RCC2在DNA損傷應(yīng)答及腫瘤中的生物學(xué)功能研究進(jìn)展*

何春草， 周小豐， 張麗君， 于晶晶 ， 譚曉華， 楊 軍，3△

（1杭州師范大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，浙江 杭州 311121；2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院放療科，浙江 杭州 310009；3浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院浙江省子宮惡性腫瘤診治中心，浙江 杭州 310006）

RCC2（regulator of chromosome condensation 2），也被稱為TD-60（telophase disc protein of 60 kD），是一種高度保守的核蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)與RCC1 類似。RCC1 是Ras 相關(guān)核蛋白（Ras-related nuclear protein，Ran）的鳥嘌呤交換因子（guanine nucleotide exchange factor，GEF），對(duì)于細(xì)胞周期的正常進(jìn)行非常重要［1］。類似的，RCC2 也主要參與細(xì)胞周期的調(diào)控；而另一方面，RCC2 還可與整合素（integrin）、皮質(zhì)肌動(dòng)蛋白（cortactin）等發(fā)生相互作用來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移和細(xì)胞分裂［2］。隨著研究的進(jìn)展，RCC2 的一些新功能也逐漸被發(fā)現(xiàn)。例如，我們發(fā)現(xiàn)干擾RCC2的表達(dá)可以增強(qiáng)化療藥物順鉑（cisplatin）對(duì)細(xì)胞的DNA 損傷程度，表明RCC2 可能參與了細(xì)胞的DNA 損傷應(yīng)答（DNA damage response，DDR）［3］。近年來(lái)，RCC2 與腫瘤的關(guān)系也逐漸被發(fā)現(xiàn)。本文將圍繞RCC2 的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能，尤其是在DDR 及腫瘤中的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 RCC2的發(fā)現(xiàn)及其分子結(jié)構(gòu)

1991 年，Andreassen 等［4］發(fā)現(xiàn)了末期盤（telophase disc，TD）這個(gè)在細(xì)胞胞質(zhì)分裂（cytokinesis）時(shí)將兩個(gè)子細(xì)胞分開的有絲分裂細(xì)胞器（mitotic organelle），其核心是一個(gè)可被人自身免疫血清識(shí)別的有絲分裂特異性抗原，因其分子量約為60 kD，所以稱為TD-60。RCC2 的編碼基因長(zhǎng)度為4 040 bp，由13個(gè)外顯子組成，位于1 號(hào)染色體的短臂上（1p36.1 3）［5］。該基因編碼一個(gè)含有522 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)（圖1A），其N 端含有一個(gè)保守的核定位信號(hào)（nuclear localization signal，NLS），隨后從外顯子 3 的3’端到外顯子 13 的 5’端是一個(gè) RLD（RCC1-like domain），含有7 個(gè)RCC1 重復(fù)序列（repeats），每個(gè)重復(fù)序列中又各含1 個(gè) RCC1-2 基序（motif），因此，該蛋白被稱為RCC2，其三維結(jié)構(gòu)類似于RCC1，為七葉螺旋槳結(jié)構(gòu)［5］（圖 1B）。對(duì) RCC2 結(jié)構(gòu)的深入分析還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)對(duì)RCC2 在有絲分裂過(guò)程中定位及功能發(fā)揮具有重要作用的有絲分裂磷酸化基序（mitotic phosphorylation motif），其序列為｛PX［G/T/S］［L/M］S（P）P 或 WGLS（P）P｝［6］。此外，還發(fā)現(xiàn)RCC2結(jié)構(gòu)中存在中期染色體折疊所必需的氧化的半胱氨酸［7］。

Figure 1. RCC2 protein structure. A：motifs of RCC2（modified from reference［5］；NLS：nuclear localization signal，26 to 36 aa；RLD：RCC1-like domain，121 to 507 aa）；B：three-dimensional structure of RCC2 protein（source：https：//www. rcsb.org）.圖1 RCC2蛋白結(jié)構(gòu)圖

2 RCC2與DDR

最早的RCC2 參與DDR 的間接證據(jù)來(lái)自Zhou等［8］的一個(gè)蛋白組學(xué)研究，即在鑒定經(jīng)γ射線處理的HeLa S3 細(xì)胞中Ku 復(fù)合體時(shí)發(fā)現(xiàn)有RCC2 的存在。Ku 作為修復(fù) DNA 雙鏈斷裂（double strand breaks，DSB）的非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）機(jī)制中的重要成分，RCC2 與它的相互作用提示其可能參與DDR。Lin 等［9］則發(fā)現(xiàn)香煙煙霧提取物（cigarette smoke extract，CSE）處理可引起DNA 損傷，且一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）LCPAT1（lung cancer progression-associated transcript 1）參與了此過(guò)程，而RCC2通過(guò)與LCPAT1的結(jié)合介導(dǎo)了其作用［10］。

