基于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和高通量測(cè)序不同孔徑陶瓷膜過(guò)濾前后泡菜汁中微生物變化的研究

王玉梅，李洋，羅佳沂，李凱，毛瑞豐

(廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，南寧 530004)

泡菜是以新鮮果蔬為原料，輔以香辛料，添加或不添加發(fā)酵劑，采用鹽水浸漬厭氧發(fā)酵制作而成的[1-2]。泡菜中含有豐富的礦物質(zhì)[3]、氨基酸[4]、有機(jī)酸[5]、維生素[6]等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在發(fā)酵后期泡菜風(fēng)味物質(zhì)含量豐富，不僅能滿足人體所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且具有酸、鮮、爽、脆、嫩等特點(diǎn)[7-9]。近年來(lái)，膜過(guò)濾技術(shù)發(fā)展相當(dāng)迅速，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各行各業(yè)，包括污水處理[10-11]、化工[12-13]、食品[14-15]、醫(yī)療、氣體分離等。

陶瓷膜是以壓力泵驅(qū)動(dòng)帶來(lái)膜內(nèi)外的壓力差，促使料液樣品中的小分子物質(zhì)和水在壓力的驅(qū)動(dòng)下透過(guò)膜，而一些大分子(膠體、酚類物質(zhì)、蛋白及微生物等)且粒徑遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于膜孔徑的物質(zhì)被截留，從而達(dá)到除菌和澄清的效果[16-17]。本研究采用傳統(tǒng)生物學(xué)以及高通量測(cè)序技術(shù)分析不同孔徑陶瓷膜對(duì)泡菜汁微生物截留的種類、差異性及菌相的變化，并對(duì)陶瓷膜孔徑不同對(duì)微生物截留的差異性進(jìn)行討論，為今后陶瓷膜處理應(yīng)用于發(fā)酵類產(chǎn)品除菌的研究與應(yīng)用提供了理論依據(jù)，也為泡菜汁的綜合利用及多元化發(fā)展提供了優(yōu)質(zhì)原料。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

泡菜汁：由廣西某泡菜廠提供。取得的泡菜汁經(jīng)8層滅菌紗布過(guò)濾之后即可作為膜處理的原料液。分別在溫度TEM=40 ℃,膜面流速為CFV=4～5 m/s, 跨膜壓差為T(mén)MP0.008=0.5 MPa、TMP0.05=0.35 MPa、TMP0.2=0.3 MPa、TMP0.5=0.25 MPa的條件下過(guò)濾泡菜汁。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

孔徑為0.008，0.05，0.2，0.5 μm的陶瓷膜及陶瓷膜中試設(shè)備。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 陶瓷膜處理前后細(xì)菌和真菌的分離純化

取3 mL經(jīng)陶瓷膜處理的泡菜汁及原泡菜汁樣品于無(wú)菌平板中，用平板傾注法分別倒NA、PDA平板。待平板凝固后，將NA平板倒置放在37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，將PDA平板倒置放在28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，然后對(duì)平板內(nèi)的細(xì)菌和真菌菌株分離純化，分離純化方法采用平板劃線法，直到獲得純化的單菌落保存于-20 ℃冰箱中。

1.3.2 DNA的提取及PCR擴(kuò)增

將分離的細(xì)菌于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 h，參考細(xì)菌DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取、將分離的真菌于PDB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，參考真菌DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取。PCR擴(kuò)增采用50 μL反應(yīng)體系：

細(xì)菌擴(kuò)增引物：27F/1492R 27F：5′-AGAGTTT-GATCCTGGCTCAG-3′；

1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′；

真菌擴(kuò)增引物：ITS1/ITS4 ITS1：5′-TCCGTA-GGTGAACCTGCGG-3′；

ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

表1 PCR擴(kuò)增程序Table 1 PCR amplification program

表2 PCR反應(yīng)條件Table 2 PCR reaction conditions

1.3.3 DNA與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的保存方法

DNA與PCR產(chǎn)物分別放置在滅菌的1.5 mL的離心管和PCR管中密封，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 DNA測(cè)序及序列相似性對(duì)比

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，獲得清晰明亮的條帶， PCR產(chǎn)物委托生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

