CircSMARCA5通過miR-4295/PTEN軸調控糖酵解抑制胃癌細胞增殖和侵襲

蔡 娟，陳志強，左學良

1.皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院（弋磯山醫(yī)院）腫瘤內科，重大疾病非編碼RNA轉化研究安徽普通高校重點實驗室，安徽 蕪湖 241001；2.南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院肝膽中心，江蘇 南京 210029；3.皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院（弋磯山醫(yī)院）胃腸外科，安徽 蕪湖 241001

胃癌是全世界發(fā)病率第五位、死亡率第四位的惡性腫瘤，每年新發(fā)病例數近109萬，死亡病例數約77萬［1］。復發(fā)和轉移是胃癌患者的首要死亡原因，然而目前對此仍缺乏有效的治療手段。因此，探索胃癌復發(fā)轉移機制、尋找有效治療靶點對改善患者預后具有重要意義。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）廣泛存在于真核生物中，具有高度穩(wěn)定性、組織特異性和進化保守性等特征，能在多層面調控機體的生理和病理過程［2］，且circRNA與多種腫瘤的增殖、侵襲相關。高表達的circ-RanGAP1 通過負調控miR-877-3p，促進胃癌細胞增殖和侵襲［3］。CircTLK1能結合miR-136-5p，促進結腸癌細胞的增殖和侵襲［4］。

在前期研究中，作者發(fā)現circSMARCA5在胃癌組織中呈低表達，與胃癌患者的TNM分期、神經脈管侵犯和淋巴結轉移具有顯著負相關性，過表達circSMARCA5能抑制胃癌細胞增殖和侵襲［5］，但其具體分子機制仍不清楚。本文通過研究circSMARCA5對胃癌細胞糖代謝重編程的影響，探討其潛在的分子機制，以期為胃癌提供新的治療靶點。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)與實驗試劑

人正常胃黏膜上皮細胞系GES-1及人胃癌細胞系MKN45、MKN74、AGS購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、胰蛋白酶、青-鏈霉素和磷酸鹽緩沖生理鹽水（phosphate-buffered saline，PBS）均購自美國Gibco公司，LipofectamineTM3000和TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（realtime fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）試劑盒購自日本TaKaRa公司，慢病毒circSMARCA5過表達載體（LVcircSMARCA5）和慢病毒陰性對照（LV-NC）購自上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司，miR-4295模擬物（miR-4295 mimics）和miR-4295模擬物陰性對照（miR-4295 NC）購自廣州銳博生物技術有限公司，細胞計數試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）試劑購自日本同仁化學研究所，transwell小室購自美國BD公司，Seahorse XF糖酵解壓力測試試劑盒購自美國Agilent Technologies公司，GLUT1、LDHA和Ki-67抗體、葡萄糖攝取試劑盒和乳酸檢測試劑盒均購自英國Abcam公司，PTEN、β-tubulin抗體和辣根過氧化物酶偶聯二抗購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 臨床標本和實驗動物

收集2016年1月—2016年12月于皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院行手術切除的60例胃癌患者的癌組織及癌旁黏膜組織（距腫瘤＞5 cm），其中男性44例，女性16例，年齡36 ～ 78歲。所有患者術前均未接受化療、放療或免疫治療。本研究經皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。BALB/c裸小鼠8只，雄性，5 ～ 6周齡，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場。動物許可證號：SCXK（蘇）2017-0001。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與轉染

利用含10%胎牛血清、青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，將細胞置于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁生長融合度達80%時，加入胰蛋白酶消化并傳代。取對數生長期的AGS細胞，消化后接種于6孔板中培養(yǎng)過夜，加入過表達circSMARCA5慢病毒載體（LVcircSMARCA5）及其對照病毒（LV-NC）轉染細胞，并用嘌呤霉素篩選1周，構建穩(wěn)定轉染細胞株。通過RTFQ-PCR檢測circSMARCA5表達水平。在過表達circSMARCA5的穩(wěn)定轉染細胞株中，利用LipofectamineTM3000轉染miR-4295 mimics或si-PTEN，48 h后檢測miR-4295和PTEN的表達水平。

