四川省兔出血癥病毒2 型流行病學(xué)調(diào)查及遺傳變異分析

李 麗，陳弟詩(shī)，陳 斌，張 毅，鄧 飛，邵 靚，周莉媛，任永軍

（1.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川成都 610041；2.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都 610041）

兔病毒性出血癥（rabbit hemorrhagic disease，RHD）俗稱兔瘟，是兔的一種急性、高度致死性傳染病。RHD 因潛伏期短、發(fā)病急、病程短、傳播快、死亡率高（可達(dá)100%），被我國(guó)列為二類動(dòng)物疫病。該病典型病變特征是呼吸系統(tǒng)出血，實(shí)質(zhì)器官淤血、腫大、出血，肝臟壞死，由嵌杯病毒科（Caliciviridae）兔病毒屬（Lagovirus）兔出血癥病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）感染引起[1]。根據(jù)感染的RHDV 基因型不同（RHDV GI.1～4），RHD 可分為RHD1 型（經(jīng)典型）和RHD2 型兩種[2]。其中，RHD1 型曾在世界很多國(guó)家發(fā)生和流行[1，3]，但隨著免疫接種等防控措施的實(shí)施，RHD1 的流行得到基本控制[4-5]。RHD2 型由RHDV GI.2 基因型毒株（以下稱RHDV2）感染引起，2010 年由法國(guó)首次報(bào)道[6]。2020 年以前，RHD2 主要在歐洲一些國(guó)家發(fā)生，之后出現(xiàn)在非洲國(guó)家以及美洲的美國(guó)和墨西哥，呈現(xiàn)蔓延趨勢(shì)[2]。2020 年4 月我國(guó)四川省金堂縣首次發(fā)生RHD2 疫情，平均死亡率為42.85%，共撲殺銷毀家兔3 500余只，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)較大經(jīng)濟(jì)損失[8]。國(guó)內(nèi)目前沒(méi)有預(yù)防RHD2 的疫苗，也無(wú)有效的治療藥物可用，因而該病嚴(yán)重威脅著養(yǎng)兔業(yè)健康發(fā)展。

為了解四川省RHDV2 的流行情況、分子流行病學(xué)特征和遺傳變異規(guī)律，本研究于2020—2021年對(duì)四川省兔場(chǎng)進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，采用熒光RT-PCR 方法，對(duì)發(fā)病兔場(chǎng)的360 份樣品（117 份病死兔肝臟組織樣品、243 份兔場(chǎng)環(huán)境拭子樣品）和705 個(gè)受監(jiān)測(cè)兔場(chǎng)的7 165 份樣品（3 340 份全血樣品及3 825 份環(huán)境拭子樣品）進(jìn)行了RHDV2核酸檢測(cè)，篩選出12 份來(lái)自不同地區(qū)發(fā)病兔場(chǎng)的病原核酸陽(yáng)性樣品；設(shè)計(jì)合成2 對(duì)RHDV2VP60基因特異性引物，通過(guò)常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)12 份RHDV2 核酸陽(yáng)性樣品進(jìn)行了VP60基因擴(kuò)增測(cè)序和遺傳變異分析，以期為有效控制RHD2 型疫情在四川省的蔓延及其控制對(duì)策制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌種及試劑

2×TaqPCR Master mix、瓊脂粉和TIANgel Midi Purification Kit（DP209）等，購(gòu)自成都安雅生物試劑有限公司；DL 2 000 DNA Marker，購(gòu)自成都大連寶生物科技有限公司；病毒DNA/RNA提取試劑盒（4.0），購(gòu)自西安天隆科技有限公司；RHD2 型熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自四川博策檢測(cè)技術(shù)有限公司；EVO M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液試劑盒，購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.2 樣品來(lái)源