16S rRNA和ITS序列分析：序列分析登錄NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用BLAST程序分別對(duì)所測(cè)得的16S rRNA 和ITS序列與GenBank中的核酸進(jìn)行相似性比對(duì)。采用軟件Clustal X1.83 進(jìn)行多序列的比對(duì)，并將對(duì)位排列結(jié)果中5′和3′端的非對(duì)位排列區(qū)手動(dòng)刪除。預(yù)處理好的DNA序列利用MEGA 7.0軟件[18]計(jì)算序列的堿基組成(compute nucleotide composition)[19]、計(jì)算遺傳距離[20]、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[21]、檢驗(yàn)各分支的置信度[22]。遺傳距離基于Kimura 2-parameter模式計(jì)算、系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)基于neighbor-joining(NJ)法構(gòu)建，各分支的置信度利用自展法(Bootstrap重復(fù)1000次)檢驗(yàn)。

1.3.5 高通量測(cè)序

分別稱取200 mg 4種不同孔徑陶瓷膜處理前后的泡菜汁樣品，放入滅菌后的2 mL離心管中，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，振蕩混勻，以10000 r/min室溫離心3 min，棄上層液體。加入磷酸鹽緩沖液溶液(0.01 mol/L，pH 7.2)，振蕩混勻，以10000 r/min室溫離心 3 min，棄上層液體。按照 Power Soil DNA Isolation Kit說(shuō)明書(shū)分別提取4種不同孔徑陶瓷膜處理前后的泡菜汁樣品的細(xì)菌、真菌群的宏基因組DNA，利用 Qubit 3.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行精確定量。以提取的宏基因組DNA為模板，采用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)細(xì)菌的16S rRNA(V3-V4)區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物SSU0817F(5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′)對(duì)真菌的ITS(ITS1-ITS2)區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，共20個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸 10 min。PCR 擴(kuò)增體系(20 μL)：5×Fast Pfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,正向及反向引物(5 μmol/L)各 0.8 μL，F(xiàn)ast Pfu Polymerase 0.4 μL, BSA 0.2 μL，模板 DNA 10 ng，補(bǔ)雙蒸水(ddH2O)至20 μL。利用Min Eluter PCR Purification Kit對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化,PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),使用膠回收試劑盒對(duì)PCR目的條帶進(jìn)行純化回收。利用 Tru-Seq rDNA PCR-Free Sample Preparation Kit制備測(cè)序文庫(kù)并添加接頭序列，經(jīng)過(guò)Nano Drop 2000測(cè)定文庫(kù)質(zhì)量后，利用Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

根據(jù)97%相似性[23]，將非重復(fù)序列進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類，然后采用RDP Classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)4種不同孔徑陶瓷膜處理前后泡菜汁樣品的微生物在不同水平的群落組成。利用Mothur軟件繪制稀釋性曲線進(jìn)行Alpha多樣性分析[24]，利用QIIME軟件計(jì)算樣品的各種多樣性指數(shù)，原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Excel軟件，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 2019b軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增

以提取的37株細(xì)菌、33株乳酸菌及14株真菌的DNA為模板，細(xì)菌和乳酸菌以27F和1492R為引物，進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增，真菌以ITS1和ITS4為引物，進(jìn)行ITS擴(kuò)增，并將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，見(jiàn)圖1。

注:圖中1～37分別代表Q0-1、Q0-2、Q0-3、Q0-4、Q0-5、Q0-6、Q0-7、Q0-8、Q0-9、Q0-10、Q0-11、Q0-12、Q0-13、Q0-14、Q0-15、Q0-16、Q0-17、Q0-18、Q500-1、Q500-2、Q500-3、Q500-4、Q500-5、Q500-6、Q500-7、Q500-8、Q500-9、Q200-1、Q200-2、Q200-3、Q200-4、Q200-5、Q200-6、Q50-1、Q50-2、Q50-3、Q50-4。

注:圖中1～33分別代表M0-1、M0-2、M0-3、M0-4、M0-5、M0-6、M0-7、M0-8、M0-9、M0-10、M0-11、M0-12、M0-13、M0-14、M0-15、M500-1、M500-2、M500-3、M500-4、M500-5、M500-6、M500-7、M500-8、M200-1、M200-2、M200-3、M200-4、M200-5、M200-6、M50-1、M50-2、M50-3、M50-4。

注:圖中1～14分別代表P0-1、P0-2、P0-3、P0-4、P0-5、P0-6、P0-7、P0-8、P500-1、P500-2、P500-3、P500-4、P200-1、P200-2。

