地塞米松聯(lián)合歸脾湯通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化平衡緩解免疫性血小板減少癥*

鄭兵榮， 胡蓮波， 楊 陽(yáng)， 陳春梅， 成 志， 胡美薇

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液科，浙江 杭州 310005）

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是一種自身免疫異常導(dǎo)致的血液系疾病，以皮膚、黏膜出血和外周血小板減少為主要表現(xiàn)，部分患者可出現(xiàn)顱內(nèi)出血，危及生命［1-3］。除了出血癥狀之外，疲勞乏力是ITP 較為突出的臨床表現(xiàn)之一［4-6］。目前，臨床上常用的治療方案包括糖皮質(zhì)激素、促血小板生成素及其他免疫抑制劑等，但I(xiàn)TP 具有易反復(fù)發(fā)作、治療難度大、治療效果不佳及長(zhǎng)期服用西藥副作用不能耐受等特征［7-9］。因此，近年來(lái)傳統(tǒng)中藥在治療ITP 方面大力發(fā)展，臨床療效顯著，且副作用?。?0-11］。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為ITP 主要分氣虛型、陰虛型和火熱妄型。歸脾湯（Guipi decoction，GPD）具有益氣生血攝血、養(yǎng)血安神等功效，從中醫(yī)理論上可減輕氣虛型ITP 的癥狀［12-14］。多年來(lái)我科開展ITP的中醫(yī)治療，通過(guò)GPD 加減聯(lián)合激素或促血小板生成素治療氣虛型ITP 病人100 余例，療效肯定。本項(xiàng)工作擬探討GPD 可否通過(guò)調(diào)控核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2 極化，為GPD在臨床上防治氣虛型ITP提供參考資料。

材料和方法

1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

西醫(yī)ITP 診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考“成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國(guó)專家共識(shí)（2016 年版）”。中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照國(guó)家中醫(yī)藥管理局2010 年中醫(yī)血液病重點(diǎn)?？谱像安。庖咝匝“鍦p少癥）。中醫(yī)診療方案中醫(yī)證候辨證為氣虛不攝型ITP：主癥2項(xiàng)+次癥2 項(xiàng)+舌脈。（1）主癥：紫斑，色紫暗淡，反復(fù)發(fā)作，多呈散在性，勞則加重。（2）次癥：頭暈疲乏、面色少華；心悸氣短、四肢倦怠、胃納欠佳；鼻衄、齒衄。（3）舌象：舌淡，苔白。（4）脈象：脈細(xì)弱。

2 納入標(biāo)準(zhǔn)

（1）血小板＜30×109/L；（2）至少2 次血常規(guī)檢查示血小板計(jì)數(shù)減少，血細(xì)胞形態(tài)無(wú)異常；（3）脾臟不增大；（4）骨髓檢查：巨核細(xì)胞數(shù)增多或正常、有成熟障礙；（5）排除其他繼發(fā)性血小板減少癥；（6）主癥2項(xiàng)+次癥2 項(xiàng)+舌脈；（7）治療前至少兩周未接受過(guò)大劑量糖皮質(zhì)激素沖擊治療的患者；（8）知情同意自愿加入本項(xiàng)目研究者。

3 排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）其他疾病繼發(fā)的血小板減少需排除出研究范圍；（2）有重要臟器嚴(yán)重?fù)p傷者；（3）精神性疾病或妊娠及哺乳期婦女；（4）嚴(yán)重出血如顱內(nèi)出血者；（5）過(guò)敏體質(zhì)或已知對(duì)受試藥物（單味）過(guò)敏者；（6）不合作者，如精神病患者及依從性差且不愿服用中藥者。

4 剔除標(biāo)準(zhǔn)

（1）治療期間出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)的病人；（2）治療期間發(fā)現(xiàn)其他血液系統(tǒng)疾病的病人；（3）治療期間出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥危及生命而必須終止的病人；（4）病人依從性差，不按醫(yī)囑用藥，臨床療效無(wú)法評(píng)估者；（5）各種原因致使臨床資料不全，無(wú)法統(tǒng)計(jì)者。

5 一般材料

經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（No. 2020-KL-105-01），所有受檢者均知情同意。選擇2018 年9 月至2020 年6 月在浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液科就診的氣虛型原發(fā)性ITP 患者64例，按照隨機(jī)分組：32 例地塞米松（dexamethasone，Dex）治療組和32例Dex+GPD 聯(lián)合治療組；另以同期健康體檢者30 例為對(duì)照組。排除血小板數(shù)量異常及功能異常等疾病，各組對(duì)象在年齡和性別構(gòu)成上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

6 藥物治療

Dex組：根據(jù)“成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國(guó)專家共識(shí)（2016年版）”一線治療方案，使用Dex 磷酸鈉注射液（由天津金耀集團(tuán)湖北天藥藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格5 mg∶1 mL），40 mg/d，連用4 d。GPD 聯(lián)合西醫(yī)治療：在Dex 治療基礎(chǔ)上給予 GPD 加減治療：黃芪 30 g，白術(shù)15 g，黨參12 g，當(dāng)歸12 g，炙甘草12 g，遠(yuǎn)志10 g，茯神12 g，酸棗仁9 g，廣木香9 g，龍眼肉9 g，生姜3 g，大棗10 g（中藥材均來(lái)源于本院藥房）。中藥方劑囑患者日一劑，水煎服，每次200 mL，每天2 次；或選用中藥顆粒劑，日一劑，每次沸水沖至150 mL，每天2 次。2 周為1 療程，連續(xù)服用1到2個(gè)療程。

