血清外泌體miR-21診斷心肌梗死后心室重塑的價值

盧凱 余紅

心肌梗死后常伴隨心室重塑，由此導致的心臟泵衰竭可反復發(fā)作，心血管事件發(fā)生率明顯增加，盡早尋找到能夠反映心肌梗死后心室重塑的指標，對指導臨床治療、療效評估及預后分析具有重要價值。近年來，研究發(fā)現(xiàn)了一種由細胞分泌的外泌體，是一種100 nm左右大小的囊泡，可以作為細胞的“信使”，擁有傳遞生物信息的作用，廣泛存在于唾液、尿液、血液等體液中，可用于診斷、治療疾?。?］。在不同病理生理狀態(tài)下，循環(huán)中外泌體內(nèi)含物會有明顯改變，心肌梗死后循環(huán)中外泌體的表達譜亦明顯改變［2］。miR-21被發(fā)現(xiàn)參與心肌纖維化過程［3］，而心肌梗死后循環(huán)中外泌體miR-21的改變尚未有報道。筆者通過觀察心肌梗死后心室重塑患者循環(huán)中外泌體miR-21的變化，探討其與心室重塑指標和心功能的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 連續(xù)收集2017年1月至2019年12月在湖州市第一人民醫(yī)院確診的心肌梗死后心室重塑患者102例，作為觀察組。（1）納入標準：符合心肌梗死的診斷標準［4］；心功能NYHA分級在II～IV級；可配合完成研究調(diào)查；臨床資料完整。（2）排除標準：處于疾病終末期；存在多臟器功能衰竭、嚴重感染、合并惡性腫瘤者；既往有心肌梗死病史；不能配合研究者。其中，男50例，女52例；年齡（62.8±10.2）歲。另隨機選取同期來院進行健康體檢者50例，作為對照組。其中，男25例，女25例；年齡（63.40±9.80）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 研究方法 （1）收集資料：包括血常規(guī)、血脂、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）等實驗室檢查指標和左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fractions，LVEF）、左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左室舒張末期容積（left ventricular end systolic volume，LVEDV）等心臟超聲檢查參數(shù)。（2）血清外泌體提取及鑒定：使用血清外泌體提取試劑盒（美國Sigma-Aldrich公司），按照試劑盒說明進行操作。收集的外泌體樣品采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測外泌體表面標記CD63、CD9的表達，應用電鏡觀察外泌體的形態(tài)及大小。（3）外泌體miR-21的提取與測定：采用TRIzol RNA分離試劑（美國賽默飛公司）提取外泌體總RNA，并監(jiān)測RNA純度，以吸光度＞1.80 D用于后續(xù)檢測；采用miR反轉錄試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司）將總RNA反轉錄為cDNA；應用熒光定量PCR儀（美國ABI公司）比較兩組血清外泌體中miR-21的表達差異，SYBR RT-PCR試劑購自日本TaKaRa公司，以線蟲cel-miR-39（廣州銳博生物科技有限公司）作為內(nèi)參。采用相對Cq法（△Cq）分析miR-21表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以［n（%）］表示，采用χ2檢驗；外泌體miR-21表達與LVEF、BNP、LVEDD、LVEDV等心臟超聲參數(shù)進行Pearson相關性分析；構建受試者工作特征（ROC）曲線分析外泌體miR-21對心肌梗死合并心室重塑的診斷價值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組的基線資料比較 組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性，詳見表1。

表1 兩組的基線資料比較

2.2 兩組血清外泌體的鑒定 電鏡下觀察到的外泌體是一種直徑約100 nm，具有雙層膜結構的囊泡（圖1A），與文獻報道相同［5］。Western blot檢測外泌體表面標記蛋白CD63、CD9，見圖1B。

圖1 血清外泌體的鑒定

2.3 兩組的血清外泌體miR-21表達水平比較 觀察組的血清外泌體miR-21相對表達水平（50.70±3.78）顯著高于對照組（3.17±0.62），差異有統(tǒng)計學意義（t=6.752，P＜0.001）。

2.4 心肌梗死后心室重塑患者循環(huán)中外泌體miR-21與NYHA心功能分級的關系 按照NYHA心功能分級進行分組，發(fā)現(xiàn)隨著心功能等級的加重，外泌體miR-21水平明顯增加，提示外泌體miR-21水平與心功能惡化、患者病情嚴重程度相關。見表2。