由圖1可知，37株細(xì)菌、33株乳酸菌和14株真菌擴(kuò)增產(chǎn)物都是條帶明亮清晰且單一不拖尾，無(wú)非特異擴(kuò)增現(xiàn)象，且細(xì)菌菌株和乳酸菌菌株的16S rRNA序列片段大小均在1200～1400 bp左右，真菌菌株的ITS序列片段大小均在600 bp左右，滿足測(cè)序要求。

2.2 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

2.2.1 16S rRNA序列分析及遺傳距離

將不同孔徑陶瓷膜處理后泡菜汁中細(xì)菌分離純化得58株細(xì)菌菌株及72株乳酸菌菌株，將其中37株(原泡菜汁中18株；0.5 μm陶瓷膜處理后泡菜汁9株；0.2 μm 陶瓷膜處理后泡菜汁6株；0.05 μm陶瓷膜處理后泡菜汁4株)細(xì)菌和33株(原泡菜汁中15株；0.5 μm陶瓷膜處理后泡菜汁8株；0.2 μm陶瓷膜處理后泡菜汁6株；0.05 μm陶瓷膜處理后泡菜汁4株)乳酸菌進(jìn)行微生物菌種鑒定。測(cè)序結(jié)果顯示：在去除兩端16S rRNA引物序列后，應(yīng)用MEGA 7.0軟件將37個(gè)細(xì)菌和33個(gè)乳酸菌菌株16S rRNA基因序列進(jìn)行多序列對(duì)比后計(jì)算得到GC含量表，見(jiàn)表3。

表3 細(xì)菌16S rRNA序列的GC含量及序列長(zhǎng)度Table 3 GC content and sequence lengths of 16S rRNA of bacteria

續(xù) 表

由表3可知，37個(gè)細(xì)菌株GC含量在50.95%～58.03%。16S rRNA對(duì)齊序列長(zhǎng)度在1005～1205 bp。此外，37個(gè)不同序列間的平均遺傳距離(D)為0.0328。33個(gè)乳酸菌菌株GC含量在50.16%～54.23%。16S rRNA對(duì)齊序列長(zhǎng)度在990～1180 bp。此外，33個(gè)乳酸菌不同序列間的平均遺傳距離(D)為 0.6131。

2.2.2 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析

將37株細(xì)菌菌株和33株乳酸菌的基因序列，采用GenBank序列數(shù)據(jù)庫(kù)，在NCBI上根據(jù)BLAST檢索，搜索與上述所測(cè)得序列相似度較高的16S rRNA序列，分析比較后刪除相同的序列，最終篩選最相似的16S rRNA序列與供試菌株序列的NJ法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

細(xì)菌結(jié)果見(jiàn)圖2，細(xì)菌的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)各主分支的自舉支持率范圍在82%～100%，且各主分支的后驗(yàn)概率大部分在0.90～1.0之間。最終將37株供試菌株歸為4個(gè)屬，分別為芽孢桿菌(Bacillus)、放線菌屬(Actinobacteriotas)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)和短桿菌屬(Brevibacillus)，以及14個(gè)種，分別為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、嬰兒芽孢桿菌(Bacillusinfantis)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、蟬桿菌(Bacillusciccensis)、放線菌(Actinobacteriabacterium)、馬賽短芽孢桿菌(Brevibacillusmassiliensis)、橙色短波單胞菌(Brevundimonasaurantiaca)、堀越氏芽孢桿菌(Bacillushorikoshii)、Bacillusgottheilii、Brevundimonascaseigenomic strain、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)及絲狀芽孢桿菌(Bacillusfilamentosus)。經(jīng)過(guò)0.5 μm陶瓷膜處理后，泡菜汁中檢測(cè)出8種細(xì)菌分別是蟬桿菌(Bacillusciccensis)、放線菌(Actinobacteriabacterium)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)、嬰兒芽孢桿菌(Bacillusinfantis)和貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)。經(jīng)過(guò)0.2 μm陶瓷膜處理后，泡菜汁中檢測(cè)出5種細(xì)菌，分別是蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)、嬰兒芽孢桿菌(Bacillusinfantis)和貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)。經(jīng)過(guò)0.05 μm陶瓷膜處理后，泡菜汁中檢測(cè)出3種細(xì)菌分別是解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)和貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)。經(jīng)過(guò)0.008 μm陶瓷膜處理后，未能成功分離鑒定出細(xì)菌。貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)對(duì)病原菌和一些青霉有一定的抑制作用[25]。從基因組學(xué)上來(lái)說(shuō)，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)是貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)的后期異形體[26]。短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)微生物本身無(wú)毒無(wú)害且無(wú)污染，且對(duì)一些引起食品腐敗微生物抑制產(chǎn)生積極作用[27-29]。