1.3.2 RTFQ-PCR檢測

利用TRIzol 試劑提取組織和細胞總RNA，應用反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄成cDNA。以cDNA 為模板，按照RTFQ-PCR 試劑盒說明書進行PCR 反應，利用2-ΔΔCt法計算circSMARCA5、GLUT1、LDHA、miR-4295 和PTEN 的相對表達量。CircSMARCA5、miR-4295、GLUT1、LDHA、PTEN、β-actin和U6 的引物序列由廣州銳博生物技術有限公司設計并合成。circSMARCA5 有義鏈為5′-CTCCAAGATGGGCGAAAG-3′，反義鏈為5′-TGTGTTGCTCCATGTCTAATCA-3′ ；miR-4295 有義鏈為5′-GGAAGATCTAGGATCACA GTTAACTCAGAA-3′，反義鏈為5′-CGGGGTA CCGCACAATCCAAAACAAGAA-3′ ；GLUT1 有義鏈為5′-GGCCAAGAGTGTGCTAAA GA A-3′，反義鏈為5′-ACAGCGTTGATGCCAG ACA G-3′；LDHA 有義鏈為5′-ATGGCAAC TCTAAAG GATCAGC-3′，反義鏈為5′-CCAA CCCCAACAAC TGTAATCT-3′；PTEN有義鏈為5′-GAGGGATAAA ACACCATG-3′，反向引物序列為5′-AGGGGTAG GATGTGAACCAGTA-3′；β-actin 有義鏈為5′-TG ACGTGGACATCC GCAAAG-3′，反向引物序列為5′-CTGGAA GGTGGACAGCGAGG-3′；U6 有義鏈為5′-TGGACTCTGTTCGCTCAGGT-3′，反義鏈為5′-TGCCTCCTTCCGTACCACAT-3′。

1.3.3 CCK-8實驗

將處于對數生長期的細胞按照1×103個/孔的密度接種于96孔板，加入100 μL培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24、48、72及96 h后加入10 μL CCK-8試劑，置于細胞培養(yǎng)箱中避光溫育2 h，檢測450 nm波長處各孔的吸光度。實驗重復3次。

1.3.4 Transwell實驗

胰酶消化LV-NC和LV-circSMARCA5兩組細胞后，用無血清培養(yǎng)基制備2×105個/mL的單細胞懸液，取250 μL細胞懸液加入預鋪基質膠的transwell上室，在下室加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醇固定20 min，1%結晶紫染色10 min，在顯微鏡下觀察并拍照。實驗重復3次。

1.3.5 細胞糖酵解能力檢測

取處于對數生長期的各組細胞，以2×105個細胞/mL的密度接種于Seahorse 96孔板，待細胞融合度達約80%，通過設定程序加入葡萄糖（10 mmol/L）、寡霉素（1 μmol/L）和2-脫氧葡萄糖（50 mmol/L），利用Seahorse XF細胞能量代謝分析儀檢測細胞外酸化速率，并計算糖酵解速率及糖酵解能力值。取2 μL細胞培養(yǎng)上清液，依據葡萄糖和乳酸檢測試劑盒說明書，利用GENios Plus酶標儀檢測各組細胞葡萄糖攝取水平和乳酸生成量。實驗重復3次。

1.3.6 蛋白質印跡法（Western blot）檢測

收集各組細胞，提取總蛋白，用二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒測定蛋白濃度，取50 μg蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將分離的蛋白電轉移至聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂奶粉封閉2 h，采用吐溫-20三羥甲基氨基甲烷緩沖生理鹽水（trisbuffered saline Tween，TBST）洗膜3次，每次10 min，加入稀釋的GLUT1、LDHA、PTEN或β-tubulin一抗，4 ℃溫育過夜。TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶偶聯二抗，室溫溫育2 h，TBST洗膜3次，用ECL化學發(fā)光試劑顯色。

1.3.7 裸小鼠皮下移植瘤實驗

將BACB/c裸小鼠隨機分為LV-NC和LVcircSMARCA5兩組，每組4只。用胰酶消化過表達circSMARCA5的AGS細胞及其對照細胞，加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)基調整細胞密度至1×108/ mL，用1 mL注射器向每只裸小鼠肩胛部皮下注射100 μL細胞懸液。從第6天開始，每3天測量腫瘤長、短徑，待最大體積達約1 000 mm3時，處死小鼠，取出腫瘤測量并稱重，計算腫瘤體積，繪制移植瘤生長曲線。腫瘤體積按照如下公式計算：體積（mm3）=0.5×長徑（mm）×短徑2（mm2）。

