一株羅非魚無乳鏈球菌的分離鑒定及藥敏試驗

李永福，李 敏，葉毅飛，丁文桂，黃炳熾，張險朋

（1.東莞市動物疫病預防控制中心，廣東東莞 523086；2.佛山科學技術學院，廣東佛山 528231）

羅非魚（Oreochromsmossambcus）又稱非洲鯽魚，刺少且肉質鮮嫩，食性廣，生長繁殖快，抗病能力強，已經成為100 多個國家和地區(qū)的養(yǎng)殖品種[1]。關于羅非魚鏈球菌感染的報道最早見于20世紀80 年代[2]，90 年代感染呈上升趨勢。該菌已成為羅非魚的重要致病菌之一。目前，已經有多個國家暴發(fā)羅非魚鏈球菌?。╯treptococcosis），如美國、巴西、哥倫比亞、泰國、印度尼西亞、洪都拉斯、哥斯達黎加、厄瓜多爾和中國等[3-9]。羅非魚作為我國主要的淡水養(yǎng)殖品種之一，年產量大[10]，但羅非魚鏈球菌病的大面積暴發(fā)，給羅非魚的健康養(yǎng)殖帶來了嚴重威脅。有報道[10]稱，羅非魚鏈球菌病主要有兩種病原，即無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）和海豚鏈球菌（S.iniae）。張新艷等[11]、譚晶晶等[12]、祝璟琳等[13]相繼從羅非魚中分離出無乳鏈球菌，盧邁新等[14]通過傳統(tǒng)的生理生化分析、分子生物學鑒定和人工感染回歸試驗等，研究確定無乳鏈球菌是引發(fā)我國南方羅非魚主產區(qū)的主要病原菌。研究[15-16]發(fā)現，無乳鏈球菌可感染多種經濟魚類，傳染性強，病死率高，對羅非魚危害尤為嚴重，魚類感染后表現眼球突出、鰓蓋內側出血、肛門紅腫等典型外觀癥狀。

2021 年7 月21 日，在東莞市某養(yǎng)殖場的瀕死羅非魚上分離到一種病原菌，通過生理生化鑒定、VITEK-2 Compact 全自動細菌鑒定儀和16S rRNA分子鑒定，確定此病原菌為無乳鏈球菌，將其命名為DG210721，并利用藥敏分析試劑板對該株細菌進行了抗菌藥物敏感性分析。本研究對羅非魚養(yǎng)殖業(yè)細菌病的病原鑒定和防控具有一定的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2021 年7 月，東莞市某養(yǎng)殖場的羅非魚出現打轉游動、眼球突出充血等癥狀，伴有死亡。采集病魚的腦、肝臟、脾臟、腎臟等組織樣品進行細菌培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 THB 培養(yǎng)基，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；B 族鏈球菌顯色培養(yǎng)基，購自法國科瑪嘉公司；動物用藥敏分析試劑，購自南京菲恩醫(yī)療科技有限公司；鏈球菌細菌鑒定卡，購自Biomerieux 公司；細菌提取試劑，購自上海之江生物科技有限公司；2×TaqMix 預混液，購自天根生化科技（北京）有限公司；DNA Marker，購自TAKARA 公司；50×TAE 和GelRed 核酸染料，購自Biosharp 公司；瓊脂糖，購自Biofroxx 公司；引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3 儀器設備 生物安全柜（Class ⅡBSC）、超凈工作臺（ABC-4A1），購自新加坡藝思高科技有限公司；全自動細菌鑒定儀（VITEK2Compact），購自法國梅里埃公司；PCR 儀（Mastercycler nexus gradient），購自eppendorf公司；水平電泳系統(tǒng)（Wide Mini Sub-cell&Power Pac Basi），購自Bio-rad 公司；凝膠成像儀（GelDoc-it TS2），購自美國UVP 公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養(yǎng) 用75%的酒精棉球擦拭魚的體表，無菌水沖洗后用接種環(huán)蘸取腦、肝臟、脾臟、腎臟等組織樣品，分別劃線接種于THB 平板，35 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落的生長特性，挑起菌落進行革蘭氏染色，鏡檢；選取形狀、色澤和大小一致的優(yōu)勢單菌落，重復劃線分離培養(yǎng)獲得純種病原菌（菌株編號為DG210721）。魚的解剖、細菌接種均在生物安全柜內完成。

