的感染中發(fā)揮保護作用［13］。IL-10為抑制適應性免疫反應的嗜性細胞因子，幾乎所有免疫細胞都能表達IL-10的兩個亞單位，但主要由CD4+T細胞表達，故免疫細胞較易受到IL-10的抑制作用。臨床認為RSV引起的肺部疾病與宿主的適應性免疫反應密切相關，本研究發(fā)現(xiàn)RSV組的CD4+T細胞百分比、血清IL-10水平均高于CP組，與國外報道結(jié)論相符［14］，表明RSV感染引起的CD4+T細胞反應更為強烈，調(diào)節(jié)效應T細胞反應使得IL-10分泌增加，IL-10可對T細胞介導的肺部炎癥及損傷發(fā)揮抑制作用，其在調(diào)節(jié)RSV的適應性免疫反應中發(fā)揮著重要作用。

特異性的CD4+T細胞能夠識別CP抗原，主要利用CD4+細胞分泌的IFN-γ對CP抗原發(fā)揮溶解作用，Th2細胞無法控制CP感染一方面與IFN-γ的缺乏有關，另一方面則與Th2細胞無法攻擊受感染細胞有關。CP感染引起的免疫反應以Th2反應為主導，而IFN-γ、IL-10等細胞因子均參與Th1/Th2平衡調(diào)節(jié)。本研究通過比較不同感染程度患兒的血清細胞因子水平發(fā)現(xiàn)，急性感染者的血清TGF-β1、IL-17、IL-10、IFN-γ水平明顯更高，與相關文獻報道結(jié)論相符［15］，說明不論是RSV還是PC感染引起的小兒肺炎，急性發(fā)病引起的適應性免疫反應更為明顯，并且這種免疫反應會隨著時間的推移而減弱。

綜上所述，RSV和CP感染引起的外周血淋巴細胞亞群變化存在一定差異，二者分別主要通過調(diào)節(jié)IL-10和IFN-γ表達來影響CD4+T細胞亞群，引起細胞免疫異常，通過檢測外周血淋巴細胞亞群及相關血清細胞因子可為臨床判定小兒肺炎感染類型提供一定依據(jù)。