受檢樣品共計(jì)7 525 份。其中：360 份來(lái)自發(fā)病兔場(chǎng)，包括117 份病死兔肝臟組織樣品和243 份發(fā)病兔場(chǎng)環(huán)境拭子樣品，采自12 個(gè)地市18 個(gè)縣區(qū)25 個(gè)發(fā)病兔場(chǎng)（表1）；7 165 份血液及環(huán)境拭子樣品，采自受監(jiān)測(cè)的705 個(gè)規(guī)模兔場(chǎng)，包括2020年在全省所有地市432 個(gè)集中監(jiān)測(cè)規(guī)模兔場(chǎng)采集的全血樣品2 080 份、兔場(chǎng)環(huán)境樣品2 345 份，2021年在全省12 個(gè)地市273 個(gè)集中監(jiān)測(cè)規(guī)模兔場(chǎng)采集的全血樣品1 260 份、兔場(chǎng)環(huán)境樣品1 480 份。

1.3 樣品采集

肝臟組織樣品：對(duì)病死兔解剖，無(wú)菌采集肝臟組織，-20 ℃凍存?zhèn)溆?；環(huán)境棉拭子：采集兔養(yǎng)殖場(chǎng)地面、圈舍、食槽、排泄物等環(huán)境樣品，置于PBS 緩沖液中，-20 ℃凍存?zhèn)溆?。受監(jiān)測(cè)兔場(chǎng)采樣原則：存欄500 只及以上的規(guī)模兔場(chǎng)，每個(gè)兔場(chǎng)至少采集10 份全血樣品和10 份環(huán)境樣品；500 只以下的兔場(chǎng)，采集5 份全血樣品和5 份環(huán)境樣品。以上樣品均由四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心收集保存。

1.4 發(fā)病兔場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查

統(tǒng)計(jì)發(fā)病兔場(chǎng)發(fā)病時(shí)間、地點(diǎn)、家兔品系、存欄量、死亡率等基本信息，分析RHD2 的發(fā)生與季節(jié)、品系等的相關(guān)性，統(tǒng)計(jì)不同生長(zhǎng)階段兔只的死亡率。

1.5 熒光RT-PCR 檢測(cè)

將肝臟組織樣品研磨勻漿，離心取上清，將環(huán)境拭子樣品離心取上清，將全血樣品直接取樣，按常規(guī)方法進(jìn)行總RNA 提取，使用RHD2 型熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 VP60 基因擴(kuò)增及測(cè)序

根據(jù)GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中的RHDV2 基因組序列，通過(guò)DNAstar 和Premier 5.0 軟件分析后，針對(duì)VP60基因片段設(shè)計(jì)2 對(duì)特異性引物（表1）。引物由成都擎科生物有限公司合成，按照合成說(shuō)明書將其稀釋至10 μmol/L，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

表1 RHDV2 VP60 基因RT-PCR 擴(kuò)增引物

將經(jīng)熒光RT-PCR 檢測(cè)篩選出的12 份來(lái)自不同地區(qū)發(fā)病兔場(chǎng)的RHDV2 核酸陽(yáng)性肝組織樣品，提取總RNA，根據(jù)EVO M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）為模板，分別以P1/P2、P3/P4 為引物，進(jìn)行RHDV2VP60兩段基因的PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后取5 μL 產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。純化回收PCR 產(chǎn)物，由成都擎科生物有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，用DNAstar 軟件拼接后進(jìn)行測(cè)序結(jié)果的Blast 分析。

1.7 VP60 基因序列分析

使用DNAstar 等軟件分析擴(kuò)增測(cè)序的RHDV2VP60基因序列的結(jié)構(gòu)組成特征，收集GenBank 中的國(guó)內(nèi)外14 條不同基因型的RHDVVP60基因序列和10 條RHDV2VP60序列進(jìn)行RHDV2VP60基因的核苷酸及其編碼氨基酸的同源性分析，同時(shí)繪制VP60基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行遺傳變異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病兔場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查

經(jīng)過(guò)對(duì)發(fā)病兔場(chǎng)的流行病學(xué)調(diào)查可知：RHD2流行無(wú)明顯季節(jié)性；伊拉配套系、新西蘭兔、伊普呂配套系、伊高樂(lè)配套系等多個(gè)品系家兔均有發(fā)??；哺乳仔兔死亡率為25%～60%，部分呈現(xiàn)整窩死亡，幼兔死亡率為18%～45%，懷孕哺乳母兔死亡率為9%～30%。具體情況見(jiàn)表2。

