miR-483靶向調控DLC1對三陰性乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

李丕嵩，陳宏甡，程曉宇，朱肖宇 (大連大學附屬中山醫(yī)院乳甲外科，遼寧 大連 116000)

乳腺癌是全球女性中最常見的癌癥類型，其發(fā)病率逐年增加[1]。三陰性乳腺癌是乳腺癌亞型中侵襲性最強的一種，其缺乏α-雌激素、孕酮和HER2(erbB2)受體的表達，特征是有絲分裂率高、淋巴細胞浸潤增加、病理級別高和腫瘤體積大[2]。尋求有效的分子靶點對治療三陰性乳腺癌具有重要意義。microRNA(miRNA)是一類長度為17～24個核苷酸的非編碼RNA分子，可調節(jié)細胞分化、細胞周期進程和細胞凋亡[3]，miRNA已被證明在機體致癌過程中發(fā)揮著重要作用[4]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，IGF2基因座在第7個內含子中有1個miRNA，即miR-483，在肝母細胞瘤中IGF2與miR-483表達呈正相關[5]。有研究表明，miR-483可以作為各種癌癥的潛在生物標志物[6-7]，但miR-483表達升高影響癌癥發(fā)展的機制目前尚不完全清楚。肝癌缺失基因1(deleted in liver cancer 1，DLC1)最初是作為一種潛在的腫瘤抑制因子被發(fā)現(xiàn)，其在肝細胞癌中表達降低，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)其在其他癌癥中也存在表達降低或丟失，如在結直腸癌中miR-483表達的升高可以通過減少DLC1介導癌細胞的生物學行為[8]。目前尚未見miR-483在三陰性乳腺癌細胞中表達及作用機制的研究報道，因此，本研究通過研究miR-483對三陰性乳腺癌細胞的促癌作用并分析其潛在機制，旨在為三陰性乳腺癌的治療靶點提供進一步的支持。

1 材料與方法

1.1 細胞復蘇培養(yǎng)及分組設計

人MDA-MB-231乳腺癌細胞購自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所，在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM；美國Thermo Fisher Scientific Inc;批號：4152032.32)中培養(yǎng)，并補充10%胎牛血清(FBS；美國Thermo Fisher Scientific Inc；批號：BC-41563)、2 μmol/L谷氨酰胺(美國Thermo Fisher Scientific Inc；批號：BX-54896)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素(美國Thermo Fisher Scientific Inc；批號：102363、365479)。所有細胞均于37 ℃、5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

將細胞分為對照組、miR-NC組、miR-483 inhibitor組、miR-483 mimics組。對照組培養(yǎng)方法：將濃度為5×106/mL的MDA-MB-231乳腺癌細胞置于37 ℃、5%CO2、含10%FBS的DMEM中培養(yǎng)。miR-NC組、miR-483 inhibitor組、miR-483 mimics組培養(yǎng)方法：空白載體(miR-NC)、miRNA-483低表達載體(miR-483 inhibitor)、miRNA-483過表達載體(miR-483 mimics)均購自廣州RiboBio，其載體序列分別為：5’-TGGCTAGCTGATCGA-TCGTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGTCGATCGATCG-3’；5’-TCGCGATCGATCGTAGCTAGCTAGCTAGTCGATCGAT-GCTAGCTG-3’；根據(jù)說明書將MDA-MB-231乳腺癌細胞接種在6孔板中至70%融合，并使用Lipofectamine 2000(美國Thermo Fisher Scientific Inc；批號：NB514896)分別轉染miR-NC、miR-483 inhibitor(100 nmol/L)、miR-483 mimics(100 nmol/L)，轉染72 h后，采用逆轉錄定量聚合酶鏈反應(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測miR-483的表達。以上各組細胞每孔設6個平行樣。

