豬非典型瘟病毒（APPV）研究進(jìn)展

張 恒，左媛媛，戈勝強，張 會，宋桂才，吳曉東

（1.山東信得科技股份有限公司，山東青島 266104；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；3.青島韋立國際集團(tuán)，山東青島 266000；4.山東諸子生物科技有限公司，山東濰坊 262204）

2015 年美國科研人員Hause 等[1]在對1 份豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-qPCR）陽性樣品進(jìn)行宏基因組測序中，拼接出1 個長度為11 276 bp 的基因組序列；該基因組序列可編碼1 個預(yù)測長度為3 635 個氨基酸的多聚蛋白（polyprotein）；該基因組序列同完成部分鑒定的蝙蝠瘟病毒（Rhinolophus affinis pestvirus，RaPV）基因序列的一致性為68%，同已知的瘟病毒屬其他病毒基因序列的一致性為25%～28%；研究認(rèn)為這是一種新的病毒，應(yīng)歸于瘟病毒屬，暫時將其命名為豬非典型瘟病毒（atypical porcine pestivirus，APPV）。隨后，Arruda 等[2]在患有先天性震顫（congenital tremor，CT）的病豬中發(fā)現(xiàn)APPV，且將感染APPV 豬的帶毒血清接種懷孕母豬后，在所產(chǎn)的仔豬中復(fù)制出CT 臨床癥狀。相似的結(jié)果也在其他研究[3-5]中得到驗證，如在荷蘭10 個豬場采集的具有CT 癥狀的99 份疑似樣品中，APPV 檢出率達(dá)到100%，而在采自無臨床癥狀的豬樣品中，APPV 檢出率只有9%（6/66），說明APPV 與CT 密切相關(guān)。

仔豬CT 也被稱為“豬先天性痙攣癥”或“仔豬先天性肌陣攣病”（myoclonia congenita）[6]、“仔豬震顫病”（shaking piglets/ trembles）、“跳跳病”（jumpy pig disease）、“舞蹈病”（dancing pig disease）[7]等，在國內(nèi)形象地將其稱為“仔豬抖抖病”。它最早于1922 年在美國以“舞蹈病”相稱[7]。隨后在法國（1934 年）[8]、澳大利亞（1937年）[9]、加拿大（1957 年）[10]相繼有此病的報道。我國最早可能于1962 年報道此病，稱其為“仔豬先天性肌陣攣病”[6]?，F(xiàn)在歐洲以及北美洲、南美洲等地區(qū)皆有病例報道，說明該病已呈全球流行趨勢[2]。

國內(nèi)有人將APPV 命名為非典型豬瘟病毒。鑒于國內(nèi)存在非典型性豬瘟的持續(xù)流行，為避免誤解，本文將該病毒翻譯為豬非典型瘟病毒，以示區(qū)別。自2015 年APPV 在美國首次被發(fā)現(xiàn)以來，國外相關(guān)的文獻(xiàn)報道越來越多。國內(nèi)也有相關(guān)研究跟進(jìn)，但還沒有關(guān)于APPV 研究進(jìn)展的報道。因此，本文就APPV 的病原學(xué)、流行病學(xué)、檢測技術(shù)研究以及疫苗研發(fā)等進(jìn)行全面介紹，以期為我國APPV防控及研究提供參考。

1 病原學(xué)

APPV 屬于黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus），為單股正鏈RNA 病毒。根據(jù)最新的進(jìn)化趨勢，國際病毒分類委員會于2017 年發(fā)布的分類指南中，將瘟病毒屬劃分為11 個分支（A—K），而APPV 為瘟病毒屬K（PestivirusK）的代表毒株[11]。

APPV 基因組全長11～12 kb（11 475 bp[12]、11 526 bp[13]），包括5'-UTR 和3'-UTR 非編碼區(qū)及1 個多聚蛋白閱讀框。該閱讀框主要編碼1 個長的多聚蛋白前體（大小約3 635 個氨基酸）。該多聚蛋白可被蛋白酶水解成多個結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。與其他瘟病毒屬病毒一樣，該多聚蛋白包含所有的結(jié)構(gòu)蛋白（C、Erns、E1、E2）及非結(jié)構(gòu)蛋白（Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B），其編碼順序為Npro-C-Erns-E1-E2-P7-NS2-3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B[1]。目前還未涉及APPV 的功能基因組學(xué)研究，但利用E2 和Npro蛋白編碼全基因的序列比對，可將APPV 分為4 個基因型（A—D）[12]。有研究[14]還發(fā)現(xiàn)，與同為瘟病毒屬的古典豬瘟病毒（CSFV）相比，APPV 不同毒株之間的遺傳變異性較大（最大遺傳距離差異可達(dá)21%），且有1 株中國分離株在非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A 區(qū)域內(nèi)發(fā)生了93 個核苷酸的缺失。

