提高感冒疏風(fēng)丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

楊深應(yīng),劉常遜,王洪云,陶明寶,曹樸瓊,丁國瑜,楊 麒,趙興蕊*

1.保山市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心,保山 678000;2.保山中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校,保山 678000

感冒疏風(fēng)丸由麻黃絨（炙）、苦杏仁、桂枝、白芍（酒炙）、紫蘇葉等12味藥材制成,具有辛溫解表、宣肺和中的功效,臨床常用于治療風(fēng)寒感冒、發(fā)熱咳嗽、頭痛怕冷、鼻流清涕等癥[1]。處方中君藥為麻黃絨（炙）,其主要有效成分為鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿,具有發(fā)汗、鎮(zhèn)咳、平喘、強(qiáng)心、升高血壓、抗炎、抗病毒等藥理作用,臨床用于感冒、支氣管哮喘、某些低血壓狀態(tài)、皮膚黏膜疾病等的治療[2]。目前感冒疏風(fēng)丸僅有昆明中藥廠有限公司生產(chǎn),有水蜜丸和大蜜丸2種劑型。

感冒疏風(fēng)丸的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第十三冊,其標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下僅有性狀、顯微、芍藥苷的薄層色譜（thin layer chromatography,TLC）鑒別及檢查項(xiàng)目,無含量測定項(xiàng)目[1],目前感冒疏風(fēng)丸已成為以風(fēng)寒表證為主的新型冠狀病毒肺炎早期干預(yù)的中成藥之一[3]。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,由相同藥味組成的不同劑型的感冒疏風(fēng)片對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎球菌等具有抑菌作用,且具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱的作用[4],但有關(guān)感冒疏風(fēng)丸質(zhì)量控制方面的研究報(bào)道較少[5],現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)已不適用于現(xiàn)代中藥質(zhì)量評價(jià)與控制的需求,為確保感冒疏風(fēng)丸的質(zhì)量可控、療效可靠,急需提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)通過對感冒疏風(fēng)丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行系統(tǒng)研究,建立了麻黃絨（炙）、桂枝、紫蘇葉、甘草、獨(dú)活的TLC鑒別方法及同時(shí)測定鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量的HPLC法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（配DAD 檢測器,美國安捷倫公司）;CP225D 型電子天平（德國賽多利斯公司）;DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）;SK2510LHC 型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）;BPG-9140A型鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;Good-Look-2000型薄層色譜成像系統(tǒng)（上?？普苌萍加邢薰荆?硅膠G 薄層板（批號20200323,煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所）。

1.2 試藥

13批感冒疏風(fēng)丸（水蜜丸規(guī)格為6 g/袋,批號分別 為200717、280780、281810、280262、271362、271285;大蜜丸規(guī)格為9 g/丸,批號分別為100070、180138、190024、190089、180136、190116、180187,昆明中藥廠有限公司）。以下對照藥材和對照品均購自中國食品藥品檢定研究院:對照藥材麻黃（草麻黃,批號121051-201606）;麻黃（中麻黃,批號121604-201502）;桂枝（批號121191-201906）;甘草（批號120904-202021）;獨(dú)活（批號120940-201612）;對照品鹽酸麻黃堿（批號171241-201508,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%）;對照品鹽酸偽麻黃堿（批號171237-201510,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%）;對照品桂皮醛（批號110710-201821）;對照品二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯（批號111583-201605）。甲醇、乙腈為色譜純,均購自默克股份兩合公司;其他試劑為分析純;水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 麻黃絨（炙）TLC鑒別

2.1.1 制備供試品溶液 取研碎的水蜜丸6 g,或取剪碎的大蜜丸9 g,加5 g硅藻土研勻[6];加適量氨水使其潤濕,再加40 mL二氯甲烷回流1 h,過濾,蒸干濾液,殘?jiān)? mL甲醇溶解,即得[7]。

2.1.2 制備陰性樣品溶液 取按感冒疏風(fēng)丸處方比例及制法制備的缺麻黃絨（炙）的陰性樣品9 g,按2.1.1項(xiàng)下方法制備溶液。

2.1.3 制備對照藥材溶液 取麻黃（草麻黃）、麻黃（中麻黃）對照藥材各1 g,按照2.1.1項(xiàng)下方法制備溶液。

2.1.4 制備對照品溶液 取鹽酸麻黃堿對照品適量,加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的溶液。

2.1.5 鑒別方法[8]吸取上述4 種溶液各5～10μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上,展開劑為氯仿-甲醇-甲酸（16∶4∶4）,展開約8 cm,噴以體積分?jǐn)?shù)為0.5%的茚三酮乙醇溶液,于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果見圖1。在與麻黃對照藥材、鹽酸麻黃堿對照品色譜對應(yīng)的位置上,13批樣品均出現(xiàn)相同的紫紅色斑點(diǎn),且陰性無干擾。

