利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)金槍魚制品中的鰹魚成分

許文杰，李秋萍，崔曉文，操敏，李壹，熊曉輝,2，熊雄*

1(南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京，211816)2(江蘇省食品安全快速檢測(cè)公共技術(shù)服務(wù)中心，江蘇 南京，211816)

金槍魚族是屬于硬骨魚綱鱸形目鯖科的魚類，包含細(xì)鰹屬(Allothunnus)、舵鰹屬(Auxis)、巴鰹屬(Euthynnus)、鰹屬(Katsuwonus)、金槍魚屬(Thunnus)等5屬15種金槍魚[1]。鰹魚(Katsuwonuspelamis)是鰹屬中唯一品種，在金槍魚漁業(yè)中有著舉足輕重的地位。2018年，鰹魚捕撈量為316萬 t，占金槍魚捕撈總量的56%以上[2]。

金槍魚肉質(zhì)鮮美，具有高蛋白、低脂肪等特點(diǎn)，并且富含豐富的二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)與二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)等不飽和脂肪酸，是最受消費(fèi)者歡迎的鯖科魚類品種之一。然而，金槍魚較少以鮮活的形式進(jìn)行出售，通常被加工成生魚片、罐頭、肉松等制品。由于加工破壞了其外形特征，傳統(tǒng)的形態(tài)特征鑒別法已經(jīng)不能滿足金槍魚的物種鑒別。在這種情況下，一些不法商販為牟取暴利，在金槍魚及其制品的貿(mào)易過程中摻假、造假，以次充好的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。安麗艷等[3]采用PCR測(cè)序技術(shù)鑒定金槍魚罐頭中金槍魚品種，在17個(gè)市售樣品中，發(fā)現(xiàn)58.8%來源于價(jià)格低廉的鰹魚。SOTELO等[4]對(duì)6個(gè)歐洲國(guó)家的545份金槍魚(新鮮、冷凍和罐頭產(chǎn)品)進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)總體標(biāo)簽錯(cuò)誤率為6.79%，新鮮和冷凍產(chǎn)品為6.70%，罐頭產(chǎn)品為7.84%。金槍魚市場(chǎng)魚目混雜，標(biāo)示不清，水產(chǎn)品的摻假行為在媒體中頻頻曝光，引起了消費(fèi)者的恐慌。因此，為了保護(hù)消費(fèi)者經(jīng)濟(jì)利益、維護(hù)消費(fèi)者的合法權(quán)益，急需一種靈敏、特異、快速的金槍魚及其制品的鑒定方法。

基于DNA的檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于水產(chǎn)品檢測(cè)[5-7]。目前，已經(jīng)報(bào)道的鑒定方法有DNA條形碼法[8]、核苷酸測(cè)序法[3]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法[9]、PCR限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法[10-11]、多重PCR瓊脂糖電泳法[12]。其中，多重PCR瓊脂糖電泳法靈敏度較低，近物種鑒定易出現(xiàn)假陽(yáng)性；DNA條形碼法需要測(cè)序，鑒定周期長(zhǎng)。此外，DNA條形碼法還存在依賴參考的數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)不夠完善、核內(nèi)DNA條形碼和混合物種樣品單一條形碼獲取困難等不確定因素。但至今為止，采用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)檢測(cè)金槍魚的研究報(bào)道比較少見。

LAMP技術(shù)是NOTOMI等[13]于2000年提出的一種核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)依賴Bst DNA聚合酶在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)靶基因的自循環(huán)鏈置換合成反應(yīng)，引物能識(shí)別基因的6個(gè)或8個(gè)獨(dú)立區(qū)域，特異性較PCR大大提高。另外，反應(yīng)的溫度處于恒溫條件(60～65 ℃)，普通水浴鍋就可以滿足擴(kuò)增的需求，節(jié)省了檢測(cè)費(fèi)用。檢測(cè)結(jié)果可以通過可視化判別，在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入熒光染料SYBR Green I，產(chǎn)物結(jié)合染料后發(fā)出綠色熒光。目前已有LAMP技術(shù)應(yīng)用于食源性致病菌、轉(zhuǎn)基因成分、過敏源成分[14-15]、動(dòng)物源成分[19-20]等檢測(cè)方面的研究。本研究以鰹魚的線粒體Cytb基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)LAMP反應(yīng)特異性引物，構(gòu)建LAMP反應(yīng)體系，建立一種鰹魚的特異性快速檢測(cè)技術(shù)，為金槍魚制品的摻假鑒偽提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品的采集

