乳酸菌發(fā)酵刺梨汁體外降血糖、降血脂活性研究

馮丹丹，胡萍，許浩翔，張珺，石媛媛，吳文燕，李娟，左云洋，李久長

(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽，550025)

刺梨 (RosaroxburghiiTratt) 為薔薇科薔薇屬野生植物[1]，廣泛分布于中國西南部和中南部山區(qū)，富含維生素 C、超氧化歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、多糖、黃酮、多酚、三萜類化合物等多種活性成分[2]，具有抗氧化、防癌、防治重金屬毒性、抗衰老、降血脂等多種功效[3-4]。益生性的乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)對人體健康的作用持續(xù)受到國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注，研究表明，利用一些益生乳酸菌株發(fā)酵果制品，不但具有特殊風(fēng)味與口感，還提高了果蔬制品的營養(yǎng)價值[5]。但是，目前有關(guān)乳酸菌發(fā)酵刺梨的研究還鮮有報道。

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，由環(huán)境、遺傳、胰島素分泌與作用不足等因素共同作用所致，并伴隨著肥胖、心血管疾病、腎功能衰竭、高血壓、腦梗塞、胰腺炎等并發(fā)癥，是嚴(yán)重威脅人類健康的第三大疾病。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計，中國-東盟地區(qū)糖尿病患病人數(shù)位居全球第一位，對于糖尿病的預(yù)防和治療的研究已刻不容緩[6-7]。而肥胖是脂肪過度積蓄導(dǎo)致機(jī)體超重的一種慢性代謝類疾病，還會導(dǎo)致其他慢性疾病的發(fā)展，如非酒精性脂肪性肝病、二型糖尿病和心血管疾病[8]。

本研究利用前期實驗篩選出的發(fā)酵刺梨性能較好的3株乳酸菌(副干酪乳桿菌SR10-1、干酪乳桿菌H1和發(fā)酵乳桿菌GZSC-1)，通過體外抑制α-葡萄糖苷酶活性與葡萄糖延遲透析指數(shù)評價3株乳酸菌的菌懸液、胞外分泌物和乳酸菌發(fā)酵刺梨汁體外降血糖的能力；以膽酸鹽結(jié)合能力、抑制胰脂肪酶活性與結(jié)合膽固醇膠束的能力來評價體外降血脂的能力。為研究乳酸菌發(fā)酵刺梨汁功能特性提供依據(jù)，為篩選功能菌株開發(fā)發(fā)酵型刺梨制品提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

刺梨汁：刺梨鮮果經(jīng)打漿、過濾、超高溫瞬時滅菌(ultra-high temperature instantaneous sterilization，UHT)滅菌后無菌灌裝，取1 000 g/袋1～2袋備用；副干酪乳桿菌SR10-1(LactobacillusparacaseiSR10-1)(CCTCC NO：M2016527),為課題組前期從侗族發(fā)酵酸肉制品中分離得到[9]；干酪乳桿菌H1(LactobacilluscaseiH1，CCTCC NO：M2016524)，由課題組從苗族酸湯中分離鑒定所得優(yōu)勢乳酸菌；發(fā)酵乳桿菌(LactobacillusfermentumGZSC-1)，為實驗室保藏菌種；透析袋MD34(7 000 D)，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗試劑

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)，上海源葉生物科技有限公司；蒽酮、對硝基苯-α-D-葡萄糖苷、甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c，上海麥克林生化科技有限公司；胃蛋白酶1∶3 000、胰蛋白酶1∶250、膽固醇、卵磷脂(大豆)，北京索萊寶科技有限公司；豬胰脂肪酶，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化鈉、碳酸鈉、油酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、酚酞、無水乙醇、硫酸、氫氧化鈉、鹽酸均為分析純；MRS培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基，北京路橋技術(shù)股份有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

AR223CN電子分析天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司；TGL20M臺式高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；L5S紫外可見分光光度計、雷磁PHS-3C test0205 PH計，上海儀電分析儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋、HPX-9082 MBE 數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱、立式滅菌鍋BXM-30R，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；MB1001 型多功能食品加工機(jī)，上海云輝電器有限公司；數(shù)字折射計，浙江托普云農(nóng)科股份有限公司；超凈工作臺SW-CJ-IFD，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 發(fā)酵劑的制備