1.2.2 B 群鏈球菌顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定 對DG210721 菌株進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌株的形態(tài)；劃線接種于顯色培養(yǎng)基，35 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后觀察菌落顏色。參照B 群鏈球菌顯色培養(yǎng)基結果判斷病原菌種類：紫色菌落為無乳鏈球菌（S.agalactiae），深藍色的為腸球菌（Enterococcus species），亮粉色、少量生長或抑制的為乳酸桿菌（Lactobacilli）、明串珠菌（Leuconostoc）或乳酸乳球菌（Lactococci），藍色、無色或抑制的為其他菌群。

1.2.3 生理生化試驗 用無菌棉拭子取適量的DG210721 菌培養(yǎng)菌落至0.45% NaCl 溶液，配制成0.50～0.63 麥氏濁度的細菌混懸液，用VITEK-2 Compact 全自動細菌鑒定儀進行鑒定。

1.2.4 PCR 檢測及序列分析 參照鏈球菌DNA提取試劑說明書，對DG210721 菌株進行核酸提取。參考行業(yè)標準SC/T 7235—2020 中16S rRNA 基因DNA 序列設計通用引物27 F 和1 492 R（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。用無菌去離子水稀釋成10 μmol/L后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩０碢CR Master Mix 說明書（版本號KT171207）標示配制反應體系。PCR 反應體系（25.0 μL）：PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，用ddH2O 補足體系。將反應液分裝到0.2 mL PCR 管中，然后分別加入等體積的待檢樣品、空白對照和陰性對照?？瞻讓φ諡榭张囵B(yǎng)皿，陰性對照為DEPC 水。混勻后瞬時離心，進行PCR 擴增反應。引物序列和反應程序見表1。用1×TAE 電泳緩沖液配制1% 的瓊脂糖（含10 000×GelRed 核酸染料）凝膠；將上述5.0 μL PCR 產物加入點樣孔，使用DNA Marker 作對照；100 V 電泳約40 min，當溴酚藍距底部2/3 時停止，于紫外光下觀察電泳條帶的數量和位置。將PCR擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果與GenBank 數據庫中的已知序列進行比對分析。登錄NCBI 下載代表性鏈球菌屬16S rRNA 核酸序列，利用Mega7.0 軟件，構建分離株DG210721 的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，設定運算法則為Neighbor-Joining，Bootstrap 值為1 000，模型為Kimura-2。

表1 羅非魚無乳鏈球菌16s rRNA 檢測所需的引物序列、反應程序

1.2.5 最小抑菌濃度（MIC）測定 微量肉湯稀釋法：挑取菌種DG210721 培養(yǎng)的單個菌落于5 mL生理鹽水中，制成0.5 麥氏單位濃度的菌懸液A；取200 μL 菌懸液A，用無菌生理鹽水稀釋100 倍，制成0.005 麥氏單位濃度的菌懸液B；取200 μL菌懸液B 加入到藥敏分析試劑板，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后讀取結果。結果判斷：藥敏分析試劑板孔底變渾濁為陽性“+”，澄明為陰性“-”。在微孔內完成MIC 測定。本次試驗選用的藥敏分析試劑板共有恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹、磺胺間甲氧嘧啶鈉和磺胺甲噁唑等8 種水產養(yǎng)殖用抗菌藥物，每種抗菌藥物設12 個梯度濃度，每個梯度減半，其中磺胺甲噁唑添加了磺胺增效劑甲氧卞啶。

2 結果

2.1 細菌培養(yǎng)

從發(fā)病羅非魚的腦、肝臟、脾臟、腎臟組織樣品中分離純化獲得1 株優(yōu)勢菌（菌株編號為DG210721）。培養(yǎng)的菌落在THB 平板上生長良好，呈現乳白色、圓形、邊緣光滑且隆起（圖1-A）；革蘭氏染色陽性，單個、成雙或鏈狀排列，長短不一（圖1-B）。該菌落在B 族鏈球菌顯色培養(yǎng)基35 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，菌落呈現紫色（圖1-C），根據B 群鏈球菌顯色培養(yǎng)基結果對照表判斷分離的病原菌為無乳鏈球菌。

2.2 細菌鑒定

將菌株DG210721 進行革蘭氏染色、鏡檢確定為陽性后，使用VITEK-2 Compact 革蘭氏陽性鑒定卡進行鑒定，鑒定結果為無乳鏈球菌（95%的置信度），結果詳見圖2。