表2 2020—2021 年發(fā)病兔場(chǎng)流行病學(xué)基本情況及樣品采集信息統(tǒng)計(jì)

2.2 熒光PCR 檢測(cè)

2.2.1 發(fā)病兔場(chǎng) 2020—2021 年，累計(jì)檢測(cè)發(fā)病兔場(chǎng)117 份肝臟組織樣品及243 份環(huán)境樣品，檢出肝臟組織陽(yáng)性樣品104 份，陽(yáng)性檢出率為88.89%，檢出兔場(chǎng)環(huán)境陽(yáng)性樣品112 份，陽(yáng)性檢出率為46.09%。部分RHDV2 熒光RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2.2 受監(jiān)測(cè)兔場(chǎng) 2020 年共檢測(cè)全血樣品2 080 份，陽(yáng)性檢出率為14.18%，檢測(cè)環(huán)境樣品2 345 份，陽(yáng)性檢出率為10.28%；涉及規(guī)模場(chǎng)432 個(gè)，場(chǎng)點(diǎn)陽(yáng)性檢出率為8.56%，2021 年共檢測(cè)全血樣品1 260 份，陽(yáng)性檢出率為45.48%，檢測(cè)環(huán)境樣品1 480 份，陽(yáng)性檢出率25.81%；涉及規(guī)模場(chǎng)273 個(gè)，場(chǎng)點(diǎn)陽(yáng)性檢出率為39.93%。全血樣品總體陽(yáng)性檢出率為25.99%（868/3 340），環(huán)境樣品總陽(yáng)性檢出率為16.29%（623/3 825）。具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 受監(jiān)測(cè)兔場(chǎng)檢測(cè)結(jié)果

2.3 VP60 基因RT-PCR 檢測(cè)

分別以P1/P2、P3/P4 為引物，對(duì)抽提的12份RHDV2 陽(yáng)性病料中的VP60基因不同片段進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，結(jié)果如圖2-A 和圖2-B 所示。每份RHDV2 都擴(kuò)增出約1 095 bp 和1 117 bp 預(yù)期大小的兩條特異性DNA條帶（即VP60a和VP60b片段），陰性對(duì)照樣品無(wú)擴(kuò)增。

2.4 VP60 基因測(cè)序鑒定

分別對(duì)12 份RHDV2 陽(yáng)性樣品的VP60基因不同片段進(jìn)行純化回收及序列測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果拼接后進(jìn)行Blast 分析。結(jié)果顯示，12 條擴(kuò)增序列與GenBank 中RHDV2 毒株的同源性均在97%以上，表明成功擴(kuò)增出了12 份陽(yáng)性樣品的RHDV2VP60基因序列。通過(guò)DNAstar 軟件進(jìn)行VP60編碼框（ORF）序列整理，分別編號(hào)為SCh202001—SCh202012。

2.5 VP60 基因序列特征

采用DNAstar 生物學(xué)信息軟件MegAlign 程序進(jìn)行12 份陽(yáng)性樣品的RHDV2VP60基因序列特征分析，結(jié)果受檢的12 份陽(yáng)性樣品的RHDV2VP60基因序列長(zhǎng)均為1 740 bp，編碼579 個(gè)氨基酸。12 份陽(yáng)性樣品的RHDV2VP60基因序列在第18、24、99、105、114、132、213、252、321、330、363、378、399、568、612、705、723、741、765、804、828、882、885、930、1 026、1 056、1 089、1 095、1 155、1 156、1 165、1 227、1 231、1 242、1 284、1 317、1 551、1 576、1 608、1 618 和1 622 bp 共41 處核苷酸存在突變，核苷酸序列同源性為98.4%～100%，其中114、1 156、1 165、1 231、1 576、1 618 和1 622 bp 等7 處為錯(cuò)義突變，其他34 處均為同義突 變，且SCh202004 和SCh202005、SCh202007和SCh202009 同源性為100%，表明12 份陽(yáng)性樣品的RHDV2VP60基因遺傳相對(duì)穩(wěn)定。