7 主要試劑及儀器

人白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）ELISA試劑盒（1111002）、人IL-12 ELISA 試劑盒（1111202）和人腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒（1117202）均購(gòu)自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；人干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）ELISA 試劑盒（ml057425）購(gòu)自上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS；L2654）購(gòu)自Sigma；人重組IL-4（P05112）購(gòu)自上海近岸生物科技有限公司；人重組 IFN-γ（AF-300-02）購(gòu)自 PeproTech；Ficoll?Paque Plus 淋巴細(xì)胞分離液（17-1440-02）購(gòu)自GE Healthcare；CD14+細(xì)胞分選磁珠（130-118-906）購(gòu)自 Miltenyi Biotec；佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA；P6741）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；PE 標(biāo)記的 CD206 抗體（321106）和 PE 標(biāo)記的CD80 抗體（375410）均購(gòu)自 BioLegend。吲哚胺 2，3雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）抗體（8630）、p65 抗體（8242）、p-p65 抗體抗體（3033）和GAPDH 抗體（5174）均購(gòu)自 Cell Signaling Technology。

XE-5000 全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀及原裝配套試劑（Sysmex）；冷凍臺(tái)式離心機(jī)（Thermo）；Western blot 全套系統(tǒng)（Bio-Rad）；FACSCanto II流式細(xì)胞儀（BD）；倒置顯微鏡（Leica）。

8 指標(biāo)觀察及檢測(cè)方法

8.1 血標(biāo)本的采集及處理 采集所有ITP患者和健康者靜脈血10 mL 于真空采血管中。應(yīng)用Sysmex XE-5000全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)血常規(guī)，記錄血小板計(jì)數(shù)；300×g離心10min，收集各組血清；使用Ficoll分離液400×g離心30 min，吸取中間外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）層。

8.2 CD14+細(xì)胞分選及誘導(dǎo) PBS 清洗PBMC，4 ℃進(jìn)行CD14 磁珠旋轉(zhuǎn)孵育15 min，磁力架分選后洗脫的即為CD14+單核細(xì)胞。加入PMA 誘導(dǎo)為M0 巨噬細(xì)胞，并分別用 LPS+IFN-γ 或 IL-4 誘導(dǎo)為 M1 和 M2型巨噬細(xì)胞。

8.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 取誘導(dǎo)后的各組細(xì)胞置于流式管內(nèi)。IL-4 誘導(dǎo)組細(xì)胞用PE 標(biāo)記的CD206 抗體孵育，LPS+IFN-γ誘導(dǎo)組細(xì)胞用PE標(biāo)記的CD80抗體孵育，用BD FACSCanto II 流式細(xì)胞儀檢測(cè)M1 和M2型巨噬細(xì)胞指標(biāo)，用FlowJo軟件整理數(shù)據(jù)。

8.4 ELISA 檢測(cè) 收集各組血清標(biāo)本，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行TNF-α、IFN-γ 和 5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）的檢測(cè)；收集單核細(xì)胞誘導(dǎo)后的各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行IL-10和IL-12的檢測(cè)。

8.5 Western blot 檢測(cè) 各處理組細(xì)胞，加入RIPA裂解液，靜置、離心、取上清，以BCA 法測(cè)蛋白濃度，加上樣緩沖液，煮沸5 min變性后行SDS-PAGE（濃縮膠層用80 V，20 min；分離膠層用120 V，1 h）；電泳后300 mA 恒流轉(zhuǎn)至PVDF 膜，室溫脫脂奶粉封閉2 h，洗膜3 次，加入Ⅰ抗（目的蛋白按1∶1 000 稀釋，GAPDH 按1∶5 000 稀釋）4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，洗膜3次，加Ⅱ抗（按1∶5 000 稀釋）孵育1 h，洗膜3 次，ECL化學(xué)發(fā)光后暗室膠片顯影。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用GraphPad Prism 7 軟件作圖。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同治療方案對(duì)ITP患者血小板計(jì)數(shù)的影響

與初診ITP組比較，Dex治療組和Dex+GPD 聯(lián)合治療組的血小板計(jì)數(shù)均顯著升高（P＜0.05）；與Dex治療組比較，Dex+GPD 聯(lián)合治療組的血小板計(jì)數(shù)亦顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

Figure 1. The effect of dexamethasone（Dex）and Guipi decoction（GPD）combined with Dex on platelet（PLT）count in the blood of immune thrombocytopenia（ITP）patients. Mean±SD.*P＜0.05 vs ITP group；#P＜0.05 vs Dex group.圖1 各組血小板計(jì)數(shù)結(jié)果

2 不同治療方案對(duì)ITP 患者血清中各細(xì)胞因子表達(dá)的影響

與初診ITP組比較，Dex治療組和Dex+GPD 聯(lián)合治療組血清5-HT 水平均顯著升高（P＜0.05），TNF-α和IFN-γ水平均顯著降低（P＜0.05）；與Dex治療組比較，Dex+GPD 聯(lián)合治療組血清5-HT 水平均顯著升高（P＜0.05），TNF-α 和 IFN-γ 水平均顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