圖2 基于16S rRNA序列的37株細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of 37 strains of bacteria based on 16S rRNA sequence

乳酸菌結(jié)果見(jiàn)圖3，乳酸菌的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)各主分支的自舉支持率范圍在97%～100%，且各主分支的后驗(yàn)概率大部分在0.95～1.0之間。最終將33株供試菌株歸為2個(gè)屬，分別為乳桿菌屬(Lactobacillus)和黏液乳桿菌屬(Limosilactobacillus), 以及13個(gè)種，分別發(fā)酵黏液乳桿菌(Limosilactobacillusfermentum)、乳酸乳桿菌(Lactobacilluslactis)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)和干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)。經(jīng)過(guò)0.5，0.2，0.05 μm陶瓷膜處理后，泡菜汁中乳酸菌的截留率雖能達(dá)到89.396%以上，但泡菜汁中仍能檢測(cè)出3種乳酸菌，包括乳酸乳桿菌(Lactobacilluslactis)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)和干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)。

圖3 基于16S rRNA序列的33株乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of 33 strains of lactic acid bacteria based on 16S rRNA sequence

經(jīng)陶瓷膜處理后，泡菜汁中的微生物種類減少，且隨著陶瓷膜孔徑的降低，泡菜汁中微生物的種類越少，且經(jīng)過(guò)0.05 μm陶瓷膜處理后，泡菜汁中幾乎未檢出對(duì)人體產(chǎn)生毒害的細(xì)菌，而經(jīng)過(guò)陶瓷膜處理的泡菜汁中含有的短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、乳酸乳桿菌(Lactobacilluslactis)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)和干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)能對(duì)后續(xù)作為老湯再利用提供良好的抑菌效果，于此同時(shí)乳酸菌也能在一定程度上加快發(fā)酵速度，縮短發(fā)酵周期。

2.3 真菌分離鑒定結(jié)果

2.3.1 ITS序列分析及遺傳距離

4種不同孔徑膜過(guò)濾后泡菜汁中，分離純化得30株真菌，將其中14株，原泡菜汁中8株、0.5 μm孔徑膜過(guò)濾后泡菜汁4株、0.2 μm孔徑膜過(guò)濾后泡菜汁2株，對(duì)其進(jìn)行微生物菌種鑒定。測(cè)序結(jié)果顯示：在去除兩端ITS引物序列后，應(yīng)用MEGA 7.0軟件將14個(gè)菌株ITS基因序列進(jìn)行多序列對(duì)比后計(jì)算得到GC含量，見(jiàn)表4。

表4 真菌ITS序列的GC含量及序列長(zhǎng)度Table 4 GC content and sequence lengths of ITS of fungi

結(jié)果顯示：14個(gè)菌株的GC含量在41.93%～51.35%。ITS對(duì)齊序列長(zhǎng)度在472～498 bp。此外，14個(gè)不同序列間的平均遺傳距離(D)為 0.0677。

2.3.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

將14株真菌株的基因序列，采用GenBank序列數(shù)據(jù)庫(kù)，在NCBI上根據(jù)BLAST檢索，搜索與上述所測(cè)得序列相似度較高的ITS序列，分析比較后刪除相同的序列，最終篩選最相似的ITS序列與供試菌株序列的NJ法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

由圖4可知，真菌的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)各主分支的自舉支持率范圍在97%～100%，且各主分支的后驗(yàn)概率大部分在0.96～1.0之間。最終將14株供試菌株歸為4個(gè)屬，分別為曲霉菌屬(Aspergillus)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)和畢赤酵母屬(Pichias)，以及4個(gè)種，分別為謝瓦曲霉(Aspergilluschevalieri)、卡尼克酵母菌(Sporobolomycescarnicolor)、鎖擲孢酵母菌(Sporidioboluspararoseus)和庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母菌(Pichiakudriavzevii)。經(jīng)過(guò)0.5 μm陶瓷膜處理后，泡菜汁中檢測(cè)出3種真菌分別是卡尼克酵母菌(Sporobolomycescarnicolor)、鎖擲孢酵母菌(Sporidioboluspararoseus)和庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母菌(Pichiakudriavzevii)。經(jīng)過(guò)0.2 μm陶瓷膜處理后，泡菜汁中檢測(cè)出3種真菌，分別是鎖擲孢酵母菌(Sporidioboluspararoseus)和庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母菌(Pichiakudriavzevii)。經(jīng)0.05 μm陶瓷膜處理后，泡菜汁中的真菌未達(dá)到檢出限。

