益生菌附屬發(fā)酵劑對切達(dá)干酪質(zhì)構(gòu)、游離氨基酸和短鏈脂肪酸的影響

王超，高磊，趙子健，趙玉娟，楊舸，牛春華，李盛鈺*

1(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，國家乳品加工技術(shù)研發(fā)分中心，吉林 長春，130033)2(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連，116034)

干酪的微生物生態(tài)系統(tǒng)組成主要由干酪加工過程中添加的中溫乳球菌(如Lactococcuslactissubsp.Cremoris，Lactococcuslactissubsp.lactis)為主，或以添加非發(fā)酵劑乳酸菌(non-starter lactic acid bacteria，NSLAB)為輔[1-2]，如乳桿菌(Lactobacillus)、片球菌(Pediococcus)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)等，這些附屬發(fā)酵菌株單獨或聯(lián)合使用，有助于促進(jìn)干酪中蛋白和脂肪的酶解，產(chǎn)生游離氨基酸、脂肪酸和風(fēng)味物質(zhì)，可以改善干酪的口感、風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)和營養(yǎng)特性[3-8]。

益生菌干酪是指在干酪加工過程中添加益生菌為附屬發(fā)酵劑制成的干酪產(chǎn)品[9-10]。益生菌賦予了干酪新的功能，提升干酪品質(zhì)和安全性并對健康有促進(jìn)作用。同時，干酪的高脂肪、高蛋白、低含氧量等理化性質(zhì)是附屬發(fā)酵劑益生菌的優(yōu)良載體[11]，有利于菌株存活。因此，這類益生菌與干酪完美結(jié)合的新型干酪產(chǎn)品成為當(dāng)前功能食品領(lǐng)域的研究熱點。目前，商業(yè)上應(yīng)用的附屬發(fā)酵劑主要為乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的菌株，其他功能性益生菌株應(yīng)用于干酪的研究較少。篩選具有優(yōu)良發(fā)酵特性和功能作用的益生菌附屬發(fā)酵劑，對于開發(fā)益生菌干酪新產(chǎn)品具有十分重要的意義。本研究團(tuán)隊前期篩選評價獲得2株功能益生菌新菌株，其中1株為降血脂和改善脂肪肝作用的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)NA136[12-13]，另1株為具有預(yù)防和治療早期動脈粥樣硬化的乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)AS185[14]，且2株菌具有較好的耐受、黏附、產(chǎn)酸和生長特性，本研究以這2株益生菌為附屬發(fā)酵劑加工益生菌切達(dá)干酪，評價益生菌對干酪品質(zhì)提升的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌(L.plantarum)NA136由本實驗室分離自延吉農(nóng)家酸菜，現(xiàn)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC NO:M 2018112)；乳酸片球菌(P.acidilactici)AS185由本實驗室分離自延吉農(nóng)家黃豆醬，現(xiàn)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC NO:M 2018114)；商品發(fā)酵劑R707(由乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcuslactis.subsp.lactis)和乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcuslactis.subsp.cremoris)組成)、凝乳酶(CHY-MAX Power NB)，丹麥科漢森公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋，日本Sanyo公司；BCN-1360B無菌超凈工作臺，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；HZQ-Q電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒實驗設(shè)備有限公司；Sorvall Evolotion RC高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo公司；Lacto Star乳成分含量分析儀，德國Gerber公司；HYCV-407干酪槽、HYPC-4壓榨機(jī)，黑龍江赫益乳業(yè)科技有限公司；SHP-60勻漿機(jī)，上海科學(xué)技術(shù)大學(xué)機(jī)電廠；Testo205 pH計，德國Testo公司；TA.XT plus物性分析儀，英國Stable Micro Systems公司；1260高效液相色譜儀、7890B-7000D氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司。

1.3 培養(yǎng)基

改良MRS培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10.0，牛肉浸粉 10.0，酵母浸粉 2.0，磷酸氫二鉀 2.0，無水乙酸鈉5.0，枸櫞酸三銨 2.0，硫酸鎂 0.2，硫酸錳 0.05，吐溫-80 1.0，葡萄糖 20.0，碳酸鈣 5.0，瓊脂粉 20.0，pH=6.0～6.5，115 ℃高壓滅菌20 min。

改良M17培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10.0，牛肉膏 5.0，酵母膏 2.5，磷酸甘油二鈉 10.0，硫酸鎂 0.25，異抗壞血酸鈉 0.5，瓊脂粉 20.0，pH=7.1～7.2，115 ℃高壓滅菌20 min。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌懸液制備

