長(zhǎng)沙地區(qū)南瓜白粉病病原菌及種質(zhì)資源抗性的鑒定

嚴(yán)佳麗，楚 簫，黎 豪，梁少華，孫小武

（園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與新品種選育教育部工程研究中心·湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 長(zhǎng)沙 410128）

南瓜是葫蘆科南瓜屬（）一年生蔓生草本植物，是我國(guó)重要的瓜類作物，也是栽培最早的蔬菜作物之一，主要分為五大栽培種，即中國(guó)南瓜（.）、印度南瓜（.）、美洲南瓜（.）、黑籽南瓜（.）及灰籽南瓜（.）。南瓜具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值、飼用價(jià)值和觀賞價(jià)值，深受廣大消費(fèi)者喜愛，在我國(guó)廣泛種植。南瓜在我國(guó)農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)調(diào)整和經(jīng)濟(jì)增收中起到了重要作用。自20 世紀(jì)70年代以來，隨著人們食物結(jié)構(gòu)的改善和對(duì)南瓜營(yíng)養(yǎng)成分及其保健價(jià)值的深入研究，南瓜種植面積逐年擴(kuò)大，南瓜生產(chǎn)過程中各種病害也逐年加重。白粉病是南瓜生產(chǎn)中的主要病害之一，白粉病具有潛伏久、發(fā)病快、蔓延迅速等特點(diǎn)，防治不當(dāng)，輕則減產(chǎn)20%～30%，重則造成植株死亡，嚴(yán)重影響南瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。

目前，引起瓜類白粉病的病原菌主要有3 個(gè)屬：白粉病菌屬（）、內(nèi)絲白粉病菌屬（）及單囊殼屬（），6 個(gè)種分別是.、.、.、.、.和.。.報(bào)道最多，其次為.。.已發(fā)現(xiàn)有11 個(gè)生理小種，分別是生理小種0、1、2US、2France、3、4、5、N1、N2、N3 和N4。

白粉病菌生理小種種類繁多，分化快。不同作物之間的白粉病生理小種相差甚遠(yuǎn)，同一作物在不同地區(qū)栽培，白粉病生理小種也不盡相同。準(zhǔn)確預(yù)測(cè)和鑒定南瓜白粉病病原菌種類，并檢測(cè)其生理小種的分化是解決南瓜白粉病防治難題的基礎(chǔ)。2006 年劉秀波等對(duì)黑龍江地區(qū)侵染南瓜白粉病生理小種進(jìn)行了鑒定，確定其為單囊殼白粉菌（.），而2009 年馬鴻艷等研究表明該地區(qū)的優(yōu)勢(shì)生理小種由2Frace 轉(zhuǎn)變?yōu)閞ace1。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的高速發(fā)展，基因序列比對(duì)等技術(shù)被應(yīng)用于物種鑒定等相關(guān)領(lǐng)域，白粉病病原菌的鑒定方式也由最初的顯微觀察向分子鑒定方向逐步發(fā)展。包海青等、王娟等、咸豐等利用顯微觀察和白粉病生理小種鑒別體系的方法分別對(duì)來自海南三亞地區(qū)、北京地區(qū)、陜西關(guān)中地區(qū)的南瓜白粉病菌進(jìn)行鑒定，確定白粉病病原菌為單囊殼白粉菌（.），其生理小種是2France。屈淑平等、綦聰通過形態(tài)觀察、分子鑒定及白粉病生理小種鑒別體系的方法，鑒定出黑龍江省哈爾濱市香坊區(qū)南瓜白粉病病原菌為單囊殼白粉菌（.），生理小種為2France。李書頡等利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法對(duì)內(nèi)蒙古不同地區(qū)籽用美洲南瓜白粉病病原菌種類進(jìn)行鑒定，確定內(nèi)蒙古地區(qū)白粉病為單囊殼白粉菌（.），初步確定存在小種4、2F、1 和1 個(gè)未知小種；夏偉偉等通過形態(tài)觀察、ITS 序列比對(duì)以及生理小種鑒別體系推斷安徽省合肥市長(zhǎng)豐地區(qū)的南瓜白粉病為單囊殼病菌，生理小種是race1。