1.3.8 免疫組織化學方法檢測

收集各組皮下瘤的組織標本，常規(guī)用4%甲醛溶液固定，經脫水、浸蠟包埋、切片后使用山羊血清溫育30 min封閉，4 ℃溫育一抗過夜。次日用PBS清洗3次，室溫溫育二抗30 min，PBS清洗3次。滴加辣根過氧化物酶溶液，室溫溫育30 min，PBS清洗3次，滴加DAB顯色液，當顯微鏡下可見染色區(qū)域發(fā)黃即可使用蒸餾水沖洗，蘇木精復染 1 min。使用梯度乙醇進行脫水處理，二甲苯浸泡，最后滴加中性樹膠，蓋玻片封片，顯微鏡下觀察并拍照。通過染色強度和陽性細胞比例進行免疫組織化學評分。染色強度評分標準為0分（陰性）、1分（弱陽性）、2分（中等強度）、3分（強陽性）。陽性細胞比例的評分標準為0分（＜10%）、1分（10% ～ 49%）、2分（50% ～ 69%）、3分（＞70%）。將染色強度評分與陽性細胞比例評分相乘計算總分。

1.3.9 雙熒光素酶報告基因實驗

將野生型或突變型circSMARCA5和PTEN 3′-UTR序列連接到雙熒光酶報告載體中，將各野生型或突變型載體分別與miR-NC、miR-4295 mimics共轉染。48 h后用雙熒光素酶報告基因測定系統(tǒng)檢測各組細胞的熒光素酶活性。

1.3.10 RNA免疫沉淀（RNA immunoprecip-itation，RIP）實驗

按照RIP試劑盒操作步驟驗證circSMARCA5與miR-4295的靶向關系。裂解細胞后，收集裂解液進行實驗，利用RTFQ-PCR檢測circSMARCA5的富集程度。

1.3.11 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以x±s表示，正態(tài)分布的兩組計量資料比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，相關性分析采用Pearson相關分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 過表達circSMARCA5能夠抑制胃癌細胞的增殖和侵襲

RTFQ-PCR結果顯示，circSMARCA5在胃癌細胞系中表達較正常胃黏膜上皮細胞明顯降低（圖1A）。LV-circSMARCA5組AGS細胞中circSMARCA5的表達水平較LV-NC組明顯升高，表明過表達circSMARCA5的穩(wěn)定轉染細胞株構建成功（圖1B）。CCK-8實驗和transwell實驗結果表明，LV-circSMARCA5組細胞的增殖和侵襲能力較LV-NC組降低（均P＜0.05，圖1C和D）。以上結果表明，過表達circSMARCA5能夠抑制胃癌細胞的增殖和侵襲。

圖1 過表達circSMARCA5能夠抑制胃癌細胞的增殖和侵襲Fig.1 CircSMARCA5 overexpression suppresses the proliferation and invasion of gastric cancer cells

2.2 過表達circSMARCA5能夠抑制胃癌細胞糖酵解

代謝異常是腫瘤細胞的基本特征之一，circRNA已被證實能夠調控腫瘤細胞糖代謝重編程［6］。為了探索circSMARCA5是否參與調控胃癌細胞糖酵解過程，本研究采用RTFQ-PCR檢測葡萄糖轉運蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）和乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase，LDHA）的表達情況，發(fā)現過表達circSMARCA5后GLUT1和LDHA的基因表達下降（圖2A）。Western blot檢測結果進一步證實過表達circSMARCA5可降低GLUT1和LDHA的蛋白水平（圖2B）。相較于LV-NC組，LVcircSMARCA5組細胞的葡萄糖攝取水平和乳酸生成量顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（圖2C）。Seahorse XF細胞能量代謝分析結果顯示，與對照組相比，LV-circSMARCA5組細胞外酸化速率降低，表明過表達circSMARCA5可抑制細胞糖酵解活性（圖2D）。LV-circSMARCA5組的細胞糖酵解速率及糖酵解能力值低于LV-NC組（均P＜0.05，圖2E）。以上結果表明，過表達circSMARCA5能夠抑制胃癌細胞糖酵解。