植物乳桿菌NA136和乳酸片球菌AS185的凍存菌種經(jīng)連續(xù)傳代活化后，分別接種于改良MRS及M17液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)16 h后，離心(5 000 r/min，4 ℃，10 min)，去上清液，用PBS溶液(pH=7.2)洗滌菌體沉淀，再重懸于PBS溶液中，調(diào)整菌液濃度為1.0×1010CFU/mL，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 切達(dá)干酪制作與分組

切達(dá)干酪加工工藝如下：

原料乳→過濾→巴氏殺菌(63 ℃，30 min)→冷卻(37 ℃)→接種商品發(fā)酵劑和益生菌(NA136或AS185)→發(fā)酵(37 ℃，60 min)→添加氯化鈣(0.1 g/L)→添加凝乳酶(0.014 g/L)→凝乳(37 ℃，35～50 min)→切割凝塊→攪拌、熱燙(30 min內(nèi)升溫至42 ℃)→排乳清→堆釀→破碎凝塊→拌鹽(2%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))→預(yù)壓榨(0.2 MPa，1.5 h)→壓榨(0.5 MPa，20 h)→真空包裝→貯存成熟(8～12 ℃，相對濕度70%)。

干酪制作分組：分為對照組、NA136組和AS185組，對照組僅接種商品發(fā)酵劑(R707 0.03 g/L)，NA136組和AS185組接種商品發(fā)酵劑的同時分別添加對應(yīng)的菌懸液，并使其在原料乳中的終濃度達(dá)到1.0×108CFU/mL。

1.4.3 理化指標(biāo)測定

蛋白質(zhì)含量測定參照GB 5009.5—2016，脂肪含量測定參照GB 5009.6—2016，水分含量測定參照GB 5009.3—2016，pH值測定用Testo205 pH計。

1.4.4 活菌數(shù)測定

分別在干酪成熟期的第1、30、60、90天取干酪樣品10 g，用90 mL 2%無菌檸檬酸鈉溶液(40 ℃)進(jìn)行均漿處理(2 min)，經(jīng)無菌生理鹽水倍比稀釋后，分別涂布于改良MRS和M17固體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計數(shù)。改良MRS固體培養(yǎng)基用于乳桿菌的分離計數(shù)，改良M17固體培養(yǎng)基用于乳球菌的分離計數(shù)。

1.4.5 質(zhì)構(gòu)測定

分別在干酪成熟期的第1、30、60、90天取干酪樣品1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm，室溫放置2 h后，利用物性分析儀對干酪進(jìn)行全質(zhì)構(gòu)分析。選擇P/5探頭，設(shè)定測量前探頭下降速度為1.0 mm/s，測試速度為1.0 mm/s，測量后探頭回程速度為5.0 mm/s，下壓變形為10.0 mm，觸發(fā)力為0.2 N。

1.4.6 游離氨基酸測定

分別取不同成熟期(1、30、60、90 d)干酪凍干粉樣品30 mg，采用HPLC分析游離氨基酸含量。色譜分析條件：C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：A：0.1 mol/L 97%無水乙酸鈉乙腈溶液(pH=6.5)，B：80%乙腈水溶液；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；檢測波長：254 nm。

1.4.7 短鏈脂肪酸測定

分別取不同成熟期(1、30、60、90 d)干酪凍干粉樣品30 mg，采用LC/MS分析短鏈脂肪酸含量。色譜分析條件：HP-INNOWAX色譜柱(25 m×0.20 mm×0.40 μm)；升溫程序：100 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至150 ℃，再以30 ℃/min升至240 ℃，保持30 min；進(jìn)樣口溫度：240 ℃；載氣流速：1.0 mL/min，不分流；質(zhì)譜分析條件：離子源溫度：200 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；質(zhì)譜：EI源轟擊電壓：70 eV，單離子掃描模式：定量離子60、73。

1.4.8 感官評定

在干酪成熟90 d時進(jìn)行感官評定。選取10名對色、味、質(zhì)屬性敏感的資深專家組成評定小組(男∶女=1∶1)，對干酪的外型、色澤、紋理圖案、滋味、氣味和組織狀態(tài)進(jìn)行感官評定。評定細(xì)則參照RHB 501—2004《切達(dá)干酪感官質(zhì)量評鑒細(xì)則》，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 切達(dá)干酪感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation score of Cheddar cheeses

1.5 數(shù)據(jù)分析

每組實驗重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，采用GraphPad Prism 6.0軟件作圖，采用CANOCO 4.5軟件對質(zhì)構(gòu)、游離氨基酸和短鏈脂肪酸數(shù)據(jù)進(jìn)行冗余分析(redundancy analysis，RDA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌對干酪成熟期間基本理化指標(biāo)的影響