圖1 麻黃絨（炙）鑒別的TLC圖Fig.1 TLC chromatograms of Ephedrae Herba Velvet（roast）identification

2.2 桂枝TLC鑒別[7-9]

2.2.1 制備供試品溶液 取研碎的水蜜丸18 g,或取剪碎的大蜜丸27 g;加50 mL甲醇超聲40 min,過濾,濾液置于50℃水浴中蒸干,殘?jiān)?0 mL 水溶解,用乙醚振搖提取4次,每次20 mL,合并乙醚液,揮干（水液備用）,殘?jiān)? mL甲醇溶解,即得[9]。

2.2.2 制備陰性樣品溶液 取按感冒疏風(fēng)丸處方比例及制法制備的缺桂枝陰性樣品27 g,按照2.2.1項(xiàng)下方法制備溶液。

2.2.3 制備對照藥材溶液 取桂枝對照藥材1 g,按照2.2.1項(xiàng)下方法制備溶液。

2.2.4 制備對照品溶液 取桂皮醛對照品適量,加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的溶液。

2.2.5 鑒別方法[8]吸取上述4種溶液各10～15μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上,展開劑為石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（17∶3）,展開約8 cm,噴以二硝基苯肼乙醇試液[7]。結(jié)果見圖2。在與桂枝對照藥材、桂皮醛對照品色譜對應(yīng)的位置上,13批樣品均出現(xiàn)相同的橙色至橙紅色斑點(diǎn),且陰性無干擾。

圖2 桂枝鑒別的TLC圖Fig.2 TLC chromatograms of Cinnamomi amulus identification

2.3 紫蘇葉TLC鑒別

2.3.1 制備供試品溶液 取研碎的水蜜丸12 g,或取剪碎的大蜜丸18 g;加20 mL水研勻,移入500 mL圓底燒瓶中,加水230 mL,依照揮發(fā)油測定法實(shí)驗(yàn),加入1.5 mL石油醚（60～90℃）,加熱并保持微沸2 h,取石油醚層作為供試品溶液[7]。

2.3.2 制備陰性樣品溶液 取按感冒疏風(fēng)丸處方比例及制法制備的缺紫蘇葉陰性樣品18 g,按照2.3.1項(xiàng)下方法制備溶液。

2.3.3 制備對照藥材溶液 取紫蘇葉對照藥材1 g,按照2.3.1項(xiàng)下方法制備溶液。

2.3.4 鑒別方法[8]吸取上述3種溶液各10μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上,展開劑為石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（30∶2）,展開約8 cm,噴以體積分?jǐn)?shù)為5%的香草醛鹽酸溶液,于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果見圖3。在與紫蘇葉對照藥材色譜對應(yīng)的位置上,13批樣品均出現(xiàn)相同顏色的斑點(diǎn),且陰性無干擾。

圖3 紫蘇葉鑒別的TLC圖Fig.3 TLC chromatograms of Perillae Folium identification

2.4 獨(dú)活TLC鑒別

2.4.1 制備供試品溶液 取研碎的水蜜丸6 g,或取剪碎的大蜜丸9 g,加5 g硅藻土研勻;加50 mL水超聲30 min,再加入50 mL 石油醚（60～90℃）超聲30 min,分取石油醚液蒸干,殘?jiān)? mL 甲醇溶解,即得[5]。

2.4.2 制備陰性樣品溶液 取按照感冒疏風(fēng)丸處方比例及制法制備的缺獨(dú)活陰性樣品9 g,按照2.4.1項(xiàng)下方法制備溶液。

2.4.3 制備對照藥材溶液 取獨(dú)活對照藥材1 g,按照2.4.1項(xiàng)下方法制備溶液。

2.4.4 制備對照品溶液 取二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對照品適量,加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的溶液。

2.4.5 鑒別方法[8]吸取上述4種溶液各5～10μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,展開劑為石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（20∶10）,展開約8 cm,置于365 nm紫外光下檢視。結(jié)果見圖4。在與獨(dú)活對照藥材、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對照品色譜對應(yīng)的位置上,13批樣品均出現(xiàn)相同的亮藍(lán)色熒光斑點(diǎn),且陰性無干擾。

圖4 獨(dú)活鑒別的TLC圖Fig.4 TLC chromatograms of Angelicae ubescentis Radix identification

2.5 甘草TLC鑒別

2.5.1 制備供試品溶液 取2.1.2項(xiàng)下桂枝的水液[9],用水飽和的正丁醇振搖提取4次,每次20 mL,合并正丁醇液,用水洗滌3次,每次20 mL,蒸干正丁醇液,殘?jiān)? mL甲醇溶解,即得[6]。

