韭菜葉綠素銅、鋅鈉鹽的制備及穩(wěn)定性研究

洪軍，李倩，張開放，薛佳琳，蔣夢瑤，劉志宏，馬棟豪

(1.河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南 平頂山 467041；2.河南久星生物科技研究院有限公司，河南 平頂山 467036)

天然綠色素的主要成分是葉綠素，大多來自植物提取物，是一種雙羧酸酯，不溶于水，可溶于有機(jī)溶劑，具有生理活性同時兼有營養(yǎng)、保健等功能，因此被較早地開發(fā)應(yīng)用[1-2]。天然綠色素也是一種實用色素，存在提純困難、穩(wěn)定性差等缺點，實用天然色素的安全性也受植物生長過程中農(nóng)藥、土地、水源、空氣等多方面的影響[3]。由于天然色素不太穩(wěn)定，在其使用過程中容易受各種因素如光照、溫度、氧化還原劑、pH值、金屬離子、添加劑等[4-5]影響而發(fā)生褪色、變色，影響其著色效果，嚴(yán)重制約了天然色素替代人工合成色素的進(jìn)程。有研究表明，將天然色素制備成葉綠素銅鈉鹽或鋅鈉鹽，有利于天然色素穩(wěn)定性的保持[6-7]。葉綠素銅、鋅鈉鹽是葉綠素的衍生物，也是一種可食用的綠色色素且能增強(qiáng)葉綠素的穩(wěn)定性。隨著人們對天然色素需求的不斷增加，對其穩(wěn)定性及功能研究也日漸增多[8-13]。

韭菜又名“起陽草”,是一種綠色蔬菜，含有豐富的葉綠素、多種活性物質(zhì)如含硫化合物、黃酮類化合物、甾體皂苷類化合物、含氮化合物、植物油類、維生素、微量元素等，經(jīng)常食之具有諸多好處，如降低膽固醇及血脂、清熱解毒及對心血管疾病有一定的預(yù)防和治療作用等[14-15]。但是，關(guān)于韭菜葉綠素及其衍生物穩(wěn)定性的相關(guān)研究尚未見報道。因此，本研究以新鮮韭菜為原材料提取葉綠素，通過將其制成銅、鋅鈉鹽對其穩(wěn)定性進(jìn)行研究，為同種類的天然葉綠素衍生物穩(wěn)定性的研究提供了理論支持，又可提高韭菜的經(jīng)濟(jì)附加值，為其深加工探索新途徑[16]。

1 材料與方法

1.1 材料與器材

材料：韭菜、皂基、食鹽、蔗糖、淀粉、椰子油、棕櫚油、橄欖油、面粉等。

試劑：蒸餾水、95%食用乙醇、氫氧化鈉、石油醚、鹽酸、硫酸鋅溶液、硫酸銅溶液、30% H2O2、無水亞硫酸鈉等。

器材：玻璃棒、燒杯、量筒、分液漏斗、膠頭滴管、pH計、GFL-125型烘箱、粉碎機(jī)、RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、HWS12型恒溫水浴鍋、電子天平、KQ5200DE型超聲波清洗儀、Genesys 10S型紫外分光光度計、酶標(biāo)儀等。

1.2 方法

1.2.1 葉綠素銅、鋅鈉鹽的制備

將新鮮韭菜葉洗凈、切段、烘干、粉碎、過篩，按液料比20∶1(mL/g)的比例向韭菜粉中加入95%食用乙醇，在60 ℃、200 W條件下超聲提取60 min，抽濾，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至1 g/mL，加入10% NaOH調(diào)節(jié)pH至12～13，然后在60 ℃下超聲皂化30 min，冷卻，加入皂化液等體積的石油醚，充分振蕩，靜置分層，上層醚液呈黃色即為完全皂化。用10% HCl將皂化液pH值調(diào)至1.5～2.0，加入10%硫酸銅(硫酸鋅)溶液，銅(鋅)離子的加入量按葉綠素分子中所含的鎂離子理論量的1.5～2.0倍加入，60 ℃下水浴2 h，抽濾，洗滌后將所得沉淀溶于乙醇中，加入10% NaOH溶液，調(diào)溶液pH值至12～13，靜置，烘干得到葉綠素銅(鋅)鈉鹽。