無菌條件下分別接種副干酪乳桿菌SR10-1、干酪乳桿菌H1和發(fā)酵乳桿菌GZSC-1至MRS肉湯培養(yǎng)基中，置于37 ℃分別培養(yǎng)48、24、60 h，然后分別離心收集菌體，用0.85%的生理鹽水調(diào)整菌液濃度為109CFU/mL備用。

1.4.2 乳酸菌菌懸液與胞外分泌物的制備

無菌條件下接種乳酸菌至MRS肉湯培養(yǎng)基中，置于37 ℃無菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)(SR10-1培養(yǎng)48 h，H1培養(yǎng)24 h，GZSC-1培養(yǎng)60 h)，離心收集菌體與上清液，上清液為乳酸菌胞外分泌物；用0.85%的生理鹽水調(diào)整菌液濃度為109CFU/mL，即為乳酸菌菌懸液。

1.4.3 乳酸菌發(fā)酵刺梨汁的制備

每個菌株按照預(yù)實驗已優(yōu)化的發(fā)酵工藝制備發(fā)酵刺梨汁如下：

(1)副干酪乳桿菌SR10-1發(fā)酵刺梨汁的制備

將刺梨汁與水按體積比1∶4混合，加入9.7%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))白砂糖，接入4.3% SR10-1，于32 ℃發(fā)酵64.5 h，離心取上清液，即為SR10-1發(fā)酵刺梨汁樣品。

(2)干酪乳桿菌H1發(fā)酵刺梨汁的制備

將刺梨汁與水按體積比1∶3 混合，加入20%白砂糖，接入5% H1，于25 ℃發(fā)酵72 h，離心取上清液，即為H1發(fā)酵刺梨汁樣品。

(3)發(fā)酵乳桿菌GZSC-1發(fā)酵刺梨汁的制備

將刺梨汁與水按體積比1∶3 混合，加入15%白砂糖，接入3% GZSC-1，于30 ℃發(fā)酵40 h，離心取上清液，即為GZSC-1發(fā)酵刺梨汁樣品。

1.4.4 體外降血糖活性的測定

1.4.4.1 α-葡萄糖苷酶抑制率的測定

參考KUMAR等[10]的方法略有改動，取100 μL一定濃度的樣液，加入50 μL使用pH=7.0 PBS緩沖溶液配制的1 U/mL 的α-葡萄糖苷酶，在37 ℃的條件下孵育15 min，以50 μL 10 g/L的對硝基苯α-D-葡萄糖苷作為底物，混勻后于37 ℃ 進(jìn)行水浴10 min，最后用100 μL 0.1 mol/L的 Na2CO3終止反應(yīng)，在405 nm處測量吸光度，記為A1，將不加酶的作為對照，記為A2，不受抑制的酶作為空白，記為A3。以樣品的濃度為自變量，α-葡萄糖苷酶抑制率為因變量，進(jìn)行一次曲線擬合，根據(jù)擬合方程計算IC50值，如公式(1)所示：

(1)

1.4.4.2 葡萄糖透析延遲指數(shù)(glucose dialysis retardation index，GDRI)的測定

參考DAOU等[11]的方法。在10 mL 100 mmol/L 的葡萄糖溶液中加入1 mL樣品，在37 ℃ 下恒溫連續(xù)振蕩1 h，之后轉(zhuǎn)移至截留分子量為7 000的透析袋中，將透析袋放入盛有150 mL去離子水的燒杯中，在37 ℃下恒溫連續(xù)振蕩1 h，每隔30 min吸取2 mL樣液，使用蒽酮-硫酸法測定葡萄糖含量。樣品對空腸營養(yǎng)吸收的的影響用GDRI來表示，計算如公式(2)所示：

(2)

式中：GDRI為葡萄糖透析延遲指數(shù)，%；C1為樣品中葡萄糖含量，g/L；C2為對照葡萄糖含量，g/L

1.4.4.3 葡萄糖含量的測定

使用蒽酮硫酸法并稍作修改[12]，取0.1 g蒽酮放入80%濃硫酸中配制成0.1%蒽酮硫酸溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。取2 mL一定濃度樣品于具塞比色管中，加入6 mL 0.1%蒽酮硫酸溶液，混勻后沸水浴顯色15 min，之后用冰水浴至室溫，于620 nm處測吸光度。取6個具塞比色管，分別加入0.1 g/L葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 mL，相對應(yīng)的分別加入蒸餾水 2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、0.8 mL，以上述方法測定葡萄糖含量，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算葡萄糖含量。