2.5.2 制備陰性樣品溶液 取按照感冒疏風(fēng)丸處方比例及制法制備的缺甘草陰性樣品27 g,按照2.5.1項(xiàng)下方法制備溶液。

2.5.3 制備對照藥材溶液 取甘草對照藥材1 g[7],按照2.5.1項(xiàng)下方法制備溶液。

2.5.4 鑒別方法[8]吸取上述3 種溶液各2～5μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上,展開劑為乙酸乙酯-冰醋酸-甲酸-水（30∶2∶2∶4）,展開約8 cm,噴以體積分?jǐn)?shù)為10%的硫酸乙醇溶液,于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰,分別置于日光下和365 nm 紫外光下檢視。結(jié)果見圖5。在與甘草對照藥材色譜對應(yīng)的位置上,13批樣品均出現(xiàn)相同顏色的主斑點(diǎn)或熒光主斑點(diǎn),且陰性無干擾。

圖5 甘草鑒別的TLC圖Fig.5 TLC chromatograms of Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma identification

2.6 含量測定

2.6.1 色譜條件 色譜柱:Agilent Eclipse Plus Phenyl-Hexyl（250 mm×4.6 mm,5μm）;柱溫:30℃;檢測波長:207 nm;流動相:乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液（2∶98）;流速:1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量:10μL。

2.6.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取對照品鹽酸麻黃堿22.03 mg、鹽酸偽麻黃堿21.24 mg,分別置于50 mL 量瓶中,加甲醇溶解、稀釋至刻度,得單一對照品母液。精密量取鹽酸麻黃堿對照品母液1 mL、鹽酸偽麻黃堿對照品母液0.5 mL,置于同一20 mL 量瓶中,加含體積分?jǐn)?shù)1.44%磷酸的體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液稀釋至刻度,得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿質(zhì)量濃度分別為21.99、10.60μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.6.3 供試品溶液的制備 取水蜜丸,研細(xì),取約1.5 g,精密稱定,或取質(zhì)量差異項(xiàng)下的大蜜丸,剪碎,取約2 g,精密稱定。精密加入25 mL 含體積分?jǐn)?shù)1.44%磷酸的體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液,稱質(zhì)量,放置過夜,超聲處理（功率250 W,頻率35 k Hz）60 min使藥物全部溶散,放冷,再稱質(zhì)量,用含體積分?jǐn)?shù)1.44%磷酸的體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,過濾,取續(xù)濾液,即得。

2.6.4 陰性樣品溶液的制備 取按照感冒疏風(fēng)丸處方比例及制法制備缺麻黃絨（炙）的陰性樣品,按照2.6.3項(xiàng)下方法制得缺麻黃絨（炙）的陰性樣品溶液。

2.6.5 專屬性考察 精密吸取上述3 種溶液各10μL,注入液相色譜儀,按照2.6.1項(xiàng)下色譜條件分析,結(jié)果見圖6。理論塔板數(shù)按鹽酸麻黃堿或鹽酸偽麻黃堿峰計(jì)算均不低于5 000,各色譜峰分離良好,陰性對照無干擾。

圖6 含量測定的HPLC圖Fig.6 HPLC chromatograms of content determination

2.6.6 線性關(guān)系考察 取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿質(zhì)量濃度分別為87.94、42.40μg·mL-1的混合對照品溶液1、2、5、8、10、15、20 mL,分別置于20 mL量瓶中,加含體積分?jǐn)?shù)1.44%磷酸的體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液定容,按照2.6.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行回歸,得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的回歸方程分別為y1=2 420.5x1+3.846 2（r=0.999 9）和y2=2 449.5x2+4.025 6（r=0.999 92）,鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿質(zhì)量濃度分別在4.40～87.94、2.12～42.40μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.6.7 精密度實(shí)驗(yàn) 取2.6.2項(xiàng)下混合對照品溶液,按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)測定6次。計(jì)算得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿峰面積的RSD 值分別為0.44%、0.64%,表明儀器的精密度良好。

2.6.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取水蜜丸（批號200717）,按照2.6.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,平行6份,按照2.6.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。計(jì)算得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿含量的平均值分別為0.348 4、0.193 4 mg·g-1,RSD值分別為0.91%、0.98%,表明該方法的重復(fù)性良好。

2.6.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取水蜜丸（批號200717）,按照2.6.3項(xiàng)下方法制得供試品溶液,于0、4、8、12、18、24 h按照2.6.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。計(jì)算得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿峰面積的RSD 值分別為1.27%、1.65%,表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的水蜜丸（批號200717）適量,研細(xì),精密稱取0.75 g,共6份,精密加入鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿質(zhì)量濃度分別為0.052 8、0.029 7 mg·mL-1的混合對照品溶液5 mL和含體積分?jǐn)?shù)1.44%磷酸的體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液20 mL,按照2.6.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.6.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （n=6）Tab.1 Results of recovery tests（n=6）