圖2 過表達circSMARCA5能夠抑制胃癌細胞糖酵解Fig.2 CircSMARCA5 overexpression inhibits glycolysis of the gastric cancer cells

2.3 過表達circSMARCA5能夠抑制裸小鼠皮下移植瘤生長

裸小鼠皮下移植瘤實驗結果表明，LVcircSMARCA5組的裸小鼠皮下移植瘤體積和重量顯著低于LV-NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，圖3A ～ C）。免疫組織化學檢測結果顯示，LV-circSMARCA5組皮下瘤組織的GLUT1、LDHA和Ki-67表達顯著低于LV-NC組（均P＜0.05，圖3D）。以上結果表明，過表達circSMARCA5能夠抑制裸小鼠皮下移植瘤生長。

圖3 過表達circSMARCA5能夠抑制裸小鼠皮下移植瘤生長Fig.3 CircSMARCA5 overexpression suppresses xenograft tumor growth in vivo

2.4 CircSMARCA5靶向調控miR-4295表達

ENCORI 數據庫預測結果提示，circSMARCA5與miR-4295存在互補結合的核苷酸序列（圖4 A）。據此，我們設計了circSMARCA5與miR-4295結合位點的突變序列，并進行雙熒光素酶報告基因實驗。結果顯示，miR-4295 mimics+circSMARCA5-WT共轉染組的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.001），而miR-4295 NC+circSMARCA5-MUT組和miR-4295 mimics+circSMARCA5-MUT組的熒光素酶活性無明顯改變（P＞0.05，圖4B）。收集60例胃癌患者癌及癌旁正常胃黏膜組織，患者的臨床病理學資料見表1。RTFQ-PCR結果顯示，胃癌組織中miR-4295的表達水平較正常胃黏膜組織升高（圖4C）。Pearson相關性分析表明胃癌組織中circSMARCA5與miR-4295的表達水平呈負相關（r=-0.571，P＜0.01，圖4D）。RIP實驗結果顯示，與對照組相比，AGO2富集程度在LV-circSMARCA5組中更高（圖4E）。RIP和熒光原位雜交（flurescenceinsituhybridization，FISH）實驗結果進一步證實了circSMARCA5與miR-4295可直接結合（圖4F和G）。RTFQ-PCR結果顯示，與LV-NC組相比，LV-circSMARCA5組細胞中的miR-4295表達水平出現顯著下降（P＜0.01，圖4H）。以上結果表明，在胃癌細胞中circSMARCA5可與miR-4295結合，并靶向調控miR-4295表達。

表1 60例胃癌患者的臨床病理學資料Tab.1 The clinicopathological features of 60 gastric cancer patients

圖4 CircSMARCA5靶向調控miR-4295表達Fig.4 CircSMARCA5 directly targets miR-4295

2.5 上調miR-4295表達可部分逆轉過表達circSMARCA5對胃癌細胞增殖和侵襲的影響

在circSMARCA5過表達組的AGS細胞中上調miR-4295表達水平，進行回復實驗。結果顯示，過表達circSMARCA5對胃癌細胞增殖、侵襲和糖酵解活性的抑制作用可被miR-4295 mimics部分挽救（圖5）。

圖5 CircSMARCA5通過靶向調控miR-4295表達抑制胃癌細胞增殖和侵襲Fig.5 CircSMARCA5 inhibits the proliferation and invasion of gastric cancer cells through targeting miR-4295

2.6 PTEN是miR-4295的下游靶基因

生物信息學預測結果提示miR-4295與PTEN存在互補結合的核苷酸序列，據此設計了miR-4295與PTEN結合位點的突變序列（圖6A-B）。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示：miR-4295 mimics+PTEN-WT共轉染組的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.001），而miR-4295 NC+PTENMUT組和miR-4295 mimics+PTEN-MUT組的熒光素酶活性無明顯改變（P＞0.05，圖6C）。Pearson相關性分析結果表明胃癌組織中miR-4295與PTEN的表達水平成負相關（r=-0.421，P=0.001，圖6D）。RTFQ-PCR結果顯示，miR-4295 mimics組胃癌細胞中PTEN mRNA表達水平顯著低于miR-4295 NC組（P＜0.001，圖6E）。以上結果表明在胃癌細胞中miR-4295可與PTEN直接結合并下調PTEN的表達。

