多花黃精炮制前后不同極性部位抗氧化與降血糖活性研究

滕歡歡，王仁中，吳德玲，金傳山，柳春風，唐旭，黃圣卓，許鳳清*

1(安徽中醫(yī)藥大學 藥學院，安徽 合肥，230012)2(安徽中醫(yī)藥大學,中藥飲片制造新技術安徽省重點實驗室，安徽 合肥，230012) 3(金寨潤元生物科技有限公司，安徽 六安，237300)4(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所,海南省黎藥資源天然產(chǎn)物研究與 利用重點實驗室，海南 海口，571101)

糖尿病是一種嚴重影響人體健康的代謝性疾病，常伴有嚴重的并發(fā)癥，如神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜病變、腎病等[1]。近年來，大量的研究表明氧化應激的發(fā)生是糖尿病及其并發(fā)癥的主要發(fā)病機理之一[2]。而抗氧化劑能夠消除體內(nèi)過多的自由基，防止氧化損傷，是預防和治療糖尿病及其并發(fā)癥的有效手段。α-葡萄糖苷酶則是糖尿病患者餐后血糖控制不佳的主要原因之一，抑制α-葡萄糖苷酶可以有效地避免餐后血糖飆升并預防糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。目前常用的抗氧化劑及α-葡萄糖苷酶抑制劑多為合成的藥物，開發(fā)安全有效的天然抗氧化劑和α-葡糖苷酶抑制劑在食品和藥品領域有著重要的意義。

多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua)作為藥食同源中藥材，具有補氣養(yǎng)陰，健脾，潤肺，益腎等功效[3]；多花黃精與肉類一起烹飪，或制成茶或藥酒，已成為非常流行的食品或飲品?，F(xiàn)代藥理研究顯示,多花黃精在抗氧化、抗衰老、增強免疫力、抗腫瘤、降血糖等方面表現(xiàn)出較好的藥理活性[4]。不同種類的活性成分，如甾體皂苷類、黃酮類、多糖類、凝集素、氨基酸和生物堿類等組成了多花黃精的效應物質(zhì)[5]。多花黃精生品“戟人咽喉”，經(jīng)反復蒸、曬后，色澤由淺入深、甜味由無到有、刺激性氣味逐漸減弱直至消失的同時補脾潤肺益腎的作用增強[6]，其變化的本質(zhì)仍不清楚。當前，多花黃精的研究主要集中在黃精多糖，其他不同極性部位的成分及活性研究很少。本研究在測定多花黃精生品(P.cyrtonema，PC)與多花黃精蒸制品(steam-processedP.cyrtonema，PCS)醇提物的多糖、總黃酮和總多酚含量的基礎上，對多花黃精炮制前后不同極性部位的抗氧化及降血糖活性進行評估，旨在篩選最佳活性部位，為進一步研究和利用多花黃精作為天然抗氧化劑和降血糖食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多花黃精生品及蒸制品于2021年購于安徽省六安市金寨森灃生物有限公司，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學藥學院劉守金教授鑒定為百合科植物多花黃精的干燥根莖和制黃精。DPPH、ABTS、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)和抗壞血酸(維生素C),阿拉丁試劑有限公司(上海，中國)；硝基藍四氮唑(nitrotetrazolium blue chloride,NBT)、濃硫酸、硫酸亞鐵、磷酸鈉、雙氧水,國藥集團化學試劑有限公司；對硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，PNPG)、α-葡萄糖苷酶,上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器和設備

Multiskan spectrum全波長酶標儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；UV-2700紫外可見分光光度計，日本島津公司；XP26分析天平(十萬分之一)，瑞士Mettler-Toledo公司；Simplicity-185超純水儀，美國Millipore公司；GZX-9070電熱恒溫干燥箱，上海博訊公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的制備

醇提物的制備：分別稱取100 g多花黃精生品與蒸制品，用1 L 50%的乙醇浸泡1 h后，加熱回流提取3次，每次2 h，過濾，濾液減壓濃縮至干，冷凍干燥，計算出膏率。