王洪學(xué)：PHA可降解農(nóng)膜克服了傳統(tǒng)不可降解材料的弊端，具有比較明顯的優(yōu)勢。第一，材料的加工性能大幅提升。在工業(yè)級地膜生產(chǎn)設(shè)備上可制造出6微米以下的地膜，薄膜厚度最薄達(dá)到3微米左右。第二，地膜的綜合材料性能大幅提升，同時實現(xiàn)高強(qiáng)度和高韌性，拉伸強(qiáng)度超過35MPa，斷裂伸長率超過670%，滿足機(jī)械鋪膜要求。第三，地膜的使用壽命可根據(jù)作物的生長需求調(diào)節(jié)，可滿足不同氣候條件、不同作物的需要。第四，完全符合生物降解要求，相對生物分解率高。第五，材料成本較現(xiàn)有生物降解地膜降低40%左右，單位面積農(nóng)田的覆膜用量有所減少，可節(jié)省農(nóng)民購買地膜開支和回收地膜的用工成本。

1.4.5 體外降血脂活性的測定

1.4.5.1 結(jié)合膽酸鹽能力的測定

根據(jù)錢雅雯等[13]方法有所修改。將甘氨膽酸鈉分別配制為0.03、0.06、0.09、0.12、0.18、0.24、0.3 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；將牛磺膽酸鈉分別配制為 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。分別取2 mL膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL具塞試管中，加入60% H2SO4于70 ℃水浴40 min，取出冰浴5 min，387 nm處測定其吸光度，以溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，分別繪制甘氨膽酸鈉與牛磺膽酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

取3 mL不同濃度的樣品放入三角瓶中，加入3 mL 10 g/L胃蛋白酶與1 mL 0.01 mol/L鹽酸，在37 ℃ 恒溫振蕩箱中振蕩1 h，模擬胃部消化；用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6.3，加入4 mL 10 g/L胰蛋白酶，在37 ℃恒溫振蕩箱中振蕩1 h，模擬腸消化。一份三角瓶加入4 mL 0.4 mmol/L甘氨膽酸鈉，另一份加入4 mL 0.5 mmol/L?；悄懰徕c，于37 ℃下恒溫振蕩1 h，之后4 000 r/min離心20 min，取上清液2 mL，用硫酸比色法測定膽酸鹽含量，計算如公式(3)和公式(4)所示：

(3)

(4)

式中：R1為甘氨膽酸鈉結(jié)合能力，mmol/mL；N1為甘氨膽酸鈉加入量，mmol；N2為甘氨膽酸鈉剩余量，mmol；V1為樣品加入體積，mL；A為樣品稀釋倍數(shù)；R2為?；悄懰徕c結(jié)合能力，mmol/mL；N3為?；悄懰徕c加入量，mmol；N4為牛磺膽酸鈉剩余量，mmol；V2為樣品加入體積，mL。

1.4.5.2 抑制胰脂肪酶活性的測定

根據(jù)文獻(xiàn)方法[14]稍做修改。在三角瓶中加入2.5 mL 0.025 mol/L PBS(pH=7.4)與1 mL 聚乙烯醇三油酸甘油酯乳化液，在37 ℃生化培養(yǎng)箱中預(yù)熱10 min，預(yù)熱后加入1 mL樣品在37 ℃放置10 min，之后加入1 mL 100 g/L豬胰脂肪酶(使用pH=7.4，0.025 mol/L PBS溶液配制)，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)15 min，反應(yīng)結(jié)束后立刻加入10 mL 95%無水乙醇，終止酶反應(yīng)，加入酚酞指示劑3滴，使用0.025 mol/L的NaOH溶液滴至微紅，空白組不加胰脂肪酶與樣品，對照組加樣品但是不加胰脂肪酶，使用公式(5)計算脂肪酶活性：

(5)

式中：U為每克胰脂肪酶中所含酶活力，IU；V1為樣品組消耗NaOH溶液的體積，mL；V2為空白組消耗NaOH溶液的體積，mL；V3為對照組消耗NaOH溶液的體積，mL；c為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；t為加入胰脂肪酶后的反應(yīng)時間，min；w為胰脂肪酶的添加量，g