圖4 基于ITS序列的14株真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of 14 strains of fungi based on ITS sequence

2.4 不同孔徑陶瓷膜處理后泡菜汁中微生物多樣性分析

2.4.1 基因組提取和PCR擴(kuò)增

以提取的37株細(xì)菌、33株乳酸菌及14株真菌的DNA為模板，細(xì)菌和乳酸菌以27F和1492R為引物進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增，真菌以ITS1和ITS4為引物進(jìn)行ITS擴(kuò)增，并將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示：37株細(xì)菌、33株乳酸菌和14株真菌擴(kuò)增產(chǎn)物都是條帶明亮清晰且單一不拖尾，無(wú)非特異擴(kuò)增現(xiàn)象，且細(xì)菌菌株和乳酸菌菌株的16S rRNA序列片段大小均在1200～1400 bp左右，真菌菌株的ITS序列片段大小均在600 bp左右，滿足測(cè)序要求(經(jīng)過(guò)0.008 μm陶瓷膜處理后泡菜汁菌含量濃度較低，未能達(dá)到檢出限)。

2.4.2 Alpha多樣性分析

對(duì)不同孔徑陶瓷膜處理前后5個(gè)泡菜汁樣品的細(xì)菌和真菌進(jìn)行Alpha多樣性分析，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 泡菜汁經(jīng)不同孔徑陶瓷膜處理前后Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)表Table 5 Alpha diversity index statistics of pickle juice before and after treatment with ceramic membranes of different pore sizes

由表5可知，4個(gè)樣品細(xì)菌和真菌覆蓋度指數(shù)均大于99%，表明泡菜汁中微生物多樣性組成且序列99%被檢出。根據(jù)ACE與Chao1值可知泡菜汁中群落豐富度指數(shù)，根據(jù)ACE預(yù)估泡菜汁中群落OUT數(shù)目，根據(jù)Chao1指數(shù)預(yù)估泡菜汁中物種總數(shù)。由ACE與Chao1值可知，泡菜原汁中的細(xì)菌及真菌物種總數(shù)最大，經(jīng)0.5 μm陶瓷膜處理后泡菜汁次之，其次是0.2 μm，0.05 μm物種總數(shù)最少。Shannon和Simpson指數(shù)表征群落內(nèi)物種分布的多樣性和均勻度，Shannon或Simpson指數(shù)越大，物種分布的多樣性和均勻度越高，即群落的物種多樣性越高。經(jīng)陶瓷膜膜處理后，Shannon和Simpson指數(shù)下降,且陶瓷膜孔徑越小Shannon和Simpson指數(shù)越小。泡菜原汁物種多樣性和均勻度顯著高于經(jīng)陶瓷膜處理后的泡菜汁。

2.4.3 細(xì)菌和真菌結(jié)構(gòu)相似性分析

在多元統(tǒng)計(jì)分析中，主成分分析PCA(principal component analysis)是一種簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)集的技術(shù)。主成分分析經(jīng)常用于減少數(shù)據(jù)集的維數(shù)，同時(shí)保持?jǐn)?shù)據(jù)集中對(duì)方差貢獻(xiàn)最大的特征，從而有效地找出數(shù)據(jù)中最主要的元素和結(jié)構(gòu)，揭示隱藏在復(fù)雜數(shù)據(jù)背后的簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)(R軟件)。由圖5可知，樣本間相似度越高則在圖中越聚集。4個(gè)樣品中基于細(xì)菌、真菌的OTU做PCA分析。采用PCA對(duì)陶瓷膜過(guò)濾前后泡菜汁中細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的相似性進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖5，細(xì)菌第一主成分方差貢獻(xiàn)率和第二貢獻(xiàn)率分別為63.48%和33.59%，兩個(gè)主成分覆蓋泡菜汁樣品中細(xì)菌97.07%的OTU差異。原泡菜汁與0.05 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁距離較遠(yuǎn)，表明經(jīng)過(guò)0.05 μm陶瓷膜處理后細(xì)菌群落結(jié)果差異較大，而原泡菜汁與與0.5 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁樣品聚集到一起，說(shuō)明原泡菜汁0.5 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁細(xì)菌群落組成最相似，其次是0.2 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁。真菌第一主成分方差貢獻(xiàn)率和第二貢獻(xiàn)率分別為61.08%和22.7%，兩個(gè)主成分覆蓋泡菜汁樣品中真菌83.78%的OTU差異。原泡菜汁與0.05 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁距離較遠(yuǎn)，表明經(jīng)過(guò)0.05 μm陶瓷膜處理后真菌群落結(jié)果差異較大，而原泡菜汁與0.5 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁樣品聚集到一起，說(shuō)明原泡菜汁與0.5 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁真菌群落組成最相似，其次是0.2 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁。