不同極性萃取部位的制備：取醇提物，加入250 mL溫水混懸，冷卻至室溫后，依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶液分別萃取3次，減壓回收溶劑，冷凍干燥后，得到各萃取部位，稱重，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 多花黃精生品與蒸制品醇提物中多糖、總黃酮和總多酚含量測定

1.3.2.1 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法[7]進行葡萄糖標準曲線的建立和樣品的測定。在490 nm處測得標準曲線的回歸方程為y=22.036x+0.003，r= 0.999 5, 樣品吸光度代入標準曲線計算出含量。

1.3.2.2 總黃酮含量測定

采用硝酸鋁比色法[8]進行蘆丁標準曲線的建立和樣品的測定。510 nm 處測得標準曲線的回歸方程為y=12.203x-0.008(r=0.999 5)。多花黃精生品及蒸制品醇提物總黃酮含量以1g干樣品中蘆丁當量表示(mg/g)。

1.3.2.3 總多酚含量測定

采用福林-酚法[9]對沒食子酸進行標準曲線的建立以及樣品的測定。于760 nm下測定吸光值，測得標準曲線的回歸方程為y=0.717x+0.013 (r=0.999 5)。多花黃精生品及蒸制品醇提物含量以1g干樣品中沒食子酸當量表示(mg/g)。

1.3.3 體外抗氧化活性

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力的測定

參考文獻[10]的方法，并稍作調(diào)整。取1 mL不同質(zhì)量濃度的各極性萃取相溶液及維生素C溶液(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)，加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH-乙醇溶液，搖勻，避光反應30 min，在517 nm下測定吸光度，平行測定3次。以蒸餾水代替樣品為空白對照(A0)，以蒸餾水代替反應液為(A2)，維生素C作陽性對照，清除率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A1樣品吸光度，A2為樣品對照組吸光度，A0為空白對照組吸光度。

1.3.3.2 羥自由基(·OH)清除能力的測定

參考文獻[11]的方法，并稍作調(diào)整。取1 mL不同質(zhì)量濃度的各極性萃取相及維生素C溶液(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL)與1 mL FeSO4(6 mmol/L)，1 mL H2O2(6 mmol/L)混合，37 ℃孵育10 min，再加1 mL水楊酸-乙醇溶液(6 mmol/L)混勻，37 ℃孵育30 min。在510 nm下測定吸光度。以蒸餾水做空白對照，維生素C作陽性對照，按公式(1)計算清除率。

1.3.3.3 ABTS陽離子自由基清除能力的測定

參考文獻[12]的方法，并稍作改進。7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸銨混合避光氧化12 h，ABTS混合液用pH=7.4的PBS稀釋至在734 nm波長下，吸光度為0.8±0.02。取1 mL不同質(zhì)量濃度的各極性萃取相及維生素C溶液(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)與2 mL ABTS混合液混合，室溫放置6 min，在734 nm處測吸光度。以蒸餾水代替樣品為空白對照(A0)，以蒸餾水代替反應液為(A2)，維生素C作陽性對照，按公式(1)計算清除率。

參考文獻[13]的方法，并稍作修改。取1 mL不同質(zhì)量濃度的各極性萃取相及維生素C溶液(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)，與1 mL 557 μmol/L NADH、1 mL 45 μmol/L 吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate，PMS)、1 mL 108 μmol/L NBT混勻于25 ℃下溫浴5 min，在波長560 nm下測定吸光度。以蒸餾水做空白對照，維生素C作陽性對照。按公式(1)計算清除率。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶的抑制活性

以阿卡波糖作為陽性對照，參考文獻[14]的方法并做適當修改。各極性萃取相均用磷酸鹽緩沖液(pH =6.9)稀釋成不同質(zhì)量濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mg/mL)的樣品溶液。于96孔板中加入20 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液和110 μL的磷酸緩沖液(pH=6.8)，20 μL 0.5 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，混勻后置于37 ℃的孵育箱放置15 min，然后加入20 μL 3 mmol/L的PNPG，繼續(xù)在37 ℃條件下孵育30 min，最后加入1.0 mol/L Na2CO3終止液100 μL于405 nm處測定吸光度(A)，平行測定3次。抑制率計算如公式(2)所示：