1.2 MTT法檢測細胞活力及結晶紫染色檢測細胞單克隆形成數(shù)目

轉染72 h后，將各組MDA-MB-231乳腺癌細胞(1×104)置于37 ℃的96孔板中，再將20 μL MTT溶液(5 mg/mL)添加到每個孔中培養(yǎng)4 h。隨后吸出DMEM，并向每個孔中加入150 μL DMSO。將96孔板置于振蕩器上10 min，然后在MK-3酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific Inc)上使用630 nm參考波長在570 nm處測定吸光度(absorbance,OD)值。細胞存活率=(處理組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)。

將各組MDA-MB-231乳腺癌細胞用0.25%胰蛋白酶消化成單細胞，并以4×105/孔的密度接種到6孔板中，24 h后將50個細胞接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)2周。然后將細胞用結晶紫—福爾馬林溶液染色10 min并計數(shù)。

1.3 流式細胞儀測定細胞凋亡水平

使用AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(廣州Best Bio生物科技有限公司；批號：415263)檢測細胞凋亡水平。將MDA-MB-231乳腺癌細胞(1×106/mL)懸浮在100 μL的PBS中，根據(jù)說明書用AnnexinV-FITC/PI雙染色15 min。使用FACSCalibur流式細胞儀(美國BD Biosciences)評估細胞凋亡情況，并使用ModFitLT 2.0軟件分析結果。

1.4 Transwell小室測定細胞遷移與侵襲水平

使用24孔Transwell小室(孔徑8 mm；美國BD Biosciences;批號：202032.6)測定細胞遷移與侵襲情況。在轉染48 h后收集轉染細胞，懸浮在不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中，并以5×104/孔的初始密度接種在上部小室中。下室裝有500 μL DMEM，其中含有20% FBS作為化學誘導劑。在37 ℃下孵育48 h后，用棉簽小心去除未遷移的細胞。遷移后的細胞用95%甲醇室溫固定15 min，0.1%結晶紫—福爾馬林溶液室溫染色15 min，用IX71倒置顯微鏡(日本Olympus Corporation)捕獲細胞。

1.5 RT-qPCR測定細胞miR-483、DLC1 mRNA表達水平

使用TRIzol試劑(美國Thermo Fisher Scientific Inc；批號：5213.36)從細胞中分離總RNA。對于miR-483表達水平檢測，使用SYBR?Green PCR試劑盒(日本Toyobo Life Science；批號：102302)在Applied Biosystems Realtime 7500序列檢測系統(tǒng)(美國Thermo Fisher Scientific Inc)上進行RT-qPCR。引物序列如下：miR-483正向，5’-TCGCGATCGATCGATCGATCGTAG-CTAGCTAGCTAGCTAGC-3’，反向，5’-TGGGGGATCGA-TGTAGCTAGTCGATCGATCGATGCTAGC-3’；U6正向，5’-TGGCTAGCTAGTGGGCTAGCTAGTCGATCGATCGATCGATCGCC-3’，反向，5’-TGGTCGATCGATGCTAGCTAGC-TAGTCGATCGATCGATCGCTAGCTAGC-3’。對于DLC1 mRNA表達水平檢測，使用PrimeScript RT試劑盒(大連Takara Biotechnology Co Ltd；批號：1203659.3)進行逆轉錄，然后使用SYBR Premix Ex Taq(大連Takara Biotechnology Co Ltd;批號：MC-320156)進行RT-qPCR。引物序列如下：DLC1正向，5’-TCGAGCT-AGTCGATCGATCGTAGCAC-3’，反向，5’-TGTCGAT-CGATCGTCGATCGATCGATC-3’；β-actin正向，5’-TGGCTAGCTAGCTAGCTGGGATCGATCGTAGCA-3’，反向，5’-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3’，將miR-483表達標準化為β-actin表達，使用2-ΔΔCq法分析相對表達水平。