2.4.4 細(xì)菌和真菌群落多樣性

分別從域、門(mén)、綱、目、科、屬這6個(gè)水平對(duì)5個(gè)樣品進(jìn)行細(xì)菌群落、真菌群落分析。

在門(mén)分類水平上，原泡菜汁及經(jīng)過(guò)不同孔徑陶瓷膜處理泡菜汁細(xì)菌的分類情況見(jiàn)圖6中(a)，其中厚壁菌門(mén)(Firmicutes)在原泡菜汁、0.5 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁、0.2 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁、0.05 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁中占優(yōu)勢(shì)，豐度分別為44.41%、66.35%、98.38%、99.36%；變形菌門(mén)(Proteobacteria)在原泡菜汁、0.5 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁中占優(yōu)勢(shì)豐度分別為21.59%、18.56%，0.2 μm和0.05 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁未檢測(cè)到；Actinobacteriota在原泡菜汁、0.5，0.2，0.05 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁中豐度分別為7.47%、6.25%、0%、0%；Bacteroidota在各個(gè)樣品中的豐度分別為2.64%、3.9%、1.42%、0%；綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)在各個(gè)樣品中的豐度分別為11.87%、0.54%、0%、0%； Gemmatimonadota在各個(gè)樣品中的豐度分別為5.43%、0.03%、0%、0%；而擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)、Myxococcota和Acidobacteriota經(jīng)陶瓷膜處理后均未檢測(cè)到。He等[30]采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)發(fā)酵酸菜中的微生物研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵酸菜的優(yōu)勢(shì)菌為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和變形菌門(mén)(Proteobacteria)，與本文結(jié)果相一致。

在屬水平上，原泡菜汁及經(jīng)過(guò)不同孔徑陶瓷膜處理泡菜汁細(xì)菌的分類情況見(jiàn)圖7中(a)，其中乳酸桿菌屬(Lactobacillus)在原泡菜汁、0.5 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁、0.2 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁、0.05 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁中占優(yōu)勢(shì)，豐度分別為48.25%、70.89%、80.24%、95.02%；芽孢桿菌屬(Bacillus)在各個(gè)樣品中豐度分別為21.3%、18.69%、13.25%、2.98%；短波單胞菌屬(Brevundimonas) 在各個(gè)樣品中豐度分別為10.9%、7.2%、4.8%、1%；Pseudomonas在各個(gè)樣品中豐度分別為2.56%、1.02%、0.5%、0.3%；Weissella在各個(gè)樣品中豐度分別為2.01%、1.32%、0.6%、0.2%；Brevundimonas和黏液乳桿菌屬(Limosilactobacillus)僅在原泡菜汁中檢測(cè)出。Peng等[31]通過(guò)傳統(tǒng)生物學(xué)培養(yǎng)方法和高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)發(fā)酵蔬菜中主要的優(yōu)勢(shì)菌群為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)。Pardali等[32]研究發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)酵的蘿卜泡菜發(fā)酵后期主要優(yōu)勢(shì)菌為植物乳桿菌，且有短乳桿菌被檢出，與本文結(jié)果相一致。

在門(mén)水平上，原泡菜汁及經(jīng)過(guò)不同孔徑陶瓷膜處理的泡菜汁真菌的分類情況見(jiàn)圖6中(b)，其中子囊菌門(mén)(Ascomycota)在原泡菜汁、0.5 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁、0.2 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁占優(yōu)勢(shì)，豐度分別為70.93%、76.9%、82.01%；擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)在各個(gè)樣品中分別占23.99%、20.1%、17.85%；毛霉門(mén)(Mucoromycota)在各個(gè)樣品中分別占3.69%、2.1%、0%。經(jīng)0.05 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁中未檢測(cè)出真菌。Chen等[33]研究泡菜發(fā)酵中有子囊菌門(mén)(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)等真菌的存在。