湖南作為南瓜的重要產(chǎn)區(qū)之一，目前關(guān)于湖南地區(qū)的南瓜白粉病鑒定和抗病種質(zhì)篩選的研究較少，筆者以湖南省長(zhǎng)沙地區(qū)為例，通過對(duì)湖南省長(zhǎng)沙市金山基地南瓜白粉病病原菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察、擴(kuò)增該白粉病病原菌ITS 序列并進(jìn)行比對(duì)，鑒定該地區(qū)的白粉病病原菌種類；其次采用國(guó)際通用的甜瓜白粉病生理小種鑒別寄主明確該地區(qū)的白粉病菌的生理小種，對(duì)90 份南瓜種質(zhì)資源進(jìn)行白粉病抗性鑒定，篩選出高抗白粉病的種質(zhì)資源，為南瓜白粉病的抗病基因定位及培育抗白粉病新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2 份易感病自交系和90 份種質(zhì)資源鑒定材料由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院瓜類工程技術(shù)研究中心和湖南雪峰種業(yè)有限公司提供。易感病自交系為新土佐父本（.Duch.）和蜜本（.Duch.），90 份南瓜種質(zhì)資源為36 份中國(guó)南瓜類型和54 份印度南瓜類型。2019 年4 月在長(zhǎng)沙市芙蓉區(qū)湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)旁金山基地大棚種植南瓜自交系新土佐父本和蜜本，用于病原菌分離、鑒定及白粉病接種體系優(yōu)化，2019 年4 月在邵東縣九龍嶺鎮(zhèn)湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)南瓜實(shí)驗(yàn)基地大棚種植90 份種質(zhì)資源鑒定材料，用于抗性鑒定。

國(guó)際通用鑒別寄主：Iran H、Top Mark、Védrantais、PMR 45、PMR 5、WMR 29、Edisto 47、PI 414723、MR-1、PI 124111、PI 124112、PMR 6、Nantais Oblong，由北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院張興平教授惠贈(zèng)。甜瓜鑒別寄主均在人工氣候箱中培養(yǎng)，用于白粉病生理小種鑒定。

白粉病病原菌取自2019 年4 月種植于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)南瓜試驗(yàn)基地自然發(fā)病的南瓜植株葉片。

1.2 方法

1.2.1 白粉病病原菌分離純化 2019 年5 月收集自然發(fā)病南瓜葉片白粉病單菌落，滴入2 滴吐溫20，制成2.5×10～5.0×10個(gè)·mL孢子懸浮液，噴施于南瓜健康幼苗植株葉片上，后置于28 ℃、濕度80%、光照度30 000 lx、光周期為12 h 的人工氣候箱中培養(yǎng)，經(jīng)過5 次分離純化后利用易感病品種新土佐父本植株擴(kuò)繁，活體保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 白粉病病原菌形態(tài)觀察 參照馬鴻艷等的方法，利用KOH 溶液觀察纖維狀體，取白粉病病原菌的分生孢子于載玻片上，滴加1 滴3% KOH 溶液，蓋上蓋玻片，在10×40 倍光學(xué)顯微鏡下觀察白粉病孢子中是否存在纖維狀體。二孢白粉菌.的分生孢子呈細(xì)長(zhǎng)圓柱形，沒有纖維狀體。單囊殼白粉菌.的分生孢子呈橢圓形，有發(fā)達(dá)的纖維狀體。

1.2.3 白粉病病原菌分子鑒定 白粉病病原菌DNA 提取：用真菌DNA 小量提取試劑盒（天漠生物）提取白粉病病原菌的DNA。

ITS 序列PCR 擴(kuò)增引物與程序：利用真菌核糖體ITS 區(qū)段通用引物ITS 1、ITS 4，序列為：ITS 1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS 4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR 體系為50 μL 體系：DNA 模板1.25 μL，上下引物各2.5 μL，2×RapidMaster Mix（Vazyme）25 μL，ddHO 18.75 μL。PCR 反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃5 min；變性94 ℃30 s，退火50 ℃30 s，延伸72 ℃45 s，35 個(gè)循環(huán)；再延伸72 ℃，10 min。

凝膠電泳檢測(cè)：取5 μL PCR 產(chǎn)物，核酸染料染色，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，通過瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)觀察成像結(jié)果。