22種水產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)品來自本課題組前期研究，包括Katsuwonuspelamis(MK843764)、Thunnusobesus(MN893173)、T.albocaves(MN893174)、T.alalunga(MN893175)、Scomberniphonius(MN879568)、Scomberspp(MK843721)、Scomberscombrus(MN893176)、Oyprinuscarpio(MK843655)、Collaectenes(MK84666)、Larimichrhyscrocea(MK843674)、Lateolabraxjaponicus(MK843686)、Odontobutispotamophila(MK843730)、Patagonotothenramsayt(MK843753)、Alabtrosstdpecoralls(MK843767)、Pangashushypophthalms(MK843766)、Micropterussalmoides(MK843768)、Clenopharyngodonidella(MK843773)、LophiusHitulon(MN850429)、Oncorhymnchusmykiss(MN850431)、Carassiusauratus(MK843660)、Mugilcephalus(MN893207)、S.salar(MN850430)。22種樣品均進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和DNA條形碼鑒定，且標(biāo)準(zhǔn)品的DNA條形碼序列已提交至GenBank，并獲得登錄號(hào)(已備注在對(duì)應(yīng)物種的括號(hào)內(nèi))。

此外，2019年11月～12月，從市場(chǎng)共采集39份預(yù)包裝金槍魚產(chǎn)品(表1)，包括19份肉松產(chǎn)品(編號(hào)為XWJ1-XWJ19)和20份罐裝制品(編號(hào)為XWJ20-XWJ39)。所有產(chǎn)品抵達(dá)實(shí)驗(yàn)室后需進(jìn)行拍照和標(biāo)記，并記錄好產(chǎn)品標(biāo)簽上的信息。當(dāng)產(chǎn)品包裝內(nèi)有多個(gè)獨(dú)立小包裝時(shí)，每個(gè)小包裝需單獨(dú)取樣，共計(jì)取樣59份(表1)，樣品于-18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

DP304細(xì)胞/血液/組織基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；6×Loading Buffer、dNTP Mix，寶生物工程(大連)有限公司；等溫?cái)U(kuò)增混合液、2×Taq PCR Master Mix、引物合成，上海生工生物工程股份有限公司；Bst DNA聚合酶大片段、MgSO4溶液、10×ThermoPol緩沖液，美國(guó)New England Biolabs公司；SYBR Green I染料(10 000×)，北京索萊寶科技有限公司。

表1 市售樣品的采集與鑒定結(jié)果Table 1 Collection and identification results of municipal samples

1.2 儀器與設(shè)備

BioPhotometer D30核酸蛋白測(cè)定儀，德國(guó)艾本德股份有限公司；1-14k臺(tái)式小型離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；MS-100恒溫混勻儀，杭州奧盛儀器有限公司；Gentier 96全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)，西安天隆科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取

按照DNA提取試劑盒說明書對(duì)市售樣品的DNA進(jìn)行提取，取50 mg樣品于1.5 mL離心管中，先加入200 μL Buffer GA，渦旋振蕩15 s；再加20 μL蛋白酶K(20 mg/mL)溶液，渦旋混勻后將其置于恒溫混勻器中1 500 r/min 56 ℃加熱45 min。最后，加入200 μL Buffer GB，充分顛倒混勻后置于恒溫混勻器中1 500 r/min 70 ℃加熱10 min。將所得混合物轉(zhuǎn)移至吸附柱CB3中，依次加入500 μL Buffer GD和600 μL漂洗液PW，混勻后均以12 000 r/min離心30 s，最后，向吸附膜的中間懸空滴加100 μL洗脫液TE。

DNA的質(zhì)量檢測(cè)：采用BioPhotometer D30核酸蛋白測(cè)定儀分別測(cè)定DNA在230、260和280 nm的吸光值，計(jì)算A260/A280和A260/A230值，同時(shí)測(cè)定DNA濃度。對(duì)符合純度要求的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)其完整性，純度和完整性均符合要求的DNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)

從GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載鰹魚(JN086155、KJ617258、EF392591、EF439208、DQ080321)的基因序列信息。并使用BioEdit軟件進(jìn)行序列比對(duì)，篩選出種間差異比較大的Cytb序列作為檢測(cè)基因，此外，下載非目標(biāo)物種，長(zhǎng)鰭金槍魚(AB101291)、黃鰭金槍魚(JN086153)、馬蘇金槍魚(KF925362)、大眼金槍魚(GU256525)、藍(lán)鰭金槍魚(KF906720)等的Cytb基因序列，確保鰹魚和非目標(biāo)物種之間的錯(cuò)配，以保證引物的特異性。根據(jù)LAMP引物設(shè)計(jì)原則，利用在線PrimerExplorerV4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設(shè)計(jì)LAMP引物，包括外引物(F3、B3)、內(nèi)引物(FIP、BIP)，引物則委托上海生工生物有限公司合成，序列見表2。

