mRNA 疫苗免疫學機制研究進展

李 超，王淑婷，尼 博，張長穩(wěn)，王玉英

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；2.青島水族館，山東青島 266031）

疫苗技術分為全病毒滅活疫苗、減毒活疫苗、病毒載體嵌合疫苗、基因工程亞單位疫苗、核酸疫苗等多條技術路線。第一代滅活和減毒活疫苗的生產應用已然成熟，第二代基因工程疫苗也先后有產品問世。而信使核糖核酸（mRNA）疫苗屬于第三代疫苗技術，具有制備工藝簡單、易規(guī)模化生產和針對病原體變異有效性高等技術優(yōu)勢。滅活疫苗、亞單位疫苗安全性高，但免疫原性差，誘導細胞免疫的能力有限；弱毒疫苗、載體疫苗免疫原性強，能夠誘導較強的體液免疫與細胞免疫，但安全性較差，存在核酸整合進入宿主基因組的風險，其中弱毒疫苗還存在毒力返強風險；核酸疫苗中，DNA疫苗能夠同時誘導體液免疫與細胞免疫反應，但其保護效率通常較低，且也存在核酸整合進入宿主基因的風險[1]。研究[2]表明，有的mRNA 本身可作為疫苗佐劑，其作用機制是通過刺激免疫系統(tǒng)產生多種細胞因子，從而提高機體免疫力，大大縮減免疫應答時間，增強產生和釋放抗體的能力，具有極大應用價值。

mRNA 疫苗的主要組成部分是人工合成的mRNA 分子，其由5'端帽、5'非轉錄區(qū)、編碼抗原的開放閱讀框、3'UTR 和多腺嘌呤尾5 個部分組成。mRNA 分子可指導細胞合成抗原，激發(fā)免疫反應。由于mRNA 能夠以快速、直接的方式進行反應合成，因此mRNA 疫苗在面對突發(fā)性傳染病流行時，能夠成為理想的候選疫苗類型[3]。本文從mRNA 疫苗的分類、作用機制、技術優(yōu)勢、遞送系統(tǒng)4 個方面，對mRNA 疫苗免疫學機制研究進展進行綜述，旨在為疫苗研發(fā)人員選擇mRNA 疫苗特異高效遞送系統(tǒng)，降低mRNA 疫苗副反應，降低mRNA 疫苗成本，提高mRNA 疫苗穩(wěn)定性等技術方面提供參考。

1 mRNA 疫苗分類

mRNA 疫苗包括非復制型mRNA（nonreplicating mRNA）疫苗與自擴增型mRNA（selfamplifying mRNA，SAM mRNA）疫 苗[2]。兩 種mRNA 疫苗都可以通過cDNA、線性化質粒DNA體外轉錄而成，經呈遞系統(tǒng)轉導進入細胞，表達目的抗原。與非復制型mRNA 疫苗相比，SAM mRNA 疫苗誘導的抗原產量顯著提升，抗原持續(xù)時間、免疫應答時間大大延長。同樣是編碼H1N1 HA 蛋白的mRNA，1.25 μg SAM mRNA 疫苗即可達到與80 μg 非復制型mRNA 疫苗相同的效果。非復制型mRNA 疫苗僅編碼抗原蛋白，具有結構簡單的優(yōu)點，但需要成熟的優(yōu)化工藝才能以較低的劑量誘發(fā)有效的免疫應答。SAM mRNA 疫苗利用了病毒的非結構蛋白基因，用外源靶蛋白基因（抗原基因）替換病毒的結構基因，因而可以在轉染細胞內擴增，使其編碼的抗原基因大量表達，且因結構蛋白基因缺失，使病毒不具有原有的感染性和毒性，具有較好的安全性。

2 mRNA 疫苗技術優(yōu)勢

mRNA 疫苗具有諸多優(yōu)勢：抗原表達效率高，因無需進入細胞核即可完成翻譯，其翻譯效率是DNA 疫苗的數(shù)倍；安全性高，生產過程中不使用病原及抗生素，且不存在整合進入宿主基因組的風險，因而提高了生物安全性；免疫原性強，能夠同時激活體液免疫與細胞免疫，滿足抵御各類病原體的需要；可編譯性強，能夠以設想方式編碼目的抗原，從而實現(xiàn)高效表達。當機體接種mRNA 疫苗后，其將進入細胞內并能夠在細胞質中進行翻譯，從而成功激活體內的免疫應答。mRNA 疫苗不進入細胞核即可進行反應，而DNA 疫苗只有到達細胞核才能發(fā)揮效果，因此mRNA 疫苗不存在整合機體基因組的風險，不會導致基因整合突變，即不存在轉基因生物安全風險，理論上比DNA 核酸疫苗安全性更高。同時，mRNA 疫苗生產不需要用細菌或細胞作為培養(yǎng)基，因此病原微生物污染風險較低[4]。mRNA 分子還具有免疫佐劑效用，可以有效激活機體的免疫應答，作為佐劑時以被Toll樣受體識別方式來刺激機體免疫細胞分泌產生腫瘤壞死因子（TNF-α）和干擾素（IFN-γ）等細胞因子，從而調節(jié)機體免疫應答[4]。mRNA 疫苗的制備生產采用全合成制備技術，不同品種mRNA 疫苗使用的生產工藝和儀器設備均是相同的，因此研發(fā)周期較短，成本較低，易于標準化和規(guī)?；a[5]。此外，在mRNA 疫苗的研發(fā)制備生產過程中，即使發(fā)現(xiàn)或尋找到新的病原體抗原蛋白，也不需要調整規(guī)?；a過程，不需要更改生產設施、設備及其他工藝條件，僅需調整mRNA 表達序列，因此mRNA 疫苗的生產具有較高的靈活性和效率[5-8]。