圍繞這一問(wèn)題我們也展開了相關(guān)研究。我們發(fā)現(xiàn)順鉑可引起細(xì)胞內(nèi)許多microRNA 的表達(dá)改變，包括miR-191。鑒于miR-191 在多種腫瘤中發(fā)生改變，我們對(duì)其在DDR 中的作用和機(jī)制進(jìn)行了探究。結(jié)果表明，miR-191高表達(dá)使細(xì)胞對(duì)順鉑的細(xì)胞毒性更敏感，DNA 損傷程度更高，且細(xì)胞出現(xiàn)G2/M 周期阻滯。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，RCC2是miR-191的靶基因，下調(diào)RCC2 的表達(dá)同樣可以觀察到更大程度的DNA 損傷［3］。我們還進(jìn)行了RCC2 互作蛋白的鑒定，也同樣發(fā)現(xiàn)了Ku 蛋白，表明二者存在相互作用；但是體外純化蛋白實(shí)驗(yàn)未能發(fā)現(xiàn)二者結(jié)合，分子結(jié)構(gòu)及生物信息學(xué)分析提示二者間不存在相互作用的結(jié)構(gòu)域，更可能是通過(guò)其它蛋白的介導(dǎo)作為一個(gè)大的蛋白復(fù)合物的成分（未發(fā)表結(jié)果）。

3 RCC2與腫瘤

3.1 肺癌 Feng 等［11］在對(duì)非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）與正常組織的lncRNA 差異表達(dá)分析中發(fā)現(xiàn)LOC146680和ENST00000439577高表達(dá)，并分別與KPNA2 和RCC2 的表達(dá)正相關(guān)，且這種高表達(dá)與患者的不良生存有關(guān)。他們使用siRNA下調(diào)了ENST0000439577 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NSCLC 細(xì)胞系中RCC2 的表達(dá)同時(shí)降低，這可能通過(guò)抑制RalA的活性，達(dá)到抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的目的。因此，通過(guò)RCC2 影響Ral 信號(hào)通路的lncRNA ENST0000439577可能是肺癌治療的潛在治療靶點(diǎn)。

在肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）中RCC2的表達(dá)也顯著升高，并與腫瘤的分期、淋巴轉(zhuǎn)移等相關(guān)，且是獨(dú)立的不良預(yù)后因素。深入分析發(fā)現(xiàn)RCC2通過(guò)激活JNK 促進(jìn)了細(xì)胞的遷移、侵襲，誘導(dǎo)上皮-間 充 質(zhì) 轉(zhuǎn) 化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），以及基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和MMP-9的表達(dá)［12］。

通過(guò)對(duì)比小細(xì)胞肺癌（small cell lung carcinoma，SCLC）和肺類癌（pulmonary carcinoid tumors）蛋白表達(dá)差異也發(fā)現(xiàn)RCC2 特異性地在SCLC 中表達(dá)，且 RCC2 的活化與 p53 表達(dá)相關(guān)［13］。此外，Wu 等［14］發(fā)現(xiàn)RCC2 高表達(dá)通過(guò)阻斷Rac1 信號(hào)抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，提示肺癌中RCC2高表達(dá)可能影響化療的效果，因此，p53/RCC2/Rac1 信號(hào)通路可能成為肺癌治療的潛在有效靶點(diǎn)。

3.2 結(jié)直腸癌 不同于肺癌，RCC2 在結(jié)直腸癌中（colorectal cancer，CRC）多呈現(xiàn)為低表達(dá)。Bruun等［15］發(fā)現(xiàn) RCC2 的 5＇-UTR 的一個(gè)突變導(dǎo)致蛋白表達(dá)水平降低，并與不良預(yù)后有關(guān)。類似的，低表達(dá)的RCC2 水平是CRC 更差的5 年不復(fù)發(fā)存活率的獨(dú)立指標(biāo)，并可作為聯(lián)合化療效果的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物［16］。研究還發(fā)現(xiàn)p53 可結(jié)合在RCC2基因啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)回文基序（palindromic motif）調(diào)控其表達(dá)；RCC2 蛋白進(jìn)而通過(guò)其RLD結(jié)構(gòu)中的一個(gè)β發(fā)夾結(jié)構(gòu)與Rac1結(jié)合并使其失活。p53 或RCC2 的缺失導(dǎo)致Rac1 的活化，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移［17］。這與肺癌機(jī)制類似，提示p53/RCC2/Rac1 信號(hào)通路也是結(jié)直腸癌治療的潛在靶點(diǎn)。

