地塞米松對脂多糖介導下人牙周膜干細胞骨向分化過程中的調(diào)控作用

何曉光，趙 君，李 娜

(合肥市口腔醫(yī)院 安徽醫(yī)科大學合肥口腔臨床學院 藥劑科，安徽 合肥 230001)

牙周膜干細胞是牙周組織中的成體干細胞，具有多向分化的潛能，其骨向分化能力在牙槽骨的改建過程中起著重要的作用[1]，研究[2]表明炎癥狀態(tài)下人牙周膜干細胞的骨向分化能力減弱，可能是通過NF-κB信號通路影響了其骨向能力的改變，從而解釋了臨床上牙周炎患者牙槽骨流失速度過快的原因。革蘭陰性菌是牙周炎患者最常見的致病菌，其細胞壁的主要成分脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是一種重要的炎癥誘導因子，可以通過激活Toll樣受體4的表達促發(fā)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，形成炎性微環(huán)境[3-4]。

在一些炎癥性疾病、自身免疫性反應和過敏性反應的臨床給藥中，地塞米松(Dexamethasone，Dex)作為糖皮質(zhì)激素的代表之一被廣泛使用[5-6]。研究[7-8]顯示，Dex能夠下調(diào)多條炎癥相關(guān)通路的表達，包括NF-κB通路，從而發(fā)揮其抑制炎癥反應、激活改善炎癥環(huán)境等作用，而在牙周炎中Dex是否可以通過抑制NF-κB信號通路減緩牙周膜干細胞的炎性表達，從而達到促進成骨的目的是本研究擬探究的關(guān)鍵問題。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器 0.1%茜素紅及Dex，美國Sigma公司；牛血清白蛋白、α-MEM培養(yǎng)液、LPS，美國Abcam公司；CO2恒溫孵育箱，美國Thermo公司；超凈工作臺，中國蘇州設備凈化有限公司；體式顯微鏡及倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)，日本OLYMPUS公司；酶聯(lián)免疫檢測儀，美國BIO-TEK公司；Real-time PCR儀，美國Applied Biosystems公司；細胞計數(shù)儀，中國Countstar公司。

1.2 取材 離體牙取材于合肥市口腔醫(yī)院因正畸拔除的患者，年齡14～20歲。取材前征得患者及家屬知情同意，要求患者無全身性疾病，牙周組織健康。

1.3 牙周膜干細胞的分離培養(yǎng)和純化 本課題組借鑒牙周膜干細胞分離培養(yǎng)的方法[2-3]并加以改良，采取消化法(60 min)結(jié)合組織塊貼壁法培養(yǎng)牙周膜細胞，細胞爬出后7～10 d傳代。取對數(shù)生長期的第1代細胞進行純化，將細胞進行低密度接種，出現(xiàn)細胞克隆集落后常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.4 多向分化潛能鑒定 分別對低密度克隆化培養(yǎng)的牙周膜細胞進行成骨、成脂誘導，進行干細胞多向分化潛能的鑒定，培養(yǎng)21 d后分別用茜素紅、油紅O對其進行鈣化結(jié)節(jié)與脂滴的染色。

1.5 實驗分組 將第3代細胞隨機分為4組，正常對照組為正常培養(yǎng)液培養(yǎng)的牙周膜細胞；Dex組為含Dex終濃度為1×10-8mol/L 培養(yǎng)液培養(yǎng)的牙周膜細胞、LPS組為10 μg/mL LPS刺激的牙周膜細胞，Dex+LPS組為同時含有1×10-8mol/L Dex和10μg/mL LPS培養(yǎng)液培養(yǎng)的牙周膜細胞。

1.6 Elisa檢測炎癥因子IL-6表達水平 分別于24 h后收集正常組、Dex組、LPS組及Dex+LPS組的培養(yǎng)液，Elisa試劑盒檢測培養(yǎng)液中IL-6的表達水平，酶標儀450 nm波長讀取光密度值，制作標準曲線，計算出各組IL-6的含量。

1.7 茜素紅染色 將培養(yǎng)21 d的4組細胞棄上清液，PBS清洗2遍控干后4%多聚甲醛固定10 min。棄固定液PBS沖洗，加入1%茜素紅染液染色，20 min后PBS洗凈，倒置相差顯微鏡觀察。

1.8 Real-time PCR檢測各組細胞骨向分化誘導后RUNX-2、OPN、ALP表達 將各組細胞培養(yǎng)7 d后利用Trizol試劑盒mRNA，酶標儀測定mRNA純度及濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。qRT-PCR檢測骨相關(guān)基因RUNX-2、OPN、ALP的相對表達量。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

1.9 Western blot檢測各組細胞核蛋白中p65的表達水平 收集4組細胞，吸取培養(yǎng)液控干培養(yǎng)瓶，用預冷的PBS清洗2遍并控干，利用核蛋白提取試劑盒提取細胞核蛋白，過程中注意冰上操作，電泳轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入p65一抗，4℃環(huán)境下孵育過夜。洗膜后加入二抗(1∶5 000)孵育2 h，TBST洗滌4次，每次8 min，ECL化學發(fā)光試劑曝光顯影。采用Image J軟件分析條帶灰度值，計算各目的蛋白與GAPDH灰度值的比值。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 人牙周膜干細胞培養(yǎng)與鑒定 常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)7 d左右觀察到細胞從組織塊周圍爬出，多成長梭形(圖1A)，取對數(shù)生長期的第1代細胞低密度接種進行純化，鏡下可見克隆集落形成(圖1B)，消化克隆細胞進行常規(guī)傳代培養(yǎng),并對其進行干細胞多向分化潛能的鑒定，成脂、成骨誘導21 d后分別可見形成脂滴(圖1C)和鈣化結(jié)節(jié)(圖1D)。