2.6 VP60 基因同源性分析

通過(guò)DNAstar 軟件與GenBank 中 的10 條RHDV2 毒株VP60 參考序列（表2）進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)22 條VP60基因序列核苷酸同源性為93.7%～100%，其 中Sch202010 與2020 年 新加坡RHDV2 分離株GI.2/SG-NParks 2020/M54-9（MW194928）同源性最低（93.7%）；推導(dǎo)的對(duì)應(yīng)氨基酸序列同源性為95.7%～99.8%，其中SCh202002、SCh202003、SCh202004、SCh202005和SCh202006 與2010 年法國(guó)RHDV2 分離株10-32（HE800532）同源性最低（95.7%），而Sch202010 與2020 年新加坡RHDV2 分離株GI.2/SG-NParks 2020/M54-9（MW194928）推導(dǎo)氨基酸同源性最低（97.2%）。結(jié)果表明，12 份陽(yáng)性樣品的RHDV2VP60基因與國(guó)外早期和最近毒株相比出現(xiàn)了一定程度變異，但仍相對(duì)穩(wěn)定。

2.7 VP60 基因遺傳演化分析

通過(guò)DNAstar 軟件對(duì)12 份陽(yáng)性樣品的RHDV2VP60基因序列與國(guó)內(nèi)外14 條不同基因型的RHDVVP60序列和10 條RHDV2VP60序列進(jìn)行核苷酸比較，繪制系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹（圖3）。經(jīng)典型RHD 毒株（GI.1 毒株）和RHDV2 毒株形成兩個(gè)大分支：參考的經(jīng)典型RHD 毒株又分為2個(gè)分支，國(guó)內(nèi)的經(jīng)典型RHD 株分別處在不同分支；RHDV2 毒株也可分為2 個(gè)分支，12 份陽(yáng)性樣品的RHDV2VP60序列和我國(guó)2020 年RHDV2 SC2020-04 株（MT383749）單獨(dú)成簇，與Sweden 2018 年分離株2381（MH341513）在一個(gè)分支，與新加坡RHDV2 分離株GI.2/SG-NParks 2020/M54-9（MW194928）處于不同分支。結(jié)果表明，RHDV2 毒株VP60基因序列遺傳演化可能會(huì)呈現(xiàn)復(fù)雜化趨勢(shì)，目前仍相對(duì)穩(wěn)定。

3 討論

2010 年法國(guó)報(bào)道出現(xiàn)RHD2 后，意大利、西班牙、德國(guó)、葡萄牙、英國(guó)、挪威等多數(shù)西歐國(guó)家和亞速爾群島，以及北非和南非一些國(guó)家陸續(xù)報(bào)道了該病的發(fā)生[9-11]，2019—2020 年美國(guó)、墨西哥、日本、中國(guó)和菲律賓報(bào)道發(fā)生該亞型疫情[2，12-13]，RHD2 疫情流行速度快，暴發(fā)范圍廣，呈現(xiàn)出替代經(jīng)典型RHD（RHD1）趨勢(shì)。

本研究通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，RHD2 流行無(wú)明顯季節(jié)性，常見(jiàn)的品系家兔均有發(fā)病，其中伊拉配套系發(fā)病死亡率較高，乳兔和幼兔死亡率高于成兔，這與國(guó)外相關(guān)報(bào)道一致[7]。樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，發(fā)病兔場(chǎng)和受監(jiān)測(cè)兔場(chǎng)的環(huán)境樣品陽(yáng)性率在16.29%以上，提示RHDV2 傳播潛力強(qiáng)大，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和做好消毒等的日常預(yù)防具有重要意義。