3.3 胃癌 研究發(fā)現(xiàn)miR-29c在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，而RCC2在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步分析表明 RCC2 是 miR-29c 的靶點(diǎn) ，miR-29c 可與 RCC2 的3＇-UTR 中的靶序列結(jié)合，從而抑制RCC2 的表達(dá)，RCC2 表達(dá)降低使得細(xì)胞活力下降，這提示miR-29c可能具有抑制腫瘤的功能［18］。Wang 等［19］也同樣發(fā)現(xiàn)RCC2 在胃癌中高表達(dá)，而敲除RCC2 后細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力都受到影響，其機(jī)制可能與RCC2對(duì)RalA和JNK通路的影響有關(guān)。

3.4 肝癌 在一個(gè)探討氯化兩面針堿（nitidine chloride）治療肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）分子機(jī)制的研究中，生物信息學(xué)分析結(jié)果共鑒定出包括RCC2在內(nèi)的18 個(gè)關(guān)鍵基因，且與患者的臨床結(jié)局有關(guān)［20］。Chen 等［21］也發(fā)現(xiàn) RCC2 在 HCC 患者樣本中高表達(dá)，并與HCC 病理分級(jí)有關(guān)；沉默RCC2的表達(dá)可抑制HCC 細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，并增加順鉑處理后的細(xì)胞凋亡率，其可能的機(jī)制是通過(guò)Akt 和Bcl-2 通路下調(diào)細(xì)胞存活相關(guān)蛋白的表達(dá)。

3.5 乳腺癌 RCC2 在乳腺癌中也表現(xiàn)為高表達(dá)，也與患者的不良預(yù)后有關(guān)。RCC2 的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，并通過(guò)激活Wnt 通路誘導(dǎo)了 EMT［22］。在對(duì) TCGA（The Cancer Genome Atlas）和GEO（Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫(kù)的分析中發(fā)現(xiàn)，一個(gè)包含RCC2在內(nèi)的6 基因組合與乳腺癌的進(jìn)展有關(guān)，可以作為獨(dú)立的預(yù)后因子［23］。Wang 等［24］則發(fā)現(xiàn)在雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽(yáng)性的乳腺癌組織中RCC2表達(dá)升高，對(duì)其分子機(jī)制的研究揭示雌激素可誘導(dǎo)RCC2 的表達(dá)，進(jìn)而啟動(dòng)IGF1、TWIST1 及IL-6 的表達(dá)，刺激細(xì)胞遷移并抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)了ER+乳腺癌的發(fā)生。

3.6 卵巢癌 Buranjiang 等［25］在多個(gè)卵巢癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)miR-331-3p 的低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-331-3p 則顯著抑制了細(xì)胞的增殖和遷移能力；分析發(fā)現(xiàn)RCC2是其靶點(diǎn)，過(guò)表達(dá)RCC2可恢復(fù)卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。在比較順鉑敏感和耐藥的卵巢癌患者差異表達(dá)基因時(shí)也發(fā)現(xiàn)RCC2在耐藥患者中高表達(dá)，同時(shí)還存在RalA 及RalA 結(jié)合蛋白1（RalA-binding protein 1，RalBP1）的高表達(dá)；RCC2 通過(guò)與RalA 結(jié)合激活了RalBP1，從而正向促進(jìn)了順鉑抗性的卵巢癌細(xì)胞的增殖及遷移能力［26］。

3.7 其它腫瘤 RCC2 與其它腫瘤的相關(guān)性也有報(bào)道，比如皮膚基底細(xì)胞癌（cutaneous basal cell carcinoma）［27］、黑色素瘤（melanoma）［28］、食管癌（esophageal cancer）［29］、多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma）［30］、腦膠質(zhì)瘤（glioblastoma）［31］、胰腺癌［32］等，但基本只有單個(gè)研究涉及，因此還需更多的證據(jù)確認(rèn)RCC2與這些腫瘤的關(guān)系。

RCC2 在不同腫瘤中表達(dá)及作用機(jī)制的總結(jié)見表1。

表1 RCC2在不同腫瘤中的表達(dá)及其可能作用機(jī)制Table 1. Expression and mechanism of RCC2 in different types of cancer