2.3 16S rRNA PCR 檢測和序列分析

PCR 擴增菌株DG210721 的16S rRNA 基因，獲得約1 500 bp 的清晰條帶（圖3）。經測序、比對分析PCR 擴增產物發(fā)現，菌株DG210721 與NCBI 數據庫中S.agalactiae（登錄號JQ039371、OK047709、MN686586）的16S rRNA 基因序列同源性分別為100%、100%和99.9%。產物的測序結果詳見表2。從構建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）可知，無乳鏈球菌、海豚鏈球菌、停乳鏈球菌（S.dysgalactiae）各形成獨立分支，分離株DG210721 與無乳鏈球菌處于同一分支，即與無乳鏈球菌聚為一類，表明該分離株為無乳鏈球菌。

表2 菌株DG210721 核酸產物測序結果

2.4 MIC 測定

菌株DG210721 對8 種水產養(yǎng)殖用抗菌藥物的敏感性存在差異，其中鹽酸多西環(huán)素對其抑制效果最好，其次是恩諾沙星（MIC 是0.25 μg/mL）、甲砜霉素（MIC 是1 μg/mL）、氟苯尼考（MIC 是2 μg/mL）、氟甲喹（MIC 是4 μg/mL）、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶（MIC 是4.8/0.25 μg/mL）、磺胺間甲氧嘧啶鈉（MIC 是16 μg/mL）和硫酸新霉素（MIC 是16 μg/mL），詳見表3。相比磺胺間甲氧嘧啶鈉，磺胺甲噁唑與磺胺增效劑甲氧芐啶的合用提高了藥物敏感性。

表3 藥敏分析結果

3 討論

無乳鏈球菌為革蘭氏陽性球菌，又稱B 群鏈球菌（GBS），是一種β-溶血性鏈球菌，可以感染包括人在內的多種宿主，同時也是牛乳腺炎和魚鏈球菌病的主要致病菌[17-19]，大約有1/3 人的腸道、泌尿器官中可分離出無乳鏈球菌。無乳鏈球菌會引發(fā)新生兒、老年人和免疫功能低下者的嚴重感染[20-22]。在過去的20 年里，成人感染無乳鏈球菌的比例有所增加，通常表現為隱匿性菌血癥、皮膚及軟組織感染和尿路感染，而腦膜炎比較少見[23]。研究[23-24]發(fā)現：人源無乳鏈球菌可以感染羅非魚并導致其發(fā)病、死亡；雖然無乳鏈球菌尚未被定義為一種食源性病原體，但在2015年，新加坡曾發(fā)生一起因食用鳙魚等淡水魚生引發(fā)的無乳鏈球菌感染疫情，在停止銷售、食用魚生后，疫情得到迅速緩解。因此，對該菌的研究具有重大的公共衛(wèi)生意義。2013 年可小麗等[25]在對廣東、海南等地25 株羅非魚鏈球菌病原進行鑒定時發(fā)現：源自廣州江高地區(qū)的無乳鏈球菌分離株GRS0574（GenBank 登錄號：JQ039371），與本次試驗分離的DG210721 株同處在一個進化小分支中，且16S rRNA 基因同源性達100%，提示DG210721和JQ039371可能具有相同的細菌特征，本次試驗分離的無乳鏈球菌與廣州江高主養(yǎng)區(qū)大規(guī)模羅非魚鏈球菌病病原菌可能同源。本次試驗還發(fā)現：DG210721 與2021 年越南羅非魚分離株015-RIA1（GenBank 登錄號：OK047709）和2019年四川奶牛分離株SCQL[26]（GenBank 登錄號：MN686586）距離較近。