1.6 蛋白印跡法測定細胞DLC1蛋白表達水平

使用含有蛋白酶抑制劑混合物(德國Mannheim；批號：NB-526363)的RIPA裂解液從轉染的細胞中分離總蛋白質。用BCA蛋白測定法(美國Thermo Fisher Scientific Inc；批號：#3458965)測量總蛋白的濃度。在10% SDS-PAGE上分離等量的蛋白，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜(美國Bio-Rad Laboratories Inc；批號：415954)。聚偏二氟乙烯膜的非特異性結合位點用含0.1% Tween 20(TBST)的TBS溶液飽和。隨后，將小鼠抗人單克隆DLC1一抗(1∶1 000；目錄號：sc-276525；美國Santa Cruz Biotechnology Inc)和小鼠抗人單克隆GAPDH抗體(1∶1 000；目錄號：sc-15696；美國Santa Cruz Biotechnology Inc)與聚偏二氟乙烯膜4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次后，將膜與相應辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶10 000；美國Santa Cruz Biotechnology Inc)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，使用增強型化學發(fā)光試劑盒(美國GE Healthcare；批號：5202363)檢測條帶水平，DLC1相對蛋白水平被歸一化為GAPDH。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 MDA-MB-231乳腺癌細胞OD值、存活率比較

與對照組、miR-NC組比較，miR-483 inhibitor組OD值、存活率均降低(P<0.05)，miR-483 mimics組OD值、存活率均升高(P<0.05)；與miR-483 inhibitor組比較，miR-483 mimics組OD值、存活率均升高(P<0.05)，見表1。

表1 MDA-MB-231乳腺癌細胞OD值、存活率比較

2.2 MDA-MB-231乳腺癌細胞單克隆形成數(shù)目、凋亡率比較

與對照組、miR-NC組比較，miR-483 inhibitor組單克隆形成數(shù)目減少、凋亡率升高(P<0.05)，miR-483 mimics組單克隆形成數(shù)目增加、凋亡率降低(P<0.05)；與miR-483 inhibitor組比較，miR-483 mimics組單克隆形成數(shù)目增加、凋亡率降低(P<0.05)，見表2。

表2 MDA-MB-231乳腺癌細胞單克隆形成數(shù)目、凋亡率比較

2.3 MDA-MB-231乳腺癌細胞遷移能力比較

與對照組、miR-NC組比較，miR-483 inhibitor組穿膜數(shù)減少(P<0.05)，miR-483 mimics組穿膜數(shù)增加(P<0.05)；與miR-483 inhibitor組比較，miR-483 mimics組穿膜數(shù)增加(P<0.05)，見表3、圖1。

表3 MDA-MB-231乳腺癌細胞穿膜數(shù)比較

a:對照組；b:miR-NC組；c:miR-483 inhibitor組；d:miR-483 mimics組

2.4 MDA-MB-231乳腺癌細胞miR-483、DLC1 mRNA和蛋白表達水平比較

與對照組、miR-NC組比較，miR-483 inhibitor組細胞miR-483 mRNA表達水平降低、DLC1 mRNA和蛋白表達水平升高(P<0.05)，miR-483 mimics組細胞miR-483 mRNA表達水平升高、DLC1 mRNA和蛋白表達水平降低(P<0.05)；與miR-483 inhibitor組比較，miR-483 mimics組細胞miR-483 mRNA表達水平升高、DLC1 mRNA和蛋白表達水平降低(P<0.05)，見表4、圖2。