1.2.2 葉綠素銅、鋅鈉鹽的光譜圖

分別取葉綠素銅、鋅鈉鹽0.1 g，用蒸餾水溶解，定容至100 mL，二者分別取1 mL和2 mL的葉綠素銅鈉鹽溶液加蒸餾水定容至10 mL，以蒸餾水做空白參照，用紫外分光光度計在350～700 nm波長內(nèi)掃描。

1.2.3 葉綠素銅、鋅鈉鹽的穩(wěn)定性研究

分別稱取0.1 g葉綠素銅、鋅鈉鹽，用蒸餾水溶解并定容至1 L，制得0.01%的葉綠素銅、鋅鈉鹽水溶液為備用液1；分別稱取0.1 g葉綠素銅、鋅鈉鹽，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，制得0.1%的葉綠素銅、鋅鈉鹽水溶液為備用液2。

1.2.3.1 光照對葉綠素銅、鋅鈉鹽穩(wěn)定性的影響

每份取10 mL備用液1中的葉綠素銅、鋅鈉鹽水溶液密封于試管中，放置在室內(nèi)自然光照下，分別放置0，1，2，3，4，5，6，7，8 d。在每天的同一時間取少量溶液用酶標(biāo)儀測量溶液的吸光度，重復(fù)3次。

1.2.3.2 溫度對葉綠素銅、鋅鈉鹽穩(wěn)定性的影響

每份取10 mL備用液1中的葉綠素銅、鋅鈉鹽水溶液密封于試管中，分別于40，60，80，100 ℃的水浴鍋中水浴20 min。用酶標(biāo)儀測量吸光度，重復(fù)3次。

1.2.3.3 酸、堿性對葉綠素銅、鋅鈉鹽穩(wěn)定性的影響

每份取10 mL備用液1中的葉綠素銅、鋅鈉鹽水溶液密封于試管中，用10%的NaOH和HCl溶液調(diào)酸堿性，配成pH值接近2，4，6，8，10，12的溶液。測量相應(yīng)pH條件下葉綠素銅、鋅鈉鹽溶液的吸光度，重復(fù)3次。

1.2.3.4 氧化還原劑對葉綠素銅、鋅鈉鹽穩(wěn)定性的影響

每份取1 mL備用液2中的葉綠素銅、鋅鈉鹽水溶液密封于試管中，分別加入0%、0.30%、0.60%、0.90%的H2O2和Na2SO3溶液9 mL進(jìn)行10倍的稀釋。測量溶液的吸光度，重復(fù)3次。

1.2.3.5 食品添加劑對葉綠素銅、鋅鈉鹽穩(wěn)定性的影響

每份取1 mL備用液2中的葉綠素銅、鋅鈉鹽水溶液密封于試管中，分別加入0%、2%、4%、6%的食鹽，蔗糖和淀粉溶液9 mL進(jìn)行10倍的稀釋。測量溶液的吸光度，重復(fù)3次。

1.2.4 葉綠素銅鈉鹽的應(yīng)用

1.2.4.1 手工皂

取100 g皂基于燒杯中，將其在微波爐中溶解后加入橄欖油、椰子油及棕櫚油各1 mL，混合均勻后加入1 mL葉綠素銅鈉鹽溶液，攪拌均勻后迅速倒入模具中，注意避免表面產(chǎn)生氣泡，過夜，脫模。

1.2.4.2 面條

取適量面粉備用，將所制葉綠素銅鈉鹽溶于適量水中調(diào)至溶液顏色鮮艷漂亮，用其與面粉混合均勻制成色素面團(tuán)，最后將面團(tuán)搟成餅狀在壓面機(jī)中壓成色素面條。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素銅、鋅鈉鹽的特征光譜

由圖1可知，在350～700 nm范圍內(nèi)葉綠素銅鈉鹽在408 nm和634 nm波長下有峰值，由于在408 nm波長下吸收峰最大，所以在408 nm波長下分別測定光照、溫度、pH、氧化還原劑和食品添加劑對葉綠素銅鈉鹽穩(wěn)定性的影響。