PCR 產(chǎn)物測(cè)序：將PCR 產(chǎn)物原液送至北京擎科生物有限公司進(jìn)行正反雙向測(cè)序。

序列分析：將南瓜白粉病病原菌ITS 序列在NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST 比對(duì)，使用DNAMAN軟件進(jìn)行序列對(duì)比分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。1.2.4 白粉病病原菌生理小種鑒定 采用國(guó)際通用的13 個(gè)甜瓜白粉病生理小種鑒別寄主。通過寄主分析不同白粉病病原菌生理小種抗感反應(yīng)以區(qū)別本試驗(yàn)中感染白粉病病原菌的生理小種，寄主對(duì)不同生理小種抗感反應(yīng)表現(xiàn)見表1，每個(gè)鑒別寄主種植10 株。待寄主材料第3 片真葉展開時(shí)即可接種，取分離純化后南瓜白粉病病原菌于清水中，滴加2 滴吐溫20，制成濃度為2.5×10～5.0×10個(gè)·mL的懸浮液，用毛刷蘸取菌液，均勻涂抹在寄主葉片正面。接種后保持晝/夜溫度26 ℃/16 ℃，相對(duì)濕度75%。接種后切忌在葉片上澆水，澆水和施肥從穴盤底部進(jìn)行。接種10 d 后調(diào)查發(fā)病情況，接種葉片出現(xiàn)白色分生孢子層的為感??；接種葉片無癥狀或出現(xiàn)褐色壞死病斑的為抗病。

表1 甜瓜白粉病生理小種鑒別寄主及其抗感反應(yīng)

1.2.5 南瓜種質(zhì)資源白粉病抗性鑒定 2019 年6 月在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)瓜類工程技術(shù)研究中心邵陽基地大棚中種植南瓜材料，在成株期對(duì)90 份南瓜種質(zhì)資源噴施濃度為2.5×10～5.0×10個(gè)·mL的白粉病孢子懸浮液，接種后15 d 對(duì)南瓜病情劃分等級(jí)，計(jì)算病情指數(shù)，根據(jù)病情指數(shù)計(jì)算結(jié)果判斷種質(zhì)資源抗性表現(xiàn)。鑒定標(biāo)準(zhǔn)見表2，病情指數(shù)（DI）計(jì)算如下：

表2 植株抗感白粉病情況鑒定標(biāo)準(zhǔn)

式中，s為發(fā)病等級(jí)，n為相應(yīng)發(fā)病等級(jí)植株數(shù)目，為調(diào)查總株數(shù)觀測(cè)量。

0＜DI≤20 時(shí)為高抗材料；20＜DI≤40 時(shí)為抗病材料；40＜DI＜60 時(shí)為中間型材料；60≤DI＜80 是為感病材料；DI≥80 為高感材料。

2 結(jié)果與分析

2.1 南瓜白粉病病原菌形態(tài)特征

由圖1 可知，取分離純化后南瓜白粉病病原菌在10×40 倍的電子顯微鏡下觀察分生孢子和纖維狀體，顯示分生孢子呈橢圓形。病原菌分生孢子內(nèi)均含明顯纖維狀體。通過形態(tài)特征觀察初步判斷，此白粉病菌為單囊殼白粉菌（）。

圖1 南瓜白粉病病原菌形態(tài)觀察

2.2 南瓜白粉病病原菌分子鑒定

利用真菌DNA 提取試劑盒（天漠生物）提取白粉病病原菌的DNA，利用通用引物ITS 1、ITS 4 擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為522 bp DNA 片段（圖2）。運(yùn)用DNAMAN 6.0（LynnonBiosoft）將序列與已報(bào)道侵染瓜類白粉病病原菌其他序列對(duì)比（圖3），結(jié)果表明，長(zhǎng)沙地區(qū)的白粉病病原菌與序列一致性高達(dá)99%；構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），結(jié)果表明南瓜白粉病病原菌ITS 序列相較于.、.、.而言，與單囊殼白粉?。ǎ┩搓P(guān)系更近。通過分子鑒定的方法，更進(jìn)一步驗(yàn)證了湖南省長(zhǎng)沙市湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)金山基地南瓜白粉病病原菌種類為單囊殼白粉菌（）。

圖2 南瓜白粉病病原菌DNA 擴(kuò)增結(jié)果

圖3 南瓜白粉病病原菌ITS 同源序列對(duì)比

圖4 根據(jù)ITS 序列構(gòu)建南瓜白粉病病原菌系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 南瓜白粉病病原菌生理小種鑒定