2 流行病學(xué)

2.1 宿主

家豬和野豬均可攜帶APPV。瘟病毒屬病毒可以在種間傳播，因此不排除豬以外其他動物有感染APPV 的可能性，但在自然傳播中僅限于偶蹄動物之間。根據(jù)目前研究顯示，未從羊樣品中檢出該病毒[15]。

2.2 病毒侵襲性

利用RT-qPCR 方法可從感染仔豬的多種組織樣品中檢出APPV，檢出率從高到低依次為全血95%、腸系膜淋巴結(jié)90%、支氣管淋巴結(jié)90%、胸腺90%、脾臟90%、腦干90%、小腦88%、腎臟85%、心臟85%、脊髓80%、大腦73%、血清63%、糞便34%和鼻拭子29%。血清、鼻拭子、腦脊髓液、腸系膜淋巴結(jié)、支氣管淋巴結(jié)、脾臟和臍帶血中的病毒含量較高，糞便、小腦、脊髓、腎臟、胸腺和心臟中的病毒含量次之，大腦、腦干和全血中的病毒含量最低[2]。另據(jù)報道[4]，各部位中的APPV 含量由高到低依次為腭舌弓腺、頜下淋巴結(jié)、胃、鼻腺、小腦、三叉神經(jīng)、肱二頭肌、肱神經(jīng)叢、結(jié)腸、小腸、坐骨神經(jīng)、胸腺、支氣管肺淋巴結(jié)、腎臟、脊髓腰神經(jīng)、腎臟、肺臟、最長肌、胸部脊髓和腦干。

我國科研人員也進(jìn)行了APPV 侵襲性研究。Yuan 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，APPV 對神經(jīng)系統(tǒng)及外周免疫器官具有偏嗜性；Shen 等[17]發(fā)現(xiàn)，各臟器中的病毒含量以小腦和心臟最高，其他依次為脊髓、肺臟、脾臟、腎臟、頜下淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、肺門淋巴結(jié)、大腦和肝臟。

Schwarz 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，APPV 核酸可在仔豬血清和唾液中持續(xù)存在12 周以上。Ed Groof[3]研究發(fā)現(xiàn)，APPV 陽性仔豬到第5 個月時，病毒血癥滴度才開始下降。以上結(jié)果均很好地解釋了為何APPV 感染農(nóng)場會持續(xù)出現(xiàn)新的病例。

2.3 傳播途徑

對APPV 的自然傳播途徑目前還不清楚。但有研究[4]發(fā)現(xiàn)，APPV 在唾液腺、十二指腸、胰腺和結(jié)腸中的滴度較高，因此推測APPV 也可能通過糞-口途徑傳播；攻毒試驗結(jié)果顯示，APPV 可經(jīng)母豬垂直傳播給仔豬，導(dǎo)致仔豬發(fā)病，且與CSFV和牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）相比，可能更容易垂直傳播。

Gatto 等[18]對美國4 個種豬場進(jìn)行APPV 檢測，發(fā)現(xiàn)APPV 在包皮拭子、包皮液和精液中的檢出率分別是23.81%（5/21）、22.81%（26/114）和12.91%（59/457）。但APPV 是否能通過精液傳播還需進(jìn)一步研究。

另有報道[19]猜測，氣溶膠可能對APPV 傳播發(fā)揮一定作用。

2.4 有關(guān)國家流行病學(xué)調(diào)查

在美國首次報道APPV 后，西班牙[3]、奧地利[5]、意大利[20]、德國[16，21]、瑞典[21]、英國[22]、荷蘭[3]等歐洲國家，加拿大[23]、巴西[24]等美洲國家，以及中國[13-14，17-18，25]、韓國[26]等亞洲國家均報道發(fā)現(xiàn)該病毒。在對歐洲和亞洲的1 460 份血清樣品的普查中，發(fā)現(xiàn)APPV核酸陽性率為8.9%（130份），血清陽性率約為60%[14]。德國的調(diào)查[4，27]顯示，APPV 在健康豬群中的個體流行率約為2.4%，場間流行率約為10%，野豬感染率達(dá)19%。