圖1 葉綠素銅鈉鹽吸收光譜Fig.1 The absorption spectra of sodium copper chlorophyll

由圖2可知，在350～700 nm范圍內(nèi)葉綠素鋅鈉鹽在412 nm和632 nm波長下有峰值，由于其在412 nm波長下吸收峰最大，所以在412 nm波長下分別測定光照、溫度、pH、氧化還原劑和食品添加劑對葉綠素鋅鈉鹽穩(wěn)定性的影響。

圖2 葉綠素鋅鈉鹽吸收光譜Fig.2 The absorption spectra of sodium zinc chlorophyll

2.2 葉綠素銅、鋅鈉鹽的穩(wěn)定性研究

2.2.1 光照對葉綠素銅、鋅鈉鹽穩(wěn)定性的影響

由圖3可知，隨著光照時間的延長，葉綠素銅、鋅鈉鹽的OD值均不斷降低，鋅鈉鹽的OD值降低更多，并且在3 d之后二者顏色與其開始相比均從視覺上可以看出明顯褪色，同樣是鋅鈉鹽褪色更多，說明光照對葉綠素銅、鋅鈉鹽的穩(wěn)定性影響大，應(yīng)避光保存，相同光照條件下葉綠素銅鈉鹽的穩(wěn)定性更好。

圖3 葉綠素銅、鋅鈉鹽在不同光照時間下的吸光值Fig.3 The absorption values of sodium copper chlorophyll and sodium zinc chlorophyll under different illumination time

2.2.2 溫度對葉綠素銅、鋅鈉鹽穩(wěn)定性的影響

由圖4可知，隨著溫度的逐漸增加，葉綠素銅、鋅鈉鹽的吸光值均變化不明顯，整體銅鈉鹽的吸光值變化更小，因此得出在0～100 ℃溫度范圍內(nèi)，溫度對葉綠素銅、鋅鈉鹽的穩(wěn)定性均影響較小，二者均耐熱性較好，相同溫度條件下葉綠素銅鈉鹽的穩(wěn)定性更好。

圖4 葉綠素銅、鋅鈉鹽在不同溫度下的吸光值Fig.4 The absorption values of sodium copper chlorophyll and sodium zinc chlorophyll at different temperatures

2.2.3 酸、堿性對葉綠素銅、鋅鈉鹽穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，葉綠素銅、鋅鈉鹽均在中性和堿性條件下吸光度較高，在酸性條件下吸光度低且有沉淀生成，其中鋅鈉鹽在酸性條件下吸光值更低，pH大于8時OD值下降明顯，整體銅鈉鹽的吸光值更高，說明葉綠素銅、鋅鈉鹽在保存時均應(yīng)避免強(qiáng)酸性條件，可在中堿性條件下進(jìn)行保存，相同pH條件下葉綠素銅鈉鹽更穩(wěn)定。

圖5 葉綠素銅、鋅鈉鹽在不同pH下的吸光值Fig.5 The absorption values of sodium copper chlorophyll and sodium zinc chlorophyll at different pH values

2.2.4 氧化還原劑對葉綠素銅、鋅鈉鹽穩(wěn)定性的影響

由圖6可知，在葉綠素銅鈉鹽溶液中加入同種濃度的氧化還原劑時，加入氧化劑的葉綠素銅鈉鹽的OD值降低更多，說明氧化劑對葉綠素銅鈉鹽的影響大于還原劑，且高濃度下對其影響較大。因此，對于葉綠素銅鈉鹽的保存和應(yīng)用應(yīng)避免高濃度氧化劑，而氧化還原劑對葉綠素鋅鈉鹽的穩(wěn)定性影響較小。

圖6 葉綠素銅、鋅鈉鹽在不同濃度氧化還原劑下的吸光值Fig.6 The absorption values of sodium copper chlorophyll and sodium zinc chlorophyll at different concentration of oxidants and reductants

2.2.5 食品添加劑對葉綠素銅、鋅鈉鹽穩(wěn)定性的影響

由圖7可知，對于常見食品添加劑加入到葉綠素銅、鋅鈉鹽時其OD值相較于對照組變化不大，說明常見食品添加劑對葉綠素銅、鋅鈉鹽的穩(wěn)定性影響較小。

圖7 葉綠素銅、鋅鈉鹽在不同食品添加劑下的吸光值Fig.7 The absorption values of sodium copper chlorophyll and sodium zinc chlorophyll with different food additives