測出酶活性之后，利用公式(6)計算其抑制率：

(6)

1.4.5.3 結(jié)合膽固醇膠束能力的測定

參照文獻(xiàn)[15]，將膽固醇、油酸與卵磷脂溶于甲醇中，溶解干燥后加入?；悄懰徕c、NaCl與15 mmol/L PBS(pH=7.4)緩沖溶液，使1 mL膽固醇膠束中含10 mmol/L?；悄懰徕c、5 mmol/L膽固醇、5 mmol/L油酸、2.4 mmol/L卵磷脂、132 mmol/L NaCl與15 mmol/L PBS(pH=7.4)緩沖溶液，使膠束溶液于37 ℃保存24 h后即可使用。取3 mL膽固醇膠束放入50 mL錐形瓶中，加入1 mL樣品，37 ℃恒溫振蕩2 h，12 000 r/min離心20 min取上清液，使用試劑盒測定其膽固醇含量，空白組不加入樣品，膽固醇結(jié)合能力與降解率利用公式(7)和公式(8)計算：

膽固醇結(jié)合能力/(μmol·mL-1)

(7)

膽固醇結(jié)合率/%

(8)

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有試驗重復(fù) 3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，并進(jìn)行方差分析，使用 Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵刺梨汁體外降血糖活性

2.1.1 對α-葡萄糖苷酶活性的影響

α-葡萄糖苷酶是一種能催化水解纖維素并合成功能性低聚糖類的水解酶，它直接參與了淀粉與糖原的代謝途徑，這也是引起餐后血糖升高的重要原因[16]。通過抑制腸黏膜上的α-葡萄糖苷酶活性，使淀粉分解為葡萄糖的速度減緩，減少和延緩小腸對葡萄糖的吸收以降低血糖，常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑為阿卡波糖、伏格列波糖[17]。本研究以阿卡波糖為參照藥品，通過觀察樣品對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率，分析其體外降血糖的活性。

從表1中可知，SR10-1的菌懸液與胞外分泌物、H1胞外分泌物對α-葡萄糖苷酶有著極強(qiáng)的抑制能力，抑制率達(dá)到了(97.89±1.11)%、(94.07±1.56)%、(94.52±2.51)%。H1與GZSC-1菌懸液對α-葡萄糖苷酶活性均小于自己的胞外分泌物，這可能是具有 α-葡萄糖苷酶抑制能力的菌株的胞外分泌物，通過自身代謝物質(zhì)增強(qiáng)降血糖活性[18]，而不同菌株產(chǎn)生該類胞外物質(zhì)的能力不一。此結(jié)果表明SR10-1的菌體與代謝物質(zhì)在抑制α-葡萄糖苷酶的活性上，都有著很強(qiáng)的降血糖能力。

IC50表示當(dāng)樣品對α-葡萄糖苷酶活性抑制率達(dá)到50%時樣品的濃度，IC50越小表示抑制α-葡萄糖苷酶活性越強(qiáng)。從表2中可知，刺梨汁在經(jīng)過SR10-1發(fā)酵后，IC50值降低了(33.62±6.56)%，這與表1中的數(shù)據(jù)相印證。SR10-1具有很強(qiáng)的抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力，在利用其發(fā)酵刺梨汁后，提升了抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力。刺梨汁經(jīng)過發(fā)酵乳桿菌GZSC-1與干酪乳桿菌H1發(fā)酵后抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力均降低，說明采用不同的乳酸菌發(fā)酵刺梨汁對抑制α-葡萄糖苷酶活性存在差異。

表1 三株乳酸菌菌懸液與胞外分泌物對 α-葡萄糖苷酶活性抑制率Table 1 Inhibition rate of α-glucosidase activity by three strains of lactic acid bacteria suspensions and extracellular secretions

表2 刺梨汁、乳酸菌發(fā)酵刺梨汁、阿卡波糖對 α-葡萄糖苷酶活性抑制率IC50值Table 2 The scavenging rate IC50 of Rosa roxburghii Tratt juice, lactic acid bacteria fermented Rosa roxburghii Tratt juice, and ascorbic acid on α-glucosidase activity