(2)

式中：Ac，對照組的吸光度，Ab，不含PNPG對照組，As，待測樣品組的吸光度。

1.4 統(tǒng)計學處理方法

實驗數(shù)據(jù)采用Origin 9.0，SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，繪圖及分析。試驗數(shù)據(jù)均為3次重復測定結(jié)果的平均值，計算結(jié)果以平均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃精醇提物的總成分分析

多花黃精生品和蒸制品醇提物的多糖含量，總黃酮含量，總多酚含量存在顯著性差異(P<0.001)。生品在炮制后，多糖含量由(11.390±0.013)%降低至(9.092±0.021)%，總黃酮含量由(0.932±0.001) mg/g上升至(1.082±0.005) mg/g，總酚含量由(1.128±0.002) mg/g 上升至(1.455±0.015) mg/g,結(jié)果表明反復蒸制后多花黃精多糖含量降低，總黃酮和總酚含量增多。

2.2 自由基清除能力

2.2.1 DPPH自由基的清除能力

如圖1-a和圖1-e所示，在質(zhì)量濃度為0～1.0 mg/mL時，多花黃精生品和蒸制品各極性萃取相均具有良好的清除能力，并呈濃度依賴性。多花黃精生品和蒸制品各極性萃取相清除能力順序都為：乙酸乙酯相>水相>醇提物>正丁醇相>石油醚相。乙酸乙酯萃取相清除能力最強，在質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時，生品乙酸乙酯相的清除率達75.56%，蒸制品乙酸乙酯相的清除率達90.71%，IC50=0.284 mg/mL，接近陽性對照維生素C，其IC50=0.128 mg/mL。蒸制品醇提物清除率為60.84%，大于生品醇提物清除率(50.80)%，且蒸制品IC50值為0.727 mg/mL，小于生品醇提物IC50值(0.940 mg/mL)，蒸制品醇提物對DPPH 自由基的清除作用明顯強于生品。說明炮制加工可提高多花黃精醇提物清除DPPH自由基的能力，且生品與蒸制品清除DPPH自由基的活性成分主要集中在乙酸乙酯相中。

2.2.2 ·OH的清除能力

如圖1-b和圖1-f所示，在質(zhì)量濃度為0～1.0 mg/mL時，多花黃精炮制前后不同萃取相均表現(xiàn)出一定的清除·OH的能力，且與濃度呈正相關。生品各相清除能力順序為:乙酸乙酯相>醇提物>水相>石油醚相>正丁醇相，蒸制品各相清除能力順序為:乙酸乙酯相>醇提物>水相>正丁醇相>石油醚相。炮制前后各相抗氧化能力發(fā)生改變，多花黃精生品與蒸制品清除·OH活性成分主要集中在乙酸乙酯相中。蒸制品醇提物IC50值為0.850 mg/mL ,小于生品醇提物IC50值(0.896 mg/mL)，二者相比，蒸制品的清除作用明顯強于生品，說明多花黃精在蒸制后對·OH的清除能力有所增強。

2.2.3 ABTS陽離子自由基的清除能力

如圖1-c和圖1-g所示，多花黃精炮制前后不同極性萃取相均有良好的清除ABTS陽離子自由基的能力，在質(zhì)量濃度為0～1.0 mg/mL時，隨著質(zhì)量濃度的增加，清除能力不斷增強。多花黃精生品與蒸制品各萃取相清除能力順序都為：乙酸乙酯相>水相>醇提物>正丁醇相>石油醚相。蒸制品醇提物IC50值為0.787 mg/mL，小于生品醇提物IC50值(0.931 mg/mL)，二者相比，蒸制品醇提物的清除作用明顯強于生品，這表明多花黃精蒸制后對ABTS陽離子自由基的清除能力有所增強。生品與蒸制品均是乙酸乙酯部位清除能力最強，說明多花黃精生品與蒸制品清除ABTS陽離子自由基的活性成分主要集中在乙酸乙酯相中。