APPV 被發(fā)現(xiàn)后，國內(nèi)科研人員很快進(jìn)行了相關(guān)調(diào)查。Zhang 等[26]在廣東省2 個豬場中發(fā)現(xiàn)有APPV 流行（發(fā)病率分別為5.8%和6.3%），并對測序毒株（GD1 株和GD2 株）進(jìn)行了比對分析。Zhang 等[12]和Wu 等[13]分別對APPV 廣西株（CH-GX 2016）和江西株（JX-JM01-2018A01）進(jìn)行了全基因組測序分析。Shen 等[17]在2016 年監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，廣東省一豬場（存欄3 000 頭，發(fā)病率為2.67%，死亡率為60%）和貴州省一豬場（存欄800 頭，發(fā)病率約為50%）均發(fā)生“仔豬抖抖病”，經(jīng)RT-PCR 檢測，均檢出APPV 核酸陽性，并將測序毒株命名為APPV-China/GZ01/2016（GZ01）和APPV-China/GD-SD/2016（GD-SD）。Yuan 等[16]對我國南方地區(qū)（主要是廣東?。┻M(jìn)行監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，APPV 的場內(nèi)流行率為0～20%，個體平均流行率約為5.2%。

其他國家的研究人員對其保存的歷史樣品進(jìn)行了追溯性研究，如2016 年荷蘭的De Groof 等[3]（2012 年樣品）、2016 年德國的Postel 等[4]（2007年樣品）和2017 年西班牙的Mu?oz-González等[28]（1997 年樣品）均從實驗室歷史保存樣品中檢測到APPV 陽性。Yuan 等[16]對已公布的APPV序列進(jìn)行起源和遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)APPV 中國分離株極有可能起源于德國。綜上說明，APPV早已在全球廣泛流行。

3 檢測與診斷技術(shù)

CT 至今已出現(xiàn)100 年，可由多種病原導(dǎo)致，除APPV 外還包括CSFV、豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus 2，PCV2）、豬捷申病毒（porcine teschovirus，PTV）、豬腸道病毒（porcineenteroviruses，PEV）、豬薩佩羅病毒（porcine sapelovirus，PSV）。臨床中的混合感染現(xiàn)象也較嚴(yán)重，如Ed Groof 等[3]發(fā)現(xiàn)攻毒試驗中所使用的APPV 陽性血清污染有星狀病毒（astrovirus），Possatti 等[29]發(fā)現(xiàn)PTV 和APPV 混合感染后可能導(dǎo)致仔豬死亡率增高等。因此，APPV 的實驗室檢測至關(guān)重要。

3.1 病原分離與鑒定

Hause 等[1]初次分離APPV 時，曾用MARC-145、Vero、Vero 76、HCT-8、BT、MDBK、ST、PK-15 和MDCK 細(xì)胞系進(jìn)行分離，但在培養(yǎng)過程中均未觀察到細(xì)胞病變，且傳代2 次后RT-qPCR檢測全部為陰性，病毒分離失敗。Ed Groof 等[3]使用PK-15、SK6 和原代豬腎細(xì)胞（primary swine kidney cells），Postel 等[4]使用瘟病毒屬敏感細(xì)胞系（PK-15、SK6和STE）、豬淋巴細(xì)胞38A1D（porcine lymphoma cells）和豬上皮細(xì)胞PEDSV.15（porcine endothelial cells），Yuan 等[16]使用PK-15、SK6、IBRS 和豬睪丸細(xì)胞（swine testis cellline，ST）進(jìn)行病毒分離，結(jié)果均以失敗告終。Arruda 等[2]也曾嘗試分離病毒進(jìn)行攻毒試驗，結(jié)果也未成功。而Schwarz 等[5]使用了未吃母乳的APPV 陽性仔豬血清，可以在SK6 細(xì)胞和PK-15 細(xì)胞中將APPV 傳代到第5 代，只是病毒滴度很低，提示初乳中的抗體可能在病毒分離過程中發(fā)揮了一定的阻礙作用。目前只有德國科學(xué)家Beer 等[15]利用豬腎細(xì)胞（SPEV）成功分離到APPV，Postel 等[20]利用該細(xì)胞系將APPV 傳代至少11 代。由此可見，APPV在細(xì)胞系中的繁殖感染水平較低，這可能與其E2蛋白的特殊結(jié)構(gòu)有關(guān)[3]。