近年來，羅非魚病害發(fā)生時，個別養(yǎng)殖戶亂用、濫用抗菌藥物或長期使用單一藥物，這不僅會導致病原菌產生耐藥性，難以有效控制疫病，還會影響食品安全。此外，抗菌藥物可隨魚排泄物擴散到環(huán)境中，給水產養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展構成威脅。研究[27]發(fā)現，細菌能通過攜帶可轉移遺傳因子使耐藥性廣泛傳播。因此，使用抗菌藥物不是可持續(xù)的魚類疫病防控、治療方式。有報道[13]稱，無乳鏈球菌對強力霉素、利福平和阿莫西林等藥物敏感。本次試驗根據《水產養(yǎng)殖用藥明白紙2020 年2 號》，選用了硫酸新霉素等8 種藥物對菌株DG210721 進行藥敏試驗發(fā)現：鹽酸多西環(huán)素在藥物質量濃度為0.06 μg/mL 時，抑菌效果依舊明顯；而磺胺間甲氧嘧啶鈉和硫酸新霉素的抑菌效果最差（MIC 是16 μg/mL）。因此，在選擇藥物之前，分離致病菌并且進行藥物敏感性檢測，會提高疫病防控效果。本次試驗還發(fā)現：磺胺甲噁唑與甲氧芐啶合用的MIC 是4.8/0.25 μg/mL，表明合用可提高藥物敏感性。建議在實際使用磺胺藥時，適量添加磺胺增效劑，這樣可減少藥物的使用量。在羅非魚養(yǎng)殖生產中，選用國家允許使用的藥物，嚴格遵循休藥期，配合使用改善水環(huán)境的微生態(tài)制劑，口服保健預防類的中藥，對“減抗、無抗”養(yǎng)殖、改善池塘水質和預防疾病發(fā)生具有更加積極的作用。

因鏈球菌會感染魚的腦部，相比其他環(huán)境中的許多條件致病菌更具侵襲性。常規(guī)抗菌藥物難以突破腦屏障，且感染后期病魚幾乎不吃料，所以在羅非魚養(yǎng)殖過程中疾病預防尤其重要。羅非魚鏈球菌病多發(fā)于水質差、養(yǎng)殖密度大的水域，長期使用低質飼料也是誘因之一[28-33]。而有些羅非魚養(yǎng)殖戶通過池塘中少量混養(yǎng)草魚（Ctenopharyngodon idella）、鳙魚（Aristichthys nobilis）和凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei），水面種植藥用植物、空心菜等，使水體中氨氮、亞硝酸鹽降低，繼而使魚體發(fā)病率和死亡率也得到了控制[34]。因此，改善池塘養(yǎng)殖環(huán)境尤為重要。在養(yǎng)殖過程中，首先要加強養(yǎng)殖環(huán)境管理，對池塘徹底消毒，清除池底過多淤泥，經常加注新水，增加水體溶解氧，投喂新鮮餌料，做到“定時、定位、定值、定量”四定原則。其次，降低羅非魚的放養(yǎng)密度，在拉網、收捕等操作時避免魚體受傷，減少應激。Raasheed 等[35]發(fā)現，皮膚受損的大底鳉對鏈球菌污染的水體更敏感。再次，做好苗種消毒。已有研究[36]發(fā)現，無乳鏈球菌可以隨著苗種或水體傳播。羅非魚苗種衛(wèi)生質量對于羅非魚鏈球菌病的防控至關重要，對繁殖用的魚卵、親魚，引進的魚苗等進行嚴格消毒和病原監(jiān)測，切斷傳染源，可減少鏈球菌感染的概率。最后，堅持“早晚巡塘”“早發(fā)現早診斷早治療”。發(fā)現羅非魚感染鏈球菌，及時撈出病死魚并進行無害化處理，可減少疾病傳播；隔離發(fā)病魚，消毒養(yǎng)殖水體、用具和周圍壞境，防止將致病菌帶入健康池塘。

目前，市場上暫無商品化的魚類無乳鏈球菌病疫苗，因此對疫苗的開發(fā)已經成為國內外研究的重點。張晗[37]通過注射實驗用無乳鏈球菌滅活疫苗可使羅非魚對無乳鏈球菌的抵抗力顯著提高，說明有望通過疫苗的研究及推廣控制羅非魚無乳鏈球菌病的傳播和暴發(fā)。

近年來，羅非魚鏈球菌病給世界范圍內的羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失，做到切實有效的避免羅非魚鏈球菌病的暴發(fā)和傳播，就要建立完善的監(jiān)測機制，定期采樣送檢，發(fā)現可疑癥狀時使用快速準確的方法進行診斷，例如本研究選用B 族鏈球菌顯色培養(yǎng)基，通過比對菌落顏色，可以更快地排查發(fā)病病原，有助于及時確診并采取治療。此外，應加強鏈球菌對羅非魚的侵染機制研究，促進疫苗的研制和應用，更好地為防治羅非魚鏈球菌病提供依據。因此，加強魚源無乳鏈球菌流行病學監(jiān)測和防控，對羅非魚養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展和獸醫(yī)公共衛(wèi)生具有重要意義。