2.1.2 乳酸菌發(fā)酵刺梨汁對GDRI的影響

GDRI是通過透析的方式，反映葡萄糖在胃腸道延遲吸收的體外指標(biāo)，用于考察對胃腸道葡萄糖吸收延遲的影響[19]。

在透析30 min后，SR10-1發(fā)酵刺梨汁GDRI達(dá)到(92.62±4.31)%，顯著高于其他樣品(P<0.05)，其次為GZSC-1發(fā)酵刺梨汁(50.50±3.45)%，而刺梨汁的GDRI為41.00%，說明經(jīng)過SR10-1與GZSC-1發(fā)酵后的刺梨汁可提高GDRI。而干酪乳桿菌H1的菌體與代謝物質(zhì)的GDRI值為2.2%～4.56%，延遲葡萄糖吸收能力較弱，H1發(fā)酵刺梨汁對比刺梨汁，GDRI下降了(86.73±1.23)%，這說明發(fā)酵菌種不同，對刺梨汁的降血糖能力影響有很大差異。

在透析60 min后，所有樣品的GDRI值都顯著性下降(P<0.05)，這是因為隨著透析時間延長，樣品對葡萄糖的吸附接近飽和，不能吸附更多的葡萄糖。有研究表明，葡萄糖在胃腸道中的吸附延遲主要是由于纖維黏度與纖維結(jié)構(gòu)所致[20]，說明刺梨汁中含有的膳食纖維和不溶性多糖對葡萄糖分子有一定的吸附作用。SR10-1與GZSC-1這2株乳酸菌菌體與代謝產(chǎn)物具有一定吸附葡萄糖的能力，刺梨汁經(jīng)過SR10-1與GZSC-1發(fā)酵后，增加了膳食纖維或胞外多糖的含量，從而提高了吸附葡萄糖的能力，其中SR10-1在發(fā)酵刺梨汁后所產(chǎn)生的可溶性纖維較多，不容易在水中分散溶脹，纖維的大顆粒尺寸可以明顯增加懸浮液的黏度，進(jìn)而提高吸附葡萄糖的能力[21]。

圖1 三株乳酸菌菌懸液與胞外分泌物、發(fā)酵刺梨汁、 刺梨汁GDRIFig.1 The glucose dialysis delay indexes of three strains of lactic acid bacteria suspension and extracellular secretions, fermented Rosa roxburghii Tratt juice, Rosa roxburghii Tratt juice

2.2 乳酸菌發(fā)酵刺梨汁體外降血脂活性

2.2.1 結(jié)合膽酸鹽能力

膽汁酸通常不作為游離膽汁酸存在于人的膽汁中，主要以甘氨酸和?；撬岬慕Y(jié)合物形式存在，體積比為3∶1。膽汁鹽(膽汁酸的鈉鹽)是由肝臟分泌，它是一種強(qiáng)力乳化劑，它在腸道中可以幫助脂肪以及脂溶性的營養(yǎng)物質(zhì)水解，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體的消化和吸收。乳化完成后，脂肪酸和甘油酸被小腸下部吸收，膽汁鹽被重新吸收回肝臟，形成內(nèi)部循環(huán)。因此，降低腸道中膽酸鹽的含量，可以作為表征降血脂的一項直觀指標(biāo)。

圖2結(jié)果表明，3株乳酸菌對?；悄懰徕c的結(jié)合能力均顯著高于甘氨膽酸鈉的結(jié)合能力(P<0.05)。結(jié)合甘氨膽酸鈉的能力由高到低的順序：H1菌懸液>SR10-1菌懸液=GZSC-1菌懸液>H1胞外分泌物>SR10-1胞外分泌物=GZSC-1胞外分泌物，干酪乳桿菌H1在結(jié)合甘氨膽酸鈉的能力上顯著高于副干酪乳桿菌SR10-1與發(fā)酵乳桿菌GZSC-1(P<0.05)。結(jié)合?；悄懰徕c的能力由高到低的順序：H1菌懸液>GZSC-1菌懸液>SR10-1菌懸液>H1胞外分泌物>SR10-1胞外分泌物>GZSC-1胞外分泌物。乳酸菌結(jié)合膽酸鹽能力可能于其產(chǎn)生的膽鹽水解酶，在厭氧條件下催化分離結(jié)合態(tài)的膽鹽為去結(jié)合型膽鹽有關(guān)[22]，從而提高膽酸鹽結(jié)合能力。