a-生黃精不同極性部位對DPPH自由基清除能力；b-生黃精不同極性部位對·OH清除能力；c-生黃精不同極性部位對ABTS陽離子 自由基清除能力；d-生黃精不同極性部位對清除能力；e-制黃精不同極性部位對DPPH自由基清除能力；f-制黃精不同 極性部位對·OH清除能力；g-制黃精不同極性部位對ABTS陽離子自由基清除能力；h-制黃精不同極性部位對清除能力圖1 多花黃精不同極性萃取相對DPPH自由基、·OH、ABTS陽離子自由基和的清除能力Fig.1 In vitro antioxidant activities of PC and PCS′s different polar extracts evaluated by the DPPH, ·OH, ABTS and

2.3 對α-葡萄糖苷酶抑制活性

如圖2-a和圖2-b所示,多花黃精炮制前后各萃取相均對α-葡萄糖苷酶具有抑制活性。在質(zhì)量濃度為0～4.0 mg/mL時，生品各相對α-葡萄糖苷酶的抑制作用強弱為：乙酸乙酯相>水相>正丁醇相>醇提物>石油醚相，而蒸制品的排序為：乙酸乙酯相>水相>醇提物>正丁醇相>石油醚相。生品與蒸制品的乙酸乙酯相抑制率均高于其他萃取相，在質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時，生品乙酸乙酯相的抑制率達到了59.38%，蒸制品乙酸乙酯相的抑制率達到了87.21%，IC50值為1.369 mg/mL，表明生品與蒸制品乙酸乙酯相中的活性成分對α-葡萄糖苷酶抑制能力最強。蒸制品醇提物抑制率為59.74%，大于生品醇提物抑制率36.34%，且蒸制品IC50值為2.560 mg/mL小于生品醇提物IC50值(4.331 mg/mL)，蒸制品醇提物對α-葡萄糖苷酶抑制作用明顯強于生品, 表明多花黃精蒸制后對α-葡萄糖苷酶的抑制活性有所增強。

a-生黃精不同極性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制率；b-制黃精不同 極性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制率圖2 多花黃精不同極性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.2 Relative α-glucosidase inhibition rates of PC and PCS′s different polar extracts

3 結(jié)論與討論

本實驗在分析多花黃精生品與蒸制品醇提物的物質(zhì)組成基礎上，測定了多花黃精生品與蒸制品醇提物體外抗氧化和降血糖活性。結(jié)果表明,多花黃精炮制后醇提物的多糖含量降低，總黃酮及總多酚含量增加，體外抗氧化活性和對α-葡萄糖苷酶抑制作用增加。綜合4種自由基實驗和α-葡萄糖苷酶抑制動力學實驗分析，多花黃精生品與蒸制品的乙酸乙酯部位活性最強，石油醚部位相對較弱，表明多花黃精不同極性部位的抗氧化能力和降血糖活性存在差異。多酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)可通過促進胰島素的合成與分泌，抑制葡萄糖的攝取、轉(zhuǎn)運等方面調(diào)節(jié)血糖[15-16]。多花黃精炮制過程中黃酮類及多酚類成分會富集，使其含量增加，這可能是炮制后的多花黃精抗氧化活性和抑制α-葡萄糖苷酶活性增強的原因。多酚類和黃酮類物質(zhì)多集中在乙酸乙酯萃取相，提示多花黃精抗氧化及降血糖的活性物質(zhì)可能與此兩類成分相關。另外，炮制后的多花黃精多糖含量降低，可能是由于多花黃精在炮制過程中發(fā)生了美拉德反應，使得多糖被水解成了易于煎出的低聚糖，從而有利于藥效的發(fā)揮。但是多花黃精中主要發(fā)揮活性作用的物質(zhì)仍不明確，需要進一步深入研究。