據(jù)報(bào)道[17]，我國(guó)首次發(fā)生RHD2 疫情的兩個(gè)兔場(chǎng)的RHDV2VP60基因片段核苷酸同源性為99.1%，與RHDV2 參考毒株的同源性為94.1%～98.3%，屬于同一分支上，與經(jīng)典型RHD毒株的同源性為79.0%～80.0%，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。為進(jìn)一步了解其分子流行特點(diǎn)，本研究對(duì)12 份陽(yáng)性樣品的RHDV2VP60基因全序列進(jìn)行了克隆分析。作為RHDV 的主要結(jié)構(gòu)蛋白，VP60 蛋白的氨基酸序列可分為A（1～21）、B（22～300）、C（301～328）、D（329～343）、E（344～434）和F（435～580）6個(gè)區(qū)，通過(guò)折疊成內(nèi)殼（S-shell 區(qū)）和外殼（P2 區(qū)）兩個(gè)主要的緊湊區(qū)域構(gòu)成衣殼，其中N 端的A 和B 區(qū)組成內(nèi)殼區(qū)，C 端的C、D、E、F 區(qū)組成外殼區(qū)，分別位于N 端第3l～250 位和C 端第477～579 位氨基酸之間的主要抗原區(qū)域[14-15]。本研究表明，受試的12 份RHDV2VP60基因核苷酸序列有41 處突變，含34 處同義突變和7 處錯(cuò)義突變，即VP60蛋白的B（22～300）1 處、E（344～434）2 處和F（435～580）3 處錯(cuò)義突變。這一點(diǎn)與金明蘭等[16]研究RHDVYL 毒株VP60基因遺傳演變分析時(shí)得出的VP60 蛋白A、B、D、F 區(qū)變異相對(duì)較低、C、E 區(qū)變異較高的結(jié)論存在一定差異，這需要在更多RHDV2VP60序列的變異分析上進(jìn)一步驗(yàn)證，當(dāng)然這也可能是RHDV2 毒株遺傳變異的特點(diǎn)。雖然目前12 份RHDV2VP60基因的遺傳演變相對(duì)穩(wěn)定，但仍需要警惕較大變異幅度的毒株出現(xiàn)。

通過(guò)DNAstar 軟件對(duì)12 份陽(yáng)性樣品的RHDV2VP60基因序列與國(guó)內(nèi)外14 條不同基因型的RHDVVP60序列和10 條RHDV2VP60序列繪制系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)12 份RHDV2VP60序列和我國(guó)2020 年RHDV2 SC2020-04 株（MT383749）單獨(dú)成簇，與Sweden 2018 年分離株2381（MH341513）參考序列同源性較高；RHDV2 毒株VP60序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，RHDV2VP60基因序列核苷酸同源性為93.7%～100%，其中Sch202010 與國(guó)外毒株GI.2/SG-NParks 2020/M54-9（MW194928）同源性最低（93.7%），但是12 份陽(yáng)性樣品的RHDV2VP60核苷酸序列同源性為98.4%～100%，這都表明12 份陽(yáng)性樣品的RHDV2VP60基因與國(guó)外早期和最近毒株相比出現(xiàn)了一定程度變異，但遺傳相對(duì)穩(wěn)定，同時(shí)也提示目前我國(guó)RHDV2 毒株VP60基因比較保守且可能存在區(qū)域性特點(diǎn)。需要注意的是，本研究克隆分析用的RHDV2 毒株均為同一時(shí)期的毒株，通過(guò)系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)RHDV 毒株流行時(shí)期不同，分支也不同，提示RHDV2 毒株在我國(guó)很可能隨著時(shí)間和地區(qū)的改變出現(xiàn)新的變異現(xiàn)象。

本研究對(duì)四川全省1 年多時(shí)間的RHDV2 流行情況進(jìn)行調(diào)查和統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)RHDV2 基因序列信息進(jìn)行收集比對(duì)，對(duì)12 份RHDV2VP60基因進(jìn)行了克隆測(cè)序和遺傳變異分析，發(fā)現(xiàn)RHDV2 已經(jīng)在四川省多個(gè)地市存在，其VP60基因序列出現(xiàn)了一定程度的變異，但遺傳演化相對(duì)穩(wěn)定，RHDV2 毒株單獨(dú)成簇。本研究補(bǔ)充了國(guó)內(nèi)RHDV2 的分子流行病學(xué)信息，也為RHD2 相關(guān)防控研究和控制對(duì)策制定提供了參考。