mRNA 疫苗區(qū)別于其他疫苗的另一個技術優(yōu)勢是其可引發(fā)機體主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類免疫通路和MHC Ⅱ類免疫通路的呈現(xiàn)，可引發(fā)機體細胞毒性T 淋巴細胞反應。mRNA 分子能夠在機體細胞質中瞬時表達抗原蛋白，這些被瞬時表達的抗原蛋白大量積聚，被加工成抗原多肽，裝載至MHC Ⅰ類免疫通路中。mRNA 分子也可在MHC Ⅱ類免疫通路中作為抗原蛋白來源，在mRNA 分子瞬時表達抗原蛋白分泌和循環(huán)后，直接從細胞質穿梭至溶酶體。此外，機體細胞漿中少量的mRNA 分子即可將大量的抗原蛋白遞呈至細胞毒性T淋巴細胞[9-11]。

3 mRNA 疫苗遞送系統(tǒng)

mRNA 在機體外的高效合成技術以及在機體內的高效遞送技術是現(xiàn)階段開發(fā)和應用mRNA 疫苗的兩大核心技術[12-15]。在體內環(huán)境中，mRNA半衰期短、穩(wěn)定性差，直接進入機體容易被體內廣泛存在的RNA 酶降解。而合適的載體材料可確保mRNA 疫苗具有極高的穩(wěn)定性和可控的安全性，可將mRNA 高效遞送到機體細胞內。mRNA 疫苗只有進入到細胞質中，才能發(fā)揮抗原效應，這是其發(fā)揮疫苗關鍵效力的重要基礎[15]。研究[16]表明，只有小于1 000 Da 的分子才可進行被動轉運，轉運一般是在細胞膜上進行。mRNA 相對分子質量較大時，攜帶負電荷，且由磷脂雙分子層結構組成的細胞膜同樣攜帶負電荷，因此mRNA 分子可被包裹形成納米微粒，在載體幫助下進入細胞內。

抗原呈遞細胞將mRNA 分子轉運至機體內的靶細胞時需要避免酶的干擾，避免其發(fā)生降解。mRNA 疫苗成功表達的關鍵是避免mRNA 酶的降解，從而保證其完整性。采用納米載體包裹的mRNA 疫苗可通過靜脈注射方式的原因是其能夠很好抵御酶的降解[17-20]。對于mRNA 疫苗來說，遞送系統(tǒng)的選擇至關重要。遞送系統(tǒng)分為非靶向遞送系統(tǒng)和靶向遞送系統(tǒng)。非靶向遞送是指運輸進入機體的mRNA 非特異性地進入各類細胞或組織，通常使用脂質納米顆粒來完成；靶向遞送則是指通過結合抗體或核酸適配體等方式，將mRNA 靶向遞送到特定的細胞或組織。

靶向遞送系統(tǒng)主要有抗原抗體特異性結合和核酸適配體及其受體特異性結合兩種模式，其原理是在運載mRNA 的納米顆粒中加入靶向特定細胞表面分子的抗體或者核酸適配體，通過抗原-抗體作用或核酸適配體-受體的高親和力結合，來實現(xiàn)mRNA 向目的細胞的特異性運輸[21]。非靶向遞送系統(tǒng)包括脂質納米顆粒（LNP）、多聚體納米顆粒和蛋白衍生物-mRNA 復合體。LNP 通常由4個部分組成，分別是陽離子脂質、脂質連接的聚乙二醇（PEG）、膽固醇和天然磷脂。陽離子脂質能夠與mRNA 一起組裝成病毒大小的顆粒，并協(xié)助mRNA 在細胞質中的釋放；PEG 可延長制劑的半衰期；膽固醇主要起穩(wěn)定劑的作用；而天然磷脂則構建起脂質單層結構，將陽離子脂質-mRNA 包裹于其中。

脂質載體對mRNA 分子的包封率高，對機體細胞的靶向性強、親和性好，生物相容性高。同時，有一部分脂質載體可以將mRNA 疫苗，以非侵入性方式在機體內進行靶向遞送?；谥|載體的遞送系統(tǒng)能夠包裹mRNA 分子，憑借其包封率高的特點，保護mRNA 分子免受mRNA 酶降解的干擾[5]。目前，能夠進行mRNA 疫苗遞送的另外一種非病毒載體材料主要有多聚物、陽離子脂質、細胞穿透肽、樹形分子及其衍生物、陽離子脂質聚合納米顆粒、多聚腺苷酸結合蛋白等。但mRNA 疫苗遞送系統(tǒng)的自身穩(wěn)定性差，對機體細胞有毒副作用，載體對mRNA 包封率低等一系列問題還有待進一步解決[3]。