圖2 三株乳酸菌菌懸液與胞外分泌物對2種膽酸鹽結(jié)合能力Fig.2 The binding ability of three strains of LAB suspensions and extracellular secretions to two cholate saltes 注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

由圖3可知，刺梨汁經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后結(jié)合甘氨膽酸鈉的能力均顯著提高(P<0.05)，并且顯著高于乳酸菌本身(P<0.05)，說明刺梨汁與乳酸菌發(fā)酵在結(jié)合膽酸鹽的能力上有增效作用。其中副干酪乳桿菌SR10-1提升能力最佳，顯著強(qiáng)于干酪乳桿菌H1與發(fā)酵乳桿菌GZSC-1(P<0.05)。刺梨汁對?；悄懰徕c沒有結(jié)合能力，H1和GZSC-1發(fā)酵刺梨汁僅為0.02～0.03 mmol/mL，SR10-1發(fā)酵刺梨汁結(jié)合?；悄懰徕c能力為(1.10±0.03)mmol/mL。在經(jīng)過SR10-1發(fā)酵后顯著提升了刺梨汁結(jié)合牛磺膽酸鈉的能力(P<0.05)，也顯著強(qiáng)于H1與GZSC-1發(fā)酵刺梨汁(P<0.05)。這與惠潔等[23]研究的荷葉方經(jīng)發(fā)酵后高于發(fā)酵前的結(jié)合膽酸鹽能力結(jié)果相似，可能原因為乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生胞外多糖有關(guān)，從而減少膽鹽的吸收[24]。

圖3 刺梨汁、乳酸菌發(fā)酵刺梨汁對2種膽酸鹽結(jié)合能力Fig.3 The binding abilities of Rosa roxburghii Tratt juice and LAB fermented Rosa roxburghii Tratt juice to two cholate salts

2.2.2 抑制胰脂肪酶活性

當(dāng)人體攝入的食物進(jìn)入腸道后，腸道中的胰脂肪酶(pancreatic lipase，PL)將脂肪分解為單酰甘油與游離的脂肪酸，導(dǎo)致血脂升高。研究表明，通過抑制PL的活性，減少機(jī)體對脂肪的消化與吸收，可以有效改善肥胖與高血脂等癥狀[25]，最終達(dá)到降血脂的目的。

圖4結(jié)果表明，3株乳酸菌的菌懸液中，GZSC-1菌懸液抑制胰脂肪酶能力最強(qiáng)，抑制率為(29.2±3.10)%，高于H1菌懸液抑制率(19.24±1.31)%與SR10-1菌懸液的抑制率(10.03±1.45)%。

圖4 三株乳酸菌菌懸液與胞外分泌物、3株乳酸菌 發(fā)酵刺梨汁、刺梨汁對胰脂肪酶抑制率Fig.4 Inhibition rate of pancreatic lipase on three strains of LAB suspension and extracellular secretions, three strains of LAB fermented Rosa roxburghii Tratt juice and Rosa roxburghii Tratt juice

在3株乳酸菌的胞外分泌物中，H1胞外分泌物抑制胰脂肪酶能力最強(qiáng)，抑制率為(68.79±3.54)%，高于SR10-1胞外分泌物抑制率(60.00±4.54)%與GZSC-1胞外分泌物抑制率(21.60±2.33)%。然而，經(jīng)過3株乳酸菌發(fā)酵后的刺梨汁在胰脂肪酶抑制率上顯著低于刺梨汁(P<0.05)。在抑制胰脂肪酶的能力上，刺梨汁抑制率為(58.87±3.44)%，H1發(fā)酵刺梨汁抑制率為(29.93±2.40)%，SR10-1發(fā)酵刺梨汁抑制率為(24.54±2.01)%，GZSC-1發(fā)酵刺梨汁抑制率為(13.70±1.87)%。因此，H1胞外分泌物對抑制胰脂肪酶活性最高，其次為SR10-1胞外分泌物與刺梨汁。

2.2.3 結(jié)合膽固醇膠束能力

膽固醇是動物組織和腸腔中含量最豐富的類固醇，是血脂中一項重要的指標(biāo)。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，糖尿病、心臟病、心血管疾病、心梗、慢性腎炎等繼發(fā)性疾病的發(fā)生與血脂中總膽固醇的升高密切相關(guān)[26]，所以降低血液中膽固醇含量，能夠有效地控制相關(guān)疾病的發(fā)生。