3.2 分子生物學(xué)鑒定

RT-qPCR 和逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）是檢測APPV 的主要方法。目前建立的RT-qPCR/RT-PCR方法主要對NS3[2]、NS5A[17]、NS5B[5]、5'非翻譯區(qū)（5'non-translated region，NTR）[3]等區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。但因為可參考的APPV 基因序列較少，很多引物仍需要進(jìn)行深入論證，如Postel 等[20]發(fā)現(xiàn)，針對瘟病毒屬的NTR 引物（PanPesti140f 和PanPesti241r）可以與APPV和CSFV發(fā)生交叉反應(yīng)。

其他方法也可用于APPV 檢測，如針對NS3和NS4B 的SYBR Green 方法[4]和套式PCR（RTnested PCR）方法。Possatti 等[29]使用針對NS5B基因的套式PCR 和針對NS2/3 區(qū)域的半套式PCR（semi-nested PCR）進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)針對NS2/3 區(qū)域的擴(kuò)增效果好于NS5B基因，其原因可能是因為設(shè)計NS2/3 區(qū)域引物時可供參考的APPV序列更多。

3.3 血清學(xué)鑒定

目前尚無商品化的血清學(xué)診斷試劑盒面世，但相關(guān)研究已迅速啟動。Hause 等[1]和Postel 等[20]分別建立了針對APPV Erns蛋白的間接ELISA方法，其中Postel 等將其建立的ELISA 方法與商品化的CSFV 試劑盒（針對E2 蛋白，IDEXX 和Idvet 廠家）和瘟病毒屬特異ELISA 試劑盒（針對NS3 蛋白，IDEXX 廠家）進(jìn)行了比較，證實目前所用的CSFV 試劑盒和瘟病毒屬特異ELISA 試劑盒不能與APPV 陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)。另外Schwarz等[5]建立了針對APPV NS3 蛋白的阻斷ELISA 方法，并將其用于血清學(xué)臨床監(jiān)測。

4 疫苗研發(fā)和治療

4.1 疫苗研發(fā)

目前尚無APPV 疫苗研發(fā)的報道，但據(jù)了解，國內(nèi)一些研究機(jī)構(gòu)和大型動物疫苗生產(chǎn)企業(yè)已經(jīng)著手此疫苗的研發(fā)（包括弱毒苗和E2 亞單位疫苗，目前尚無產(chǎn)品申報注冊）。動物攻毒效力檢驗是評價動物疫苗好壞的主要標(biāo)準(zhǔn)，但是到目前為止，APPV 的病毒分離和豬攻毒模型試驗仍很難建立。其原因：弱毒疫苗致弱過程需要能夠繁殖APPV 的細(xì)胞系，且病毒滴度相對較高才能應(yīng)用于生產(chǎn)；而攻毒模型建立存在的主要問題是APPV 是否需要與其他病毒（CSFV、偽狂犬病毒等）協(xié)同作用才能引起震顫等癥狀尚未確定。這些給疫苗研發(fā)和生產(chǎn)帶來很大阻力。

4.2 治療

目前針對APPV 感染無特效藥物治療。導(dǎo)致仔豬死亡的主要原因是病毒感染導(dǎo)致的震顫使仔豬不能及時吃上初乳或母乳饑餓而死，因此可采取代養(yǎng)或人工哺乳方式，提高仔豬的自然恢復(fù)能力，而護(hù)理程度直接關(guān)系到感染豬群的死亡率。

5 結(jié)語

綜上所述，APPV 作為新發(fā)現(xiàn)的病原，基礎(chǔ)研究相對較少，目前僅證實其與CT 緊密相關(guān)。雖然對懷孕母豬接種帶毒血清可以導(dǎo)致仔豬發(fā)病，但是因為APPV 不容易被分離，缺少最重要的病毒攻毒試驗結(jié)果，其致病機(jī)理仍需要進(jìn)一步研究證實。而疫苗研究也需要在前期基礎(chǔ)研究深入的基礎(chǔ)上才有可能獲得成功。同時，APPV 和其他多種病原均可引起CT，且臨床中混合感染現(xiàn)象嚴(yán)重，因此其感染需要全面考慮臨床癥狀，才能給予正確的判斷和處置。深入了解APPV 的病原學(xué)、流行病學(xué)，特別是其引發(fā)的感染免疫學(xué)、致病機(jī)理和發(fā)病進(jìn)程，對于APPV 感染的有效診斷、預(yù)防和治療具有重要意義。