2.3 葉綠素銅鈉鹽的應(yīng)用效果

將葉綠素銅鈉鹽應(yīng)用在面條上，從顏色上來看，隨著光照處理延長，面條有褪色現(xiàn)象，但仍可以看出綠色，說明葉綠素銅鈉鹽提高了天然葉綠素的穩(wěn)定性，增強(qiáng)了其耐光性。

將葉綠素銅鈉鹽應(yīng)用在手工皂上，與避光保存的手工皂相比，經(jīng)過光照處理3 d后的手工皂有稍許褪色，但整體顏色差異不明顯。

3 討論

葉綠素中含有天然活性物質(zhì)，可以預(yù)防多種疾病，將其制成葉綠素銅、鋅鈉鹽很好地提高了其穩(wěn)定性且將其由脂溶性物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榱怂苄晕镔|(zhì)，從而極大地擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍。實驗提取的葉綠素銅、鋅鈉鹽均帶有金屬光澤，易溶于水，為墨綠色，著色性好，耐熱性好，在中堿性條件下穩(wěn)定性較好，常見的食品添加劑對二者穩(wěn)定性的影響不大，且氧化還原劑對葉綠素鋅鈉鹽的影響較小，這與賴海濤等[17]對紫菜葉綠素銅鈉鹽的制備及其穩(wěn)定性研究的結(jié)果相似。雖然葉綠素銅、鋅鈉鹽的穩(wěn)定性相對于葉綠素來說大大增強(qiáng)，但強(qiáng)酸及光照條件對二者的穩(wěn)定性還是有一定影響，因此在保存和應(yīng)用葉綠素銅、鋅鈉鹽時應(yīng)避免光照及強(qiáng)酸性條件。另外，高濃度氧化劑對葉綠素銅鈉鹽也有一定影響，這與李祥等[18]對劍麻膏中葉綠素銅鈉鹽穩(wěn)定性研究的結(jié)果相似，因此在保存葉綠素銅鈉鹽時還應(yīng)避免高濃度氧化劑，以便保持更好的應(yīng)用效果，實驗整體可以得出葉綠素銅鈉鹽的穩(wěn)定性更好。目前，葉綠素銅鈉鹽是我國唯一允許在食品工業(yè)使用的綠色色素，被廣泛應(yīng)用于食品和日用品甚至醫(yī)藥等方面[19],在食品中可應(yīng)用于各種糖果、糕點等中，實驗中將葉綠素銅鈉鹽應(yīng)用在手工面條及手工皂也反映出葉綠素銅鈉鹽具有較好的穩(wěn)定性及安全性，其在日用品中能作為化妝品的著色劑，還能在牙膏中使用且對治療口腔疾病也有一定幫助[20]。此外，在醫(yī)藥方面它還具有加快傷口愈合、治療胃潰瘍的功能且有研究表明其對腫瘤也具有一定的抑制作用[21]，因此葉綠素銅鈉鹽具有廣闊的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

通過本研究可知，與葉綠素鋅鈉鹽相比，葉綠素銅鈉鹽具有更高的光、熱及酸堿穩(wěn)定性；與葉綠素銅鈉鹽相比，葉綠素鋅鈉鹽對氧化還原劑及食品添加劑的穩(wěn)定性更好，兩種水溶性鈉鹽分別具有補(bǔ)充銅制劑和鋅制劑的功能。整體而言，葉綠素銅鈉鹽的穩(wěn)定性更好，更適合應(yīng)用于食品和日用品中，且通過前期實驗得出葉綠素鈉鹽相較脂溶性綠色素的穩(wěn)定性均明顯提高。因此在保存葉綠素銅、鋅鈉鹽時應(yīng)避光保存并避免強(qiáng)酸條件，銅鈉鹽還需避免高濃度氧化還原劑條件。葉綠素銅、鋅鈉鹽在食品中應(yīng)用不僅能增加外觀，而且能提高其產(chǎn)品功能。