A.組織塊周圍有細胞爬出；B.低密度接種后克隆集落形成；C.成脂誘導21d后脂滴形成；D.成骨誘導21d后鈣化結(jié)節(jié)形成。

2.2 Elisa檢測各組細胞炎癥因子IL-6表達水平 結(jié)果顯示，LPS組IL-6表達水平高于正常對照組(P<0.05)，提示LPS誘導炎癥反應產(chǎn)生，Dex+LPS組IL-6表達水平較LPS組減輕(P<0.05)，提示Dex起到了抗炎作用，見表2。

表2 各組細胞IL-6表達水平

2.3 茜素紅染色觀察各組細胞鈣化結(jié)節(jié)形成情況 將各組細胞培養(yǎng)21 d后，茜素紅染色觀察鈣化結(jié)節(jié)形成情況，正常對照組(圖2A)、LPS組(圖2C)未見明顯鈣化結(jié)節(jié)產(chǎn)生，Dex組鈣化結(jié)節(jié)明顯可見(圖2B)，Dex+LPS組鈣化結(jié)節(jié)明顯較LPS組多，較Dex組少(圖2D)，提示Dex可改善炎癥狀態(tài)下牙周膜干細胞骨向分化的能力。

2.4 Dex對LPS刺激下牙周膜干細胞骨基因ALP、RUNX-2、OPN mRNA表達的影響 結(jié)果顯示，Dex組與Dex+LPS組骨相關(guān)基因ALP、RUNX-2、OPN mRNA表達量均較正常對照組上調(diào)(P<0.05)；Dex+LPS組骨相關(guān)基因ALP、RUNX-2、OPN mRNA表達水平均較LPS組增加(P<0.05)，見表3。

A.正常對照組；B.Dex組；C.LPS組；D.Dex+LPS組。

表3 各組細胞基因ALP、RUNX-2、OPN mRNA表達情況

2.5 NF-κB信號通路關(guān)鍵分子p65核蛋白表達水平 結(jié)果顯示，LPS組p65核蛋白表達量升高(P<0.05)，提示LPS刺激的炎癥反應激活了NF-κB信號通路，而Dex+LPS組p65核蛋白表達量較LPS組降低(P<0.05)，提示Dex可能抑制了NF-κB信號通路，見圖3。

A.各組p65核蛋白表達；B.p65核蛋白與GAPDH灰度值的比值。*P<0.05 vs. 正常對照組(N)；#P<0.05 vs. LPS組

3 討論

牙周炎是一種炎癥性、破壞性疾病，是由牙菌斑導致的牙周附著結(jié)構(gòu)的破壞，是成人牙齒喪失的首要原因。我國是牙周病的高發(fā)國家，根據(jù)我國第四次全國口腔流行病學調(diào)查研究資料顯示：中年人群的牙周炎患病率隨著年齡的增長而逐漸升高，發(fā)展到老年人群的失牙率和無牙頜率居高不下[9]。牙周炎致病菌細胞膜外的LPS可通過Toll樣受體4介導炎癥反應的發(fā)生，在本研究中，課題組選用LPS刺激人牙周膜干細胞，并檢測了炎癥因子IL-6的表達，模擬了牙周炎的炎性微環(huán)境，并在此基礎之上探討了Dex的抗炎作用以及對人牙周膜干細胞成骨的影響，研究結(jié)果顯示，LPS刺激后加入Dex能明顯降低炎癥因子的表達，并可上調(diào)成骨相關(guān)基因ALP、RUNX-2、OPN mRNA表達水平，提示Dex在一定程度上恢復了炎癥狀態(tài)下牙周膜干細胞的功能，從而達到減緩牙槽骨的喪失改善牙周健康的目的。

Dex是臨床上使用最廣的一種糖皮質(zhì)激素，具有抗病毒、抑制炎癥及免疫應答、抗休克作用。糖皮質(zhì)激素在口腔臨床治療中可以輔助用于口腔黏膜疾病、牙周牙髓聯(lián)合病變、下頜埋伏阻生智齒拔除術(shù)以及牙拔除術(shù)后的抗感染、防止干槽癥等方面，研究表明Dex可以減輕炎癥介導的對血管內(nèi)皮細胞的抑制作用[10]，亦可抑制人肺上皮細胞炎癥反應[11]。本研究中，課題組研究了牙周膜干細胞在不同刺激因素下NF-κB信號通路中關(guān)鍵分子p65核蛋白表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS刺激下人牙周膜干細胞p65核蛋白表達水平明顯增高，提示NF-κB信號通路被激活，而加入Dex后p65核蛋白表達水平降低，NF-κB信號通路被抑制，成骨相關(guān)基因表達上升，提示Dex可能通過抑制炎癥信號通路NF-κB從而促進人牙周膜干細胞的成骨分化，但本研究尚未對p65上游分子進行研究，亦沒有建立牙周炎動物模型驗證Dex的治療效果，這也為后續(xù)的研究提供了思路。