4 RCC2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的可能機(jī)制

4.1 細(xì)胞周期調(diào)控 腫瘤細(xì)胞最重要的特性之一就是其旺盛的分裂增生能力，這就意味著細(xì)胞周期的快速進(jìn)展。而RCC2 在細(xì)胞周期調(diào)控中的重要作用為腫瘤細(xì)胞這一特性提供了支撐。

4.1.1 推動(dòng)有絲分裂的進(jìn)展 最初的研究認(rèn)為RCC2 與胞質(zhì)分裂密切相關(guān)：RCC2 在細(xì)胞內(nèi)的分布特征與細(xì)胞核中的一組染色體乘客蛋白質(zhì)（chromosome passenger proteins）相同，這些蛋白質(zhì)構(gòu)成一個(gè)染色體乘客復(fù)合體（chromosomal passenger complex，CPC），在有絲分裂早期位于染色體中，后期轉(zhuǎn)移到紡錘體上［4］，對(duì)促進(jìn)染色體分離和細(xì)胞分裂有重要作用［33］。早期研究發(fā)現(xiàn)RCC2與一個(gè)CPC蛋白，即著絲粒中心蛋白（inner centromere protein，INCENP）從G2 期到有絲分裂一直共定位，相互作用影響胞質(zhì)分裂［34］。進(jìn)一步研究表明 RCC2 對(duì)于 CPC 其他成分如survivin 和Aurora B 激酶等的招募也是必需的，RCC2的缺失將使紡錘體無(wú)法正常組裝，有絲分裂細(xì)胞將停滯在前中期［5］。而作為CPC 的催化亞單位，Aurora B 的活性同樣受到RCC2 的調(diào)控，且RCC2 對(duì)另一個(gè)著絲粒激酶haspin 的活化也是必需的［35］。值得注意的是，盡管結(jié)構(gòu)上RCC2 有GEF 的功能，但該功能在有絲分裂中的作用一直未被證明，直到2015 年P(guān)apini 等［33］才發(fā)現(xiàn) RCC2 作為 RalA 的 GEF，與 RalA 共同調(diào)控著絲粒和微管的相互作用。而已有的研究證據(jù)表明在肺癌［11］、胃癌［19］、卵巢癌［26］中 RCC2 的確是通過(guò)對(duì)RalA 的作用而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的分裂與增殖（圖2）。

此外，驅(qū)動(dòng)蛋白（kinesin）對(duì)于決定紡錘體的形狀、大小及極性發(fā)揮著重要作用，因此它們的活性也受到嚴(yán)格地調(diào)控，在此過(guò)程中ICIS（inner centromere Kin-I stimulator）蛋白作為骨架與Aurora B、INCENP和RCC2 結(jié)合協(xié)同調(diào)控驅(qū)動(dòng)蛋白13 家族微管去聚合酶（kinesin-13 family microtubule depolymerase）Kif2a的活性。

4.1.2 推動(dòng)細(xì)胞間期的進(jìn)展 盡管最初的研究表明RCC2對(duì)于有絲分裂至關(guān)重要，更深入的分析表明RCC2 對(duì)間期的進(jìn)展也是必需的：干擾RCC2表達(dá)后細(xì)胞可被阻滯在G1/S期或G2/M期［36］。因此，RCC2可能有截然不同的分子機(jī)制參與細(xì)胞周期調(diào)控：在有絲分裂期調(diào)控紡錘體的正確組裝并激活其他有絲分裂蛋白，在間期則通過(guò)與整合素α5β1 及cortactin 等相關(guān)蛋白的互作驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)展［36-37］（圖2）。

4.2 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移 腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是大多數(shù)癌癥死亡的相關(guān)原因，RCC2控制細(xì)胞遷移的能力與此息息相關(guān)。正常情況下，整合素與其細(xì)胞外基質(zhì)配體的結(jié)合對(duì)于維持細(xì)胞的形態(tài)、存活、分化，尤其是運(yùn)動(dòng)至關(guān)重要。細(xì)胞在沿著纖維狀的細(xì)胞外基質(zhì)向前運(yùn)動(dòng)時(shí)需要有凸出信號(hào)（protrusive signal）Rac1 的定位，細(xì)胞凸出頂端與纖連蛋白（fibornectin）的接觸激活Rac1，而要保持線性運(yùn)動(dòng)就必須在非軸向位置抑制Rac1的活性，并將Rac1從非凸出細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到前端。研究發(fā)現(xiàn)整合素α5β1 偶聯(lián)復(fù)合物中有RCC2 蛋白的存在，且在整合素α5β1-纖連蛋白相互作用信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用：RCC2的敲除促進(jìn)了纖連蛋白誘導(dǎo)的 Rac1 和 Arf6（adenosine 5＇-diphosphate ribosylation factor 6）的活化，使得細(xì)胞喪失了沿纖連蛋白纖維持續(xù)移動(dòng)的能力，使細(xì)胞成為攤開的狀態(tài)［38-39］。深入研究揭示在此過(guò)程中，coronin-1C 蛋白介導(dǎo)了非活化的Rac1 從非凸出膜釋放并重分布到凸出端，并以纖連蛋白依賴的方式激活Rac1；而RCC2 則在凸出端以外通過(guò)與Rac1 的結(jié)合抑制其激活，從而防止了非軸向的凸出形成［40-41］。此外，在內(nèi)皮細(xì)胞沿微管蛋白遷移過(guò)程中RCC2 也存在于β3 整合素復(fù)合物中，參與調(diào)控活化的Rac1定位［42］。