甜瓜鑒別寄主Iran H、Top mark、Védrantais、PMR 45、Nantais Oblong 接種10 d 葉片出現(xiàn)明顯白粉病斑；20 d 后植株葉片及莖干出現(xiàn)濃厚白粉層。而寄主PMR 5、WMR 29、Edisto 47、MR-1、PI 124111、PI 124112、PMR 6 無白粉病侵染情況，寄主PI 414723 出現(xiàn)極少數(shù)褐色壞死病斑，表現(xiàn)出較強(qiáng)抗病特征。對(duì)比表3 抗感反應(yīng)，確認(rèn)湖南省長(zhǎng)沙市湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)金山基地白粉病病原菌生理小種為單囊殼白粉病菌中的2France。

表3 鑒別寄主對(duì)南瓜白粉病菌抗感反應(yīng)

2.4 南瓜抗白粉病種質(zhì)資源的篩選

由表4 可以看出，從90 份種質(zhì)資源中篩選出9份高抗種質(zhì)、11 份抗病種質(zhì)、30 份中間型種質(zhì)、20份感病種質(zhì)以及20 份高感材料。其中，9 份高抗種質(zhì)全為中國(guó)南瓜類型；11 份抗病種質(zhì)包含3 份中國(guó)南瓜類型以及8 份印度南瓜類型；30 份中間型種質(zhì)包含8 份中國(guó)南瓜類型以及22 份印度南瓜類型；20 份感病病種質(zhì)包含9 份中國(guó)南瓜類型以及11 份印度南瓜類型；20 份高感種質(zhì)包含7 份中國(guó)南瓜類型以及13 份印度南瓜類型。

表4 90 份不同品系南瓜抗病性鑒定

3 討論與結(jié)論

瓜類作物白粉病病原菌在無性形態(tài)上不易區(qū)分，可通過分生孢子是否具有纖維狀體區(qū)分.和.，臧全宇通過有無纖維狀體的方法鑒定出杭州甜瓜白粉病菌屬于.。rDNA 序列克隆分析手段已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病原菌的分類，其中的ITS 序列進(jìn)化速度快，具有保守性，在不同的科、屬、種的水平上具有特異性，因此，通過設(shè)計(jì)引物比對(duì)分析病原菌ITS 序列可有效鑒定病原菌。張怡等采集河南周口地區(qū)的白粉病病原菌分析其ITS 序列，鑒定出該地區(qū)的瓜類白粉病菌屬于單囊殼白粉菌（.）。本試驗(yàn)中電子顯微鏡下的南瓜白粉病病原菌的分生孢子為橢圓形，3%的KOH 溶液著色效果下，孢子內(nèi)含有纖維狀體，初步判斷其屬于單囊殼白粉菌（.）。通過ITS 序列比對(duì)分析可知，長(zhǎng)沙地區(qū)南瓜白粉病病原菌（圖3 中HNCSJSJDLH）與、、、、及的ITS 序列高度同源，通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析可知，本試驗(yàn)中白粉病病原菌（圖4 中HNCSJSJDLH）與聚類在同一分支，進(jìn)一步確定長(zhǎng)沙地區(qū)南瓜白粉病病原菌屬于單囊殼白粉菌（.）。采用國(guó)際通用的甜瓜白粉病生理小種鑒別寄主明確鑒定出2019 年湖南省長(zhǎng)沙地區(qū)金山基地大棚南瓜白粉病菌的生理小種為2France。

目前，國(guó)內(nèi)報(bào)道的南瓜抗白粉病種質(zhì)資源鑒定研究主要以美洲南瓜類型為主。張旭業(yè)從28 份美洲南瓜材料中篩選出10 份抗病材料。屈淑平等從64 份美洲南瓜材料中篩選出13 份高抗資源和15 份高感材料。筆者對(duì)收集的90 份南瓜種質(zhì)資源進(jìn)行白粉病抗性鑒定，得到9 份高抗種質(zhì)、11份抗病種質(zhì)、30 份中間型種質(zhì)、20 份感病種質(zhì)以及20 份高感材料。其中，高抗種質(zhì)均為中國(guó)南瓜類型，感病材料多為印度南瓜類型，初步推斷，可能中國(guó)南瓜在白粉病抗性方面優(yōu)于印度南瓜，但仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究。本試驗(yàn)為抗白粉病種質(zhì)資源的挖掘、抗病基因定位研究以及抗病新品種的創(chuàng)制奠定了一定基礎(chǔ)。