表3結(jié)果表明，3株乳酸菌的菌懸液與胞外分泌物中只有SR10-1菌懸液具有結(jié)合膽固醇的能力，結(jié)合能力為(0.05±0.001)μmol/mL、結(jié)合率為(1.12±0.04)%，結(jié)合能力較低，其余菌懸液與胞外分泌物均沒有降解結(jié)合膽固醇的能力。

表3 三株乳酸菌菌懸液與胞外分泌物、3株乳酸菌 發(fā)酵刺梨汁、刺梨汁結(jié)合膽固醇膠束能力與結(jié)合率Table 3 Three LAB strains suspensions and extracellular secretions, three LAB strains fermented Rosa roxburghii Tratt juice and Rosa roxburghii Tratt juice binding cholesterol micelles and binding rate

但是，在利用乳酸菌發(fā)酵刺梨汁后均提升了刺梨汁結(jié)合膽固醇的能力，其中副干酪乳桿菌SR10-1發(fā)酵后的刺梨汁提升結(jié)合膽固醇能力最強(qiáng)，結(jié)合膽固醇能力達(dá)到(2.78±0.06)μmol/mL，對比刺梨汁，膽固醇結(jié)合率提升了33%。其次為發(fā)酵乳桿菌GZSC-1發(fā)酵刺梨汁，結(jié)合膽固醇能力(2.61±0.04)μmol/mL，對比刺梨汁膽固醇結(jié)合率提升28.9%。另外，干酪乳桿菌H1發(fā)酵刺梨汁，結(jié)合膽固醇能力為(2.23±0.03)μmol/mL，對比刺梨汁膽固醇結(jié)合率提升了18.8%。膽固醇結(jié)合率提升可能原因除了乳酸菌中的膽鹽水解酶結(jié)合膽鹽為游離膽鹽后，與膽固醇形成共沉淀之外，也可能通過細(xì)胞壁、細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)吸附膽固醇，亦或者產(chǎn)生酶或某種物質(zhì)將膽固醇代謝為其他物質(zhì)，從而降低膽固醇含量[27]。

3 結(jié)論

本研究通過體外抑制α-葡萄糖苷酶酶活性與GDRI，膽酸鹽結(jié)合能力、抑制胰脂肪酶活性與結(jié)合膽固醇膠束來評價3株乳酸菌的菌懸液、胞外分泌物及其乳酸菌發(fā)酵刺梨汁的體外降血糖、降血脂活性。降血糖能力上，SR10-1菌懸液與胞外分泌物、H1胞外分泌物對α-葡萄糖苷酶有著極強(qiáng)的抑制能力。刺梨汁經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，SR10-1發(fā)酵刺梨汁提升了抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力(P<0.05)。與其他組相比，SR10-1、H1發(fā)酵刺梨汁均能提高GDRI值，以SR10-1發(fā)酵刺梨汁最為顯著(P<0.05)。降血脂能力上，刺梨汁經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后，結(jié)合膽酸鹽與膽固醇膠束能力均得到提高，其中SR10-1發(fā)酵刺梨汁顯著高于其他組(P<0.05)。刺梨汁、SR10-1胞外分泌物、H1胞外分泌物的抑制胰脂肪酶活性顯著高于其他組(P<0.05)。綜合結(jié)果得出：乳酸菌發(fā)酵刺梨汁可增強(qiáng)刺梨汁降血糖和降血脂的功效，但不同的乳酸菌株發(fā)酵刺梨汁功能活性差異較大，其中副干酪乳桿菌SR10-1發(fā)酵刺梨汁降血糖、降血脂綜合能力最強(qiáng)，這為乳酸菌發(fā)酵刺梨汁的體外功能性評價提供了依據(jù)，今后還需運用多組學(xué)等手段全面解析乳酸菌發(fā)酵刺梨汁活性成分組成與含量，探討不同菌種發(fā)酵特異性，闡明功能強(qiáng)化相關(guān)性以及可能存在的協(xié)同增效作用，進(jìn)一步研究其在體內(nèi)的作用效果和機(jī)理。