如前所述，在多種腫瘤中RCC2的異常表達(dá)影響了Rac1 的活化，改變了細(xì)胞的遷移能力，在此過(guò)程中伴隨的MMP 等細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)成分的表達(dá)改變也可能促進(jìn)了細(xì)胞的EMT 過(guò)程，最終推動(dòng)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲［14，22］（圖2）。

Figure 2. Possible mechanisms of RCC2 function in tumors. RCC2 regulates the cell cycle or metastasis of tumor cells by interacting with various molecules or affecting signaling pathways involved in tumorigenesis.圖2 RCC2在腫瘤中的可能作用機(jī)制

5 總結(jié)與展望

如上所述，RCC2 在細(xì)胞的多種重要生理功能中發(fā)揮作用，尤其在腫瘤中的作用更值得人們關(guān)注。盡管有研究發(fā)現(xiàn)RCC2 的作用與JNK、Akt 等信號(hào)通路激活有關(guān)［19，43］，但根據(jù)其它眾多文獻(xiàn)的觀察報(bào)道，我們認(rèn)為這些現(xiàn)象可能并非RCC2直接作用的結(jié)果，RCC2 更有可能是通過(guò)與其它蛋白間的相互作用發(fā)揮其生物學(xué)功能，即蛋白-蛋白相互作用才是RCC2發(fā)揮其生物學(xué)功能的核心機(jī)制。比如，在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中，RCC2 與 INCENP、Aurora B、survivin 等結(jié)合構(gòu)成CPC 復(fù)合物，并進(jìn)而調(diào)控Aurora B 的激活［2］。在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)/遷移的調(diào)節(jié)過(guò)程中，RCC2也需要與整合素、coronin-1C 等相互作用［39-40］。但值得注意的是，RCC2 多數(shù)情況下是與多個(gè)蛋白相互作用，可能還有其它成分的參與，比如在對(duì)微管去聚合酶Kif2a活性的調(diào)控中，RCC2、Aurora B、INCENP與ICIS蛋白的N 端結(jié)合，而ICIS 蛋白中心區(qū)域則與另一個(gè)去聚合酶——有絲分裂著絲粒相關(guān)驅(qū)動(dòng)蛋白（mitotic centromere-associated kinesin，MCAK）、Kif2a 及微管結(jié)合，形成一個(gè)大的復(fù)合物［44］。因此，這可以解釋為什么我們細(xì)胞免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)RCC2與Ku 蛋白的互作，而體外純化的RCC2 和Ku 兩個(gè)蛋白則不能結(jié)合，即體內(nèi)RCC2與Ku并不直接結(jié)合，更可能是通過(guò)分別與其它蛋白甚至DNA 鏈的相互作用成為一個(gè)大的復(fù)合物中的成員。圍繞這一問(wèn)題，我們正開展相關(guān)的研究工作，以期鑒定該復(fù)合物。

同時(shí)，正是由于RCC2調(diào)控細(xì)胞周期及細(xì)胞遷移這些重要的生物學(xué)功能，它與多種腫瘤的關(guān)系也就不難理解。但當(dāng)前的研究還存在諸多的問(wèn)題，比如，首先是相關(guān)的研究數(shù)量、質(zhì)量還有待提高，即證據(jù)的可靠性還需強(qiáng)化。其次，目前為止，RCC2 在大多數(shù)腫瘤中的報(bào)道為高表達(dá)，但結(jié)直腸癌中為低表達(dá)，這其中的差異需深入探討。最后，在各種腫瘤中RCC2的作用、分子機(jī)制還不明確，這也是今后研究的一個(gè)重要內(nèi)容。只有對(duì)這些問(wèn)題有了明確的答案后，RCC2 才能真正成為腫瘤的生物標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)。