4 mRNA 疫苗免疫學機制

mRNA 疫苗基于“中心法則”，將含有編碼特定抗原的mRNA 序列進行優(yōu)化、化學修飾以及基因純化加工，通過接種進入機體，在機體細胞中翻譯產生編碼蛋白，從而誘導免疫反應，補充接種機體的蛋白含量，產生機體的免疫反應，從而預防傳染病[22]。mRNA 疫苗可經MHC Ⅰ類以及MHCⅡ類2 種抗原提呈途徑，引發(fā)體液免疫與細胞免疫反應[23]。mRNA 疫苗經注射進入機體后，可被抗原遞呈細胞捕獲，先啟動機體先天免疫應答，后啟動機體適應性免疫應答，從而全面激活體液免疫與細胞免疫。mRNA 疫苗可在抗原遞呈細胞中表達抗原蛋白，當抗原蛋白經溶酶體處理為抗原肽后，這些肽段又被MHC 遞呈給CD4+、CD8+T 細胞或者通過釋放被B 細胞識別，從而激活細胞免疫與體液免疫。mRNA 疫苗在機體細胞內翻譯產生的蛋白質可模擬病毒感染，從而引起機體的體液免疫和細胞免疫[24]。

不同的RNA 序列可編碼不同的蛋白質，因而確定主要抗原蛋白是研發(fā)mRNA 疫苗的核心環(huán)節(jié)[24]。向mRNA 分子中添加修飾過的核苷酸，可提高翻譯效率和自身穩(wěn)定性，延長半衰期[25]。mRNA 疫苗的接種途徑可分為肌肉注射、皮下注射、靜脈注射、鼻內噴霧等不同方式[24]。mRNA疫苗進入機體后，編碼的蛋白質將被翻譯并呈遞給免疫系統(tǒng)。該過程類似于RNA 病毒感染的自然過程及其連續(xù)誘導的保護性免疫應答。外源 mRNA進入細胞質后會發(fā)生與內源性mRNA相似的反應。mRNA 在細胞質中被翻譯成蛋白質，蛋白質經過翻譯后修飾，通過靶向序列或跨膜結構域進入亞細胞間隔，比如分泌途徑、細胞膜、細胞核、線粒體或過氧化物酶體。體外轉錄后再加帽、加尾是mRNA 疫苗公認的生產方法[26-28]。它類似于真核細胞胞漿中自然加工和成熟的mRNA。當被接種疫苗部位的細胞吸收后，mRNA 被運輸?shù)郊毎|；接著，通過核糖體合成 mRNA 編碼的蛋白質，然后進行翻譯后修飾，產生正確折疊的功能蛋白質。mRNA 疫苗可以使其編碼的蛋白或肽瞬時表達，并持續(xù)幾天或幾周，使得 mRNA 更容易被控制。不同的接種途徑對于mRNA 接觸的細胞類型和激發(fā)免疫應答的能力起著重要作用，相對于皮下注射，未經修飾的裸mRNA 疫苗經淋巴結注射，其誘導T 細胞免疫的效力可以大幅度增高[29-30]。

5 討論

mRNA 疫苗集眾多優(yōu)點于一身，如安全性高、免疫原性強、可編譯性強、設計速度快、產量大、成本低、易于儲存等，在新冠疫情防控中被視作一種革命性的疫苗技術[31-32]。自新冠疫情暴發(fā)以來，英國緊急批準使用輝瑞和BioNTech 公司聯(lián)合研發(fā)的mRNA 疫苗（BNT162b2），從而成為首個批準緊急使用mRNA 疫苗的國家；美國食品藥品監(jiān)督管理局批準了針對新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的mRNA 疫苗，臨床試驗證明，mRNA 疫苗具有良好的安全性和有效性[33-36]。除疫病防控外，mRNA 疫苗正在被越來越多地用于醫(yī)療領域，如腫瘤、罕見疾病的治療等。

mRNA 是一個包含負電荷的大分子，它無法穿過由陰離子脂質構成的細胞膜，而且在體內，它會被先天免疫系統(tǒng)的細胞吞噬，或者被核酸酶降解，因此需要創(chuàng)新遞送載體[37-42]。在保證安全性的前提下，為將mRNA 疫苗更好地應用于臨床，聚焦于進一步增強mRNA 疫苗穩(wěn)定性，適當降低mRNA疫苗過高的免疫原性，優(yōu)化和完善其遞送系統(tǒng)[43]。隨著mRNA 技術和LNP 遞送技術的不斷完善，這一新型疫苗技術將有助于解決傳統(tǒng)小分子和抗體療法無法解決的問題，為癌癥、罕見疾病、神經系統(tǒng)疾病等疾病提供更有效、更持久的治療技術選擇。相信mRNA疫苗技術將會具有更廣泛的適用空間，成為人類對抗眾多疾病的有力武器。