圖6 不同孔徑的陶瓷膜處理后泡菜汁中細(xì)菌(a)和真菌(b)在門(mén)水平群落組成 Fig.6 The compostion of bacterial (a) and fungal (b) community in pickle juice treated with ceramic membranes with different pore sizes at the phylum level

在屬水平上，原泡菜汁及經(jīng)過(guò)不同孔徑陶瓷膜處理的泡菜汁細(xì)菌真菌分類情況見(jiàn)圖7中(b)，畢赤酵母屬(Pichia)在原泡菜汁、0.5 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁、0.2 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁豐度分別為40.9%、31.5%、25.8%；鎖擲孢酵屬(Sporidioboluspararoseus)在各個(gè)樣品中占比分別為28.6%、39.9%、60.2%；擲孢酵母屬(Sporobolomycescarnicolor)在各個(gè)樣品中占比分別為26.8%、25.4%、12.7%，曲霉屬(Aspergillus)、Saccharomyces和Issatchenki僅在原泡菜汁中檢出。Guan等[34]對(duì)廣西酸筍和廣西泡菜中的微生物多樣性研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)真菌為酵母菌，與本文泡菜中的優(yōu)勢(shì)菌結(jié)果相一致。

圖7 不同孔徑的陶瓷膜處理后泡菜汁中細(xì)菌(a)和真菌(b)在屬水平群落組成 Fig.7 The compostion of bacterial (a) and fungal (b) community in pickle juice treated with ceramic membranes with different pore sizes at the genus level

采用高通量測(cè)序技術(shù)，經(jīng)過(guò)0.008 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁未檢測(cè)到微生物。經(jīng)過(guò)0.05 μm陶瓷膜處理后，泡菜汁中的細(xì)菌大部分被截留，從門(mén)水平上包括Actinobacteriota、Myxococcota、Gemmatimonadota、Chloroflexi、Bacteroidota和Acidobacteriota，從屬水平上包括Limosilactobacillus、Brevundimonas；真菌被截留，從門(mén)水平上包括子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)和毛霉門(mén)(Mucoromycota)，從屬水平上包括畢赤酵母屬(Pichia)、鎖擲孢酵屬(Sporidioboluspararoseus)、擲孢酵母屬(Sporobolomycescarnicolor)、曲霉屬(Aspergillus)、Saccharomyces和Issatchenki。

采用傳統(tǒng)微生物學(xué)培養(yǎng)方法，經(jīng)過(guò)0.008 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁，未能成功分離鑒定出微生物。經(jīng)過(guò)0.05 μm陶瓷膜處理后，泡菜汁中的細(xì)菌大部分被截留，包括蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、嬰兒芽孢桿菌(Bacillusinfantis)、蟬桿菌(Bacillusciccensis)、放線菌(Actinobacteriabacterium)、馬賽短芽孢桿菌(Brevibacillusmassiliensis)、橙色短波單胞菌(Brevundimonasaurantiaca)、堀越氏芽孢桿菌(Bacillushorikoshii)、Bacillusgottheilii、Brevundimonascaseigenomic、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillusfirmus)及絲狀芽孢桿菌(Bacillusfilamentosus)；真菌分別是謝瓦曲霉(Aspergilluschevalieri)、卡尼克酵母菌(Sporobolomycescarnicolor)、鎖擲孢酵母菌(Sporidioboluspararoseus)和庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母菌(Pichiakudriavzevii)。

3 結(jié)論

通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合較真實(shí)、全面地分析不同孔徑陶瓷膜處理對(duì)泡菜汁中微生物截留的種類的差異性及菌相的變化。結(jié)果顯示：經(jīng)不同孔徑陶瓷膜處理后，泡菜汁中細(xì)菌和真菌的多樣性降低，膜孔徑越小微生物被截留的效果越好。泡菜汁中細(xì)菌和真菌群落組成差異性較大， 孔徑為0.008 μm 和0.05 μm的陶瓷膜對(duì)微生物有良好的截留作用。0.05 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁雖然有微生物檢出，但都是乳酸菌以及一些本身無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)污染且具有一定抑菌效果的細(xì)菌，而且0.05 μm陶瓷膜的膜通量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于0.008 μm陶瓷膜。綜上所述，可選擇0.05 μm 陶瓷膜應(yīng)用于泡菜汁的膜處理。