圖6 PTEN是miR-4295的下游靶基因Fig.6 PTEN was a direct target gene of miR-4295

2.7 敲低PTEN 表達可部分逆轉過表達circSMARCA5對胃癌細胞增殖和侵襲的影響

在circSMARCA5過表達組的AGS細胞中敲低PTEN表達水平，進行回復實驗。結果顯示，過表達circSMARCA5對胃癌細胞增殖、侵襲和糖酵解活性的抑制作用可被si-PTEN部分挽救（圖7A ～ D）。本研究機制模式圖見圖7E。

圖7 CircSMARCA5通過調控miR-4295/PTEN軸抑制胃癌細胞增殖和侵襲Fig.7 CircSMARCA5 inhibits the proliferation and invasion of gastric cancer cells through miR-4295/PTEN axis

3 討 論

circRNA已被證實廣泛參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程［7］，并可作為腫瘤診斷、預后的分子標志物以及潛在的治療靶點［8-10］。既往研究［11-12］發(fā)現，circSMARCA5在多種腫瘤中發(fā)揮了抑癌作用。circSMARCA5在肝癌組織中表達明顯降低，上調circSMARCA5表達可抑制肝癌的侵襲轉移［11］。在骨肉瘤中，circSMARCA5通過調控SRSF1表達，抑制腫瘤的侵襲轉移［12］。circSMARCA5在胃癌中表達降低并能抑制胃癌細胞的增殖和侵襲［5］，本文在此基礎上進一步探討circSMARCA5調控胃癌增殖和侵襲的具體分子機制。

在氧含量正常的情況下，利用糖酵解是腫瘤細胞主要的能量來源，這種現象被稱為Warburg效應［13］。Warburg效應為腫瘤細胞的快速增殖提供了足夠的能量和營養(yǎng)，并且與腫瘤的侵襲轉移存在著密切聯系［14-15］。CircRNA可通過調節(jié)Warburg效應，影響腫瘤細胞的增殖和侵襲［6，16］。本研究發(fā)現circSMARCA5能夠顯著降低胃癌細胞的葡萄糖攝取和乳酸生成量，下調葡萄糖轉運蛋白GLUT1和代謝酶LDHA的表達水平，從而抑制細胞糖酵解。

為了進一步研究circSMARCA5影響胃癌增殖和侵襲的分子機制，本研究通過ENCORI數據庫預測miR-4295可與circSMARCA5特異性結合。既往文獻報道m(xù)iR-4295在胃癌、胰腺癌和膀胱癌等多種腫瘤中表達升高，與TNM分期及淋巴結轉移具有明顯的正相關性［17-19］，并可調控腫瘤細胞代謝重編程［20］，進而促進腫瘤進展。本研究結果發(fā)現，miR-4295在胃癌組織中表達較癌旁組織明顯升高，并與circSMARCA5的表達水平呈負相關，FISH和雙熒光素酶報告基因實驗結果進一步證實了circSMARCA5可與miR-4295直接結合。

生物信息學預測miR-4295與PTEN mRNA的3′-UTR存在相互結合位點。PTEN是一個重要的代謝調控因子［21］，能夠負調控PI3K/AKT信號轉導通路，降低腫瘤細胞糖酵解，從而抑制腫瘤進展［22］。在本研究中，我們通過雙熒光素酶報告基因實驗進一步證實miR-4295與PTEN的相互結合，在胃癌組織中兩者的表達呈負相關，并且在胃癌細胞中過表達miR-4295能夠降低PTEN的表達。此外，回復實驗結果表明，在circSMARCA5過表達組細胞中上調miR-4295或者下調PTEN表達可部分地逆轉過表達circSMARCA5對胃癌細胞增殖、侵襲和糖酵解的抑制作用。

綜上所述，circSMARCA5能夠抑制胃癌細胞的增殖和侵襲，其分子機制可能是通過調控miR-4295/PTEN軸抑制胃癌細胞糖代謝重編程。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。