表2 外泌體miR-21表達水平與NYHA心功能分級的關系

2.5 兩組的心室重塑指標比較 觀察組心臟超聲的LVEDV、LVEDD明顯高于對照組，而LVEF低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組的心室重塑指標比較（±s）

表3 兩組的心室重塑指標比較（±s）

項目 對照組（n=50） 觀察組（n=102） t值 P值LVEDV（mL） 85.43±13.14 105.45±24.73 3.452 0.041 LVEDD（mm） 48.14±2.52 58.74±3.72 1.823 0.038 LVEF（%） 65.14±4.12 50.41±6.23 1.675 0.044

2.6 血清外泌體miR-21與各臨床指標的相關性分析外泌體miR-21與LVEF呈負相關（r=-0.653，P=0.032），與BNP呈正相關（r=0.545，P=0.044），與LVEDD呈正相關（r=0.672，P=0.041），與LVEDV呈正相關（r=0.641，P=0.021）。

2.7 外泌體miR-21對心肌梗死合并心室重塑的診斷價值 外泌體miR-21對心肌梗死后心室重塑的ROC曲線線下面積（AUC）為0.876（95%CI 0.789～0.962），在最佳截斷值處的靈敏度為83.30%、特異度為80.00%。見圖2。

圖2 外泌體miR-21診斷心肌梗死合并心室重塑的ROC曲線

3 討論

隨著心肌梗死早期冠狀動脈血運重建術的開展，心肌梗死的病死率逐漸降低，盡管結合規(guī)范的藥物治療，但這部分存活下來的患者的遠期并發(fā)癥較多，心血管事件的再發(fā)生率及住院率仍較高［6］，可能與心肌細胞壞死、凋亡導致不可逆的心室重塑有關，主要表現(xiàn)為進行性發(fā)展、心室擴張，最終導致不可逆的心功能不全［7］。臨床上，早期無嚴重并發(fā)癥的心肌梗死患者無明顯心室重塑的表現(xiàn)，部分患者以并發(fā)急性心力衰竭再入院，因此尋找兼具特異度和靈敏度的血清指標對心肌梗死后并發(fā)心室重塑的診療具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后循環(huán)中外泌體內(nèi)含物發(fā)生改變，并參與心臟損傷及修復的過程［8］，因此通過觀察外泌體的改變可能有助于早期發(fā)現(xiàn)心肌梗死后的心室重塑。

微小RNA（miR）是一類具有轉錄后調(diào)控功能的非編碼RNA，由20多個核苷酸組成，參與真核細胞基因表達、分化、發(fā)育等生理過程［9］。近年來，miR在疾病生理病理中的作用以及臨床診斷價值逐漸被發(fā)現(xiàn)，比如循環(huán)miR用于腫瘤診斷及預后預測的價值得到提升、心肌梗死后異常升高的miR可能輔助臨床診斷等［10-12］。因此，循環(huán)miR的改變可能成為未來心血管疾病診斷的重要標志物。但部分miR可能由于外泌體的包裹，導致其單純在循環(huán)中的表達可能不高［13］，但又可能在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，因此監(jiān)測這部分miR的表達改變對理解疾病的病理生理過程至關重要。

miR-21最初是在心臟成纖維細胞中選擇性表達被發(fā)現(xiàn)，參與心衰患者心臟結構和功能的改變［14-15］，而抑制miR-21的表達可以逆轉心室重塑［16-17］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在冠心病患者血清中的表達明顯增高，尤其是發(fā)生心肌梗死的患者［18］，miR-21可能參與加劇心肌纖維化進程來促進心肌梗死后心室重塑的過程［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后心室重塑患者的血清外泌體miR-21表達水平顯著升高，且與疾病嚴重程度相關，心功能等級越差則其表達越高。進一步分析發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-21的表達與BNP、LVEDD、LVEDV存在正相關，與LEVF呈負相關，提示外泌體miR-21參與心肌梗死后心室重塑的病理生理過程，外泌體miR-21表達升高亦提示預后不良。而且，外泌體miR-21診斷心肌梗死后心室重塑的ROC曲線的AUC值為0.876（0.789，0.962），在最佳截斷值處的靈敏度為83.30%、特異度為80.00%。由此可見，外泌體miR-21對診斷心肌梗死后心室重塑具有較高的特異度和靈敏度，值得臨床上推廣應用。

綜上所述，血清外泌體miR-21水平的升高與心肌梗死后并發(fā)心室重塑相關，特異度、靈敏度均較高，可以作為心肌梗死后預測心室重塑的指標。