表2 本研究所用引物Table 2 The sequence of primers

1.3.3 LAMP 反應(yīng)體系建立及條件優(yōu)化

LAMP反應(yīng)體系25 μL，含1.4 mmol/L dNTP Mix、1 μL Bst DNA 聚合酶、6 mmol/L MgSO4、2.5 μL 10×ThermoPol緩沖液、1 μL 5×SYBR Green Ⅰ、上游外引物(F3)0.2 μmol/L、下游外引物(B3)0.2 μmol/L、上游內(nèi)引物(FIP)1.6 μmol/L、下游內(nèi)引物(BIP)1.6 μmol/L、模板DNA 1 μL，剩下用無菌水補(bǔ)足至25 μL。采用恒溫實(shí)時(shí)熒光法檢測(cè)，將混合物置于65 ℃恒溫反應(yīng)60 min，最后在80 ℃下10 min結(jié)束反應(yīng)。也可通過向LAMP產(chǎn)物中加入1 μL稀釋倍數(shù)為100的 SYBR Green I染料肉眼觀察擴(kuò)增情況，在紫外燈下，顏色變綠表明發(fā)生了擴(kuò)增，橙色表明未發(fā)生擴(kuò)增。

對(duì)該LAMP反應(yīng)體系中的Mg2+濃度、外引物、內(nèi)引物、dNTP Mix、10×ThermoPol緩沖液等因素進(jìn)行優(yōu)化，確定最終的最優(yōu)反應(yīng)體系。

1.3.4 PCR擴(kuò)增

采用DNA條形碼通用引物(表2)擴(kuò)增市售DNA樣品，采用25 μL的PCR體系，其中2×Taq PCR Master Mix體系預(yù)混液12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，加無菌水補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 變性30 s，53 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.3.5 市售樣品檢測(cè)

利用試驗(yàn)建立的LAMP方法進(jìn)行市售樣品的檢測(cè)，并與DNA條形碼檢測(cè)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證其方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP試驗(yàn)條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 內(nèi)外引物濃度比的優(yōu)化

選取外引物與內(nèi)引物濃度比梯度依次為1∶4、1∶6、1∶8、和1∶10分別進(jìn)行LAMP反應(yīng)，觀察陽(yáng)性反應(yīng)出現(xiàn)的快慢，從而確認(rèn)引物濃度比對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的影響，以此結(jié)果確定最佳引物濃度比。由圖1可知，試驗(yàn)選用1∶8引物濃度比擴(kuò)增效果較好。

圖1 內(nèi)外引物濃度比的優(yōu)化Fig.1 Optimization of primer concentration ratio inside and outside

2.1.2 Mg2+濃度的優(yōu)化

在最佳的引物濃度比的反應(yīng)體系下，選擇優(yōu)化Mg2+濃度，Mg2+是較為重要的試劑之一，能影響B(tài)st DNA聚合酶的活性，反應(yīng)過程中起到降低反應(yīng)所需要的活化能的作用。選取Mg2+濃度梯度依次為0、2、4和6 mmol/L分別進(jìn)行LAMP反應(yīng)。由圖2可知，在檢測(cè)濃度范圍內(nèi)隨Mg2+濃度的升高，促進(jìn)了反應(yīng)的進(jìn)行，當(dāng)達(dá)到6 mmol/L濃度時(shí)，最利于反應(yīng)的進(jìn)行。

圖2 Mg2+濃度的優(yōu)化Fig.2 Mg2+ optimization of concentration

2.1.3 dNTP Mix濃度的優(yōu)化

dNTP是LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的原料，dNTP Mix濃度分別為1.0、1.2、1.4和1.6 mmol/L進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。由圖3可知，當(dāng)dNTP Mix濃度為1.6 mmol/L為最適濃度。

圖3 dNTP Mix濃度的優(yōu)化Fig.3 dNTP Mix concentration optimization

2.1.4 10×ThermoPol緩沖液濃度的優(yōu)化

10×ThermoPol緩沖液體系添加量梯度為0.5、1.5、2.5和3.5 μL，其他條件下相同。由圖4可以看出，在檢測(cè)濃度范圍內(nèi)隨濃度的升高，促進(jìn)了反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)添加量為3.5 μL時(shí)，最利于反應(yīng)的進(jìn)行。