由表2可知，在干酪成熟期間，3組干酪中的蛋白質(zhì)、水分含量及pH值之間存在差異(P<0.05)，脂肪含量無差異(P>0.05)；同一成熟期內(nèi)各指標(biāo)無差異，組分變化符合切達(dá)干酪成分含量標(biāo)準(zhǔn)(蛋白質(zhì)20%～30%，脂肪20%～34%，水分<39%，pH<5.3)(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。這與ONG等[15]和段翠翠等[16]的研究結(jié)果一致，即添加附屬發(fā)酵劑乳酸菌對干酪的基本理化指標(biāo)無影響。說明這2株菌可作為附屬發(fā)酵劑用于切達(dá)干酪的生產(chǎn)。

2.2 益生菌對干酪成熟期間活菌數(shù)的影響

益生菌干酪在成熟期內(nèi)保持較高的活菌數(shù)，同時益生菌對干酪的品質(zhì)無不良影響，是生產(chǎn)益生菌干酪對附屬發(fā)酵劑益生菌的基本要求[17]。由圖1可知，益生菌干酪因添加了L.plantarumNA136或P.acidilacticiAS185而使其乳桿菌數(shù)(圖1-a)或乳球菌數(shù)(圖1-b)明顯高于對照組。各組的活菌數(shù)隨干酪成熟逐漸降低；在成熟90 d時，益生菌組活菌數(shù)均高于對照組，且益生菌數(shù)均在7.5 lgCFU/g以上，符合益生菌食品的活菌數(shù)要求(活菌數(shù)≥107CFU/g)[17-18]。此外，由圖1-a發(fā)現(xiàn)，在第1天時，對照組和AS185組中已檢測到了少量的乳桿菌存在，且隨成熟期延長，乳桿菌含量在增加并于后期趨于穩(wěn)定。這與GARDE等[19]研究結(jié)果一致，即這些乳桿菌可能來源于加工環(huán)境。

表2 干酪成熟期間基本理化指標(biāo)變化Table 2 Changes in physicochemical composition during cheese ripening

a-乳桿菌活菌數(shù)；b-乳球菌活菌數(shù)圖1 干酪成熟期間活菌數(shù)的變化Fig.1 Changes in viable counts during cheese ripening

2.3 益生菌對干酪成熟期間質(zhì)構(gòu)的影響

應(yīng)用物性分析儀對干酪的硬度、咀嚼性、黏聚性、回復(fù)性進(jìn)行分析，可反應(yīng)干酪的質(zhì)構(gòu)特性[20]。由表3可知，隨成熟期延長，各組干酪的硬度和咀嚼度在逐漸增加，黏聚性和回復(fù)性在逐漸降低(P<0.05)；在同一成熟期內(nèi)，益生菌組干酪的硬度均低于對照組，可能是益生菌添加促進(jìn)了蛋白質(zhì)水解，使酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)變松散，干酪硬度下降、質(zhì)地變軟[21]。與對照組相比，益生菌對干酪咀嚼度、黏聚性和回復(fù)性無顯著影響，這與添加L.plantarum或P.acidilactici菌株為附屬發(fā)酵劑的益生菌干酪分析結(jié)果一致[5, 16]，益生菌添加對干酪咀嚼度、黏聚性和回復(fù)性影響不顯著。

2.4 益生菌對干酪成熟期間游離氨基酸含量的影響

在干酪成熟期間，益生菌附屬發(fā)酵劑與主發(fā)酵劑菌株共同組成干酪的微生物群落，益生菌產(chǎn)生的多種蛋白酶促進(jìn)了游離氨基酸的產(chǎn)生和干酪風(fēng)味的形成[22]。由表4可以知，3組干酪中均檢測出17種游離氨基酸，且隨成熟期延長，游離氨基酸總量逐漸增加。我們的研究結(jié)果進(jìn)一步證實CIOCIA等[23]和STEFANOVIC等[24]的實驗結(jié)論，他們的研究發(fā)現(xiàn)，添加植物乳桿菌或副干酪乳桿菌，顯著影響干酪中二級蛋白質(zhì)的水解并促進(jìn)游離氨基酸的產(chǎn)生。

表3 干酪成熟期間質(zhì)構(gòu)指標(biāo)變化Table 3 Changes in texture characteristics during cheese ripening