表4 MDA-MB-231乳腺癌細胞miR-483、DLC1 mRNA和蛋白表達水平比較

a:對照組；b:miR-NC組；c:miR-483 inhibitor組；d:miR-483 mimics組

3 討論

三陰性乳腺癌具有較高的轉移傾向和復發(fā)率，許多基因和蛋白已被證實在三陰性乳腺癌中表達改變，如表皮生長因子受體、血管內皮生長因子受體、拓撲異構酶Ⅱα[9]。到目前為止，一些標志物已被用于臨床診斷及預后分析。然而，絕大多數(shù)現(xiàn)有的腫瘤侵襲和進展標志物尚未通過嚴格的臨床前和臨床測試。因此，尋找與三陰性乳腺癌相關的新靶點對于治療三陰性乳腺癌意義重大。

miRNA通過與目標mRNA的3’非翻譯區(qū)中的互補核苷酸序列相互作用，導致其目標mRNA的降解或翻譯抑制，從而在基因表達中發(fā)揮重要作用。miRNA參與各種生物過程，包括發(fā)育、細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、分化、轉移和對化療藥物的抵抗等[10]。基于此，miRNA可作為癌癥診斷、預防和治療的靶點。研究證明，miRNA的異常表達可影響人類乳腺癌的增殖、侵襲或轉移，如與乳腺癌患者疾病特異性存活率降低顯著相關的HER2和HER3(erbB3)可以被miR-125a或miR-125b抑制；miR-146a和miR-26a在三陰性乳腺癌中過表達，而miR-10b和miR-153與三陰性乳腺癌淋巴結轉移的發(fā)生顯著相關[11]。這些結果再次強調了miRNA在乳腺癌中的作用。miR-483干擾多種腫瘤的進展，可預測結腸癌的無遠處轉移生存[12]。此外，miR-483可在體內促進肝細胞癌的腫瘤增殖，同時上調抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達[13-14]。但miR-483在三陰性乳腺癌中的作用尚不清楚。本研究結果顯示，與對照組、miR-NC組比較，miR-483 inhibitor組OD值、存活率降低，單克隆形成數(shù)目、穿膜數(shù)減少，凋亡率升高；miR-483 mimics組OD值、存活率升高，單克隆形成數(shù)目、穿膜數(shù)增加，凋亡率降低；與miR-483 inhibitor組比較，miR-483 mimics組OD值、存活率升高，單克隆形成數(shù)目、穿膜數(shù)增加，凋亡率降低，說明miR-483可促進三陰性乳腺癌細胞增殖、侵襲，并抑制其凋亡。

有學者在miR-483上游的2kb片段中檢測到DLC1啟動子活性，表明miR-483可能與由DLC1啟動子驅動的DLC1基因共轉錄[15]。此外，miR-483和DLC1在肝癌組織中表達呈負相關[16]。因此，我們推測miR-483可能反向調節(jié)宿主DLC1的表達。據(jù)報道，DLC1可抑制多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，包括腎母細胞瘤、肝細胞癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、結直腸癌等[17]。異常印跡或印跡丟失被廣泛認為是DLC1抑制癌變的重要機制。有研究發(fā)現(xiàn)DLC1在三陰性乳腺癌中低表達，DLC1可以抑制癌細胞增殖，DLC1低表達標志著癌前病變向惡性癌的轉變，雌激素受體陰性乳腺癌患者DLC1低表達預示著無復發(fā)生存率降低[18-19]。本研究結果顯示，與對照組、miR-NC組比較，miR-483 inhibitor組細胞miR-483 mRNA表達水平降低，DLC1 mRNA和蛋白表達水平升高，miR-483 mimics組細胞miR-483 mRNA表達水平升高，DLC1 mRNA和蛋白表達水平降低；與miR-483 inhibitor組比較，miR-483 mimics組細胞miR-483 mRNA表達水平升高、DLC1 mRNA和蛋白表達水平降低。說明miR-483負向調控DLC1表達，同時也提示miR-483體外轉染乳腺癌細胞可降低DLC1表達，抑制細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，miR-483可促進三陰性乳腺癌細胞增殖、侵襲，抑制其凋亡；其機制可能與miR-483抑制DLC1的表達有關。本研究首次報道了miR-483對三陰性乳腺癌細胞的潛在促癌作用和機制，可為研究miR-483作為三陰性乳腺癌的治療靶點提供進一步的支持。