圖4 10×ThermoPol緩沖液濃度的優(yōu)化Fig.4 10×ThermoPol optimization of buffer concentration

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

以鰹魚和其他22個(gè)非目標(biāo)物種的DNA為模板，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，驗(yàn)證引物的特異性。擴(kuò)增產(chǎn)物采用實(shí)時(shí)熒光法進(jìn)行檢測(cè)。如圖5所示，空白對(duì)照和對(duì)照樣品均未發(fā)生擴(kuò)增，以鰹魚DNA為模板的試驗(yàn)組出現(xiàn)擴(kuò)增，表明該體系具有良好的特異性。

圖5 特異性檢測(cè)Fig.5 Specific detection

2.3 靈敏度試驗(yàn)分析

將鰹魚的基因組DNA進(jìn)行倍比稀釋，質(zhì)量濃度設(shè)定為50、5、0.5、0.05 ng/μL。作為反應(yīng)模板進(jìn)行擴(kuò)增，確定方法的靈敏度。如圖6所示，該試驗(yàn)所建立的LAMP體系的靈敏度為0.05 ng/μL。

圖6 靈敏度檢測(cè)Fig.6 Sensitivity detection

2.4 市售樣品檢測(cè)結(jié)果

為了評(píng)價(jià)所建立LAMP方法的適用性和可行性，本研究采集了59份市售樣品進(jìn)行了鑒定(圖7、圖8)。檢測(cè)結(jié)果通過擴(kuò)增曲線和可視化2種方式進(jìn)行判別，觀察反應(yīng)產(chǎn)物在紫外燈下是否有熒光產(chǎn)生。結(jié)果顯示，肉松制品鑒定結(jié)果不含目標(biāo)成分，罐頭制品中6個(gè)樣本鑒定結(jié)果為鰹魚，其余樣本均為非目標(biāo)物種。由此可得，LAMP鑒定結(jié)果與DNA條形碼鑒定結(jié)果一致。

圖7 市售樣品鑒定Fig.7 Sample identification

a-肉松制品；b-罐頭制品圖8 市售樣品可視化結(jié)果Fig.8 Visual results of marketed samples 注：(-)：無菌水；(+)：陽(yáng)性對(duì)照

2.5 討論

在物種屬性鑒別領(lǐng)域，DNA條形碼技術(shù)是一種較為成熟的分子檢測(cè)技術(shù)。其理論依據(jù)是使用一段標(biāo)準(zhǔn)DNA片段，通過測(cè)序獲得樣品的線粒體序列，達(dá)到物種鑒定的目的。但是對(duì)于深加工制品，由于含有多種混合DNA，而檢測(cè)用引物是通用引物，存在極大的漏檢可能性。

LAMP技術(shù)目前在魚類物種鑒定中已廣泛使用，而建立高效快速的LAMP體系的基礎(chǔ)是特異性引物的設(shè)計(jì)。常用于魚類物種鑒定中的目的基因有COⅠ基因、16S rRNA基因、Cytb基因和12S rRNA基因。通過大量序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)相互間的遺傳距離，證實(shí)了Cytb基因作為目的基因的可行性。

傳統(tǒng)的LAMP法仍存在一些不足。濁度法檢測(cè)需要積累大量的擴(kuò)增子，當(dāng)?shù)涂截惖哪０宕嬖跁r(shí)焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生較少，肉眼判斷困難；鈣黃綠素法引入的Mn2+增加了Bst聚合酶錯(cuò)配的機(jī)率，且鈣黃綠素的熒光背景降低了檢測(cè)的靈敏度；可視化LAMP熒光染料SYBR GreenⅠ在水溶液中本身不發(fā)光，DNA存在時(shí)熒光顯著增強(qiáng)。該方法直接通過可視化比色判定檢測(cè)結(jié)果，具有快速、直觀、低成本等優(yōu)點(diǎn)。

3 結(jié)論

本研究建立了基于Cytb基因的鰹魚LAMP檢測(cè)方法，建立的方法具有特異性強(qiáng)、快速的優(yōu)點(diǎn)。在基因組DNA水平為0.05 ng/μL時(shí)，即可檢出。同時(shí)將LAMP擴(kuò)增技術(shù)與熒光染料相結(jié)合，即添加指示劑實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)結(jié)果。與DNA條形碼鑒定方法相比，該方法不需要復(fù)雜的熱循環(huán)控溫儀器，同時(shí)也提高了檢測(cè)效率降低了檢測(cè)成本，適用于大規(guī)模樣品的初篩，為監(jiān)管機(jī)構(gòu)快速檢測(cè)金槍魚制品的物種提供技術(shù)支持。