表4 干酪成熟期間游離氨基酸含量變化 單位：mg/kg

2.5 益生菌對干酪成熟期間短鏈脂肪酸含量的影響

干酪成熟期間，短鏈脂肪酸因感官閾值較低直接貢獻(xiàn)干酪的芳香味道，同時也是甲基酮、醇、內(nèi)酯、醛和酯等其他重要風(fēng)味化合物的前體[25]。由表5可知，3組干酪中，隨成熟期延長，短鏈脂肪酸含量變化存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，總體比較，乳酸片球菌AS185對脂質(zhì)降解的程度要好于植物乳桿菌NA136。各組乙酸含量顯著高于其他短鏈脂肪酸，且與對照組相比，NA136組和AS185組乙酸含量先增后降，這可能是由于益生菌在干酪成熟前期活性較強(qiáng)，促進(jìn)乳酸代謝產(chǎn)生乙酸，后期含量降低可能與乙酸作為前體合成其他風(fēng)味物質(zhì)有關(guān)[26]。在ONG等[15]和EUGSTER等[5]的研究中也證實，益生菌對干酪中乙酸的增加有促進(jìn)作用。在成熟90 d時，NA136組和AS185組丁酸含量顯著高于對照組(P<0.05)。ATASOY等[27]研究指出，丁酸具有典型的奶酪味，風(fēng)味較好的切達(dá)干酪中丁酸含量在4.5～5.0 mg/kg。本研究中益生菌干酪中的丁酸含量在這一范圍內(nèi)，說明益生菌對干酪的風(fēng)味形成有促進(jìn)作用。另外，其他種類的短鏈脂肪酸含量較低，這也與MOREIRA等[28]的研究結(jié)果一致。

表5 干酪成熟期間短鏈脂肪酸含量變化 單位：mg/kg

2.6 益生菌與干酪質(zhì)構(gòu)、游離氨基酸和短鏈脂肪酸的關(guān)系

采用RDA對成熟90 d干酪中游離氨基酸、短鏈脂肪酸含量與質(zhì)構(gòu)的關(guān)系進(jìn)行了分析(圖2)。NA136組干酪的咀嚼度與天冬氨酸、絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、丙酸和丁酸有一定的相關(guān)性，說明NA136對上述的生成有促進(jìn)作用(圖2-a)。NA136也影響了丙酸和丁酸的產(chǎn)生(圖2-b)，并與干酪的咀嚼度有關(guān)。另外，AS185更有利于干酪中苯丙氨酸、酪氨酸、賴氨酸、脯氨酸、精氨酸及異丁酸、異戊酸、戊酸等風(fēng)味物質(zhì)的形成，但對干酪的質(zhì)構(gòu)無影響。

2.7 益生菌干酪感官評定

成熟期為90 d的3組干酪感官評定結(jié)果如圖3所示。可以看出，益生菌對干酪的外型、色澤沒有任何影響，但對干酪的紋理圖案、滋味、氣味和組織狀態(tài)產(chǎn)生了一些影響。益生菌干酪的紋理圖案和組織狀態(tài)得分略低于對照組，而滋味和氣味的得分略高于對照組，綜合得分略低于対照組，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。這可能是因為益生菌能夠促進(jìn)蛋白及脂肪的水解，使得干酪的質(zhì)地變軟，而導(dǎo)致切達(dá)干酪中固有的“雞胸紋”圖案紋理不夠清晰，但同時又產(chǎn)生了一些風(fēng)味物質(zhì)，促進(jìn)干酪風(fēng)味的形成[28]。也有研究指出，添加益生菌可輕微改變干酪的感官特性，但不會對產(chǎn)品的銷售產(chǎn)生不利影響[5, 15]，本研究結(jié)果也得到了證實。

1～3-對照組；4～6-NA136組；7～9-AS185組 a-游離氨基酸含量與質(zhì)構(gòu)的關(guān)系；b-短鏈脂肪酸含量 與質(zhì)構(gòu)的關(guān)系圖2 干酪中游離氨基酸和短鏈脂肪酸含量與質(zhì)構(gòu)的關(guān)系Fig.2 Associations of texture and free amino acids and short-chain fatty acids in cheese

圖3 成熟90 d干酪感官評分Fig.3 Sensory score of cheeses ripened after 90 days

3 結(jié)論

本研究以自主分離鑒定的植物乳桿菌NA136和乳酸片球菌AS185為附屬發(fā)酵劑應(yīng)用于切達(dá)干酪。益生菌對切達(dá)干酪的理化指標(biāo)和質(zhì)構(gòu)無不良影響，并促進(jìn)了干酪中的蛋白質(zhì)的水解、游離氨基酸和短鏈脂肪酸的生成，對干酪風(fēng)味的形成和品質(zhì)的提升起到了促進(jìn)作用。綜上所述，植物乳桿菌NA136和乳酸片球菌AS185可作為附屬發(fā)酵劑用于益生菌干酪的生產(chǎn)。