2.6.11 樣品含量測定 分別取6批水蜜丸及7批大蜜丸,每批3份,按照2.6.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.6.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,計(jì)算鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的含量及總量。結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果 （n=3）Tab.2 Results of sample determination（n=3）

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別方法的考察

感冒疏風(fēng)丸方中藥味較多,成分復(fù)雜,在進(jìn)行桂枝、紫蘇葉TLC鑒別時(shí),參照《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版一部桂枝、紫蘇葉項(xiàng)下TLC鑒別方法,結(jié)果陰性對照干擾較大。因此,在桂枝TLC鑒別實(shí)驗(yàn)中,分別對乙醇、甲醇、乙酸乙酯、乙醚、石油醚（60～90℃）、石油醚（30～60℃）等提取溶劑和振搖、超聲、加熱回流、揮發(fā)油提取等提取方法的前處理?xiàng)l件進(jìn)行摸索,最終選擇甲醇提取,蒸干后水溶解,再用乙醚萃取的提取方法,該方法能夠排除陰性對照的干擾;在紫蘇葉TLC鑒別實(shí)驗(yàn)中,對正己烷-乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水、環(huán)己烷-乙酸乙酯、石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯等不同展開系統(tǒng)及二硝基苯肼乙醇溶液、體積分?jǐn)?shù)10%硫酸乙醇溶液、體積分?jǐn)?shù)1%香草醛硫酸溶液、體積分?jǐn)?shù)5%香草醛鹽酸溶液等顯色劑進(jìn)行摸索,結(jié)果顯示以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（15∶1）為展開劑,以體積分?jǐn)?shù)5%香草醛鹽酸溶液為顯色劑時(shí),才能排除陰性對照的干擾。

3.2 含量測定方法的考察

3.2.1 提取條件的選擇 查閱相關(guān)文獻(xiàn)[7-15],本實(shí)驗(yàn)分別比較了以下提取條件對提取結(jié)果的影響:不同提取溶劑（含體積分?jǐn)?shù)1.44%磷酸水溶液、含體積分?jǐn)?shù)1.44%磷酸的體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液、含體積分?jǐn)?shù)1.44%磷酸的體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液、含體積分?jǐn)?shù)1.44%磷酸的甲醇溶液等）,不同提取方法（超聲、回流、超聲后回流、放置過夜后超聲等）提取。最終確定以含體積分?jǐn)?shù)1.44%磷酸的體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇溶液為提取溶劑,放置過夜后超聲60 min的提取方法。

3.2.2 色譜條件的選擇 在查閱相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[7-18],考察了甲醇-體積分?jǐn)?shù)0.092%磷酸溶液（含體積分?jǐn)?shù)0.04%三乙胺和體積分?jǐn)?shù)0.02%二正丁胺）、乙腈-體積分?jǐn)?shù)0.3%三乙胺的0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液、乙腈-體積分?jǐn)?shù)0.2%磷酸溶液-三乙胺、乙腈-體積分?jǐn)?shù)0.1%磷酸溶液等不同比例的流動相,結(jié)果顯示,以乙腈-體積分?jǐn)?shù)0.1%磷酸溶液（2∶98）為流動相時(shí),待測成分的出峰時(shí)間、峰形及分離度等較好。同時(shí)對以下色譜柱進(jìn)行了考察:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱Diamonsil Plus C18（250 mm×4.6 mm,5μm）、SHISEIDO AQ C18（250 mm×4.6 mm,5μm）、Agilent ZORBAX SB-Aq C18（250 mm×4.6 mm,5μm）;以極性乙醚連接苯基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱Agilent Eclipse Plus Phenyl-Hexyl（250 mm×4.6 mm,5μm）、FeiniGen Ruby Phenyl（250 mm×4.6 mm,5μm）。結(jié)果顯示,使用極性乙醚連接苯基鍵合硅膠柱獲得的峰形較好,故選擇Agilent Eclipse Plus Phenyl-Hexyl（250 mm×4.6 mm,5μm）色譜柱進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.3 含量限度的擬定

麻黃絨（炙）的主要有效成分為鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿,二者為同分異構(gòu)體,在麻黃中所占的比例不呈恒定狀態(tài),參考《中國藥典》2020年版一部麻黃含量測定項(xiàng)目[7]、感冒疏風(fēng)丸的處方及制法[1],結(jié)合本實(shí)驗(yàn)含量測定的結(jié)果,暫擬定含量限度為感冒疏風(fēng)丸含麻黃絨（炙）以鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的總量計(jì),水蜜丸每1 g不得少于0.31 mg;大蜜丸每1 g不得少于0.20 mg。

綜上所述,本研究在感冒疏風(fēng)丸原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上,增加了麻黃絨（炙）、桂枝、紫蘇葉、甘草、獨(dú)活的TLC鑒別方法,用HPLC法測定了鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量,提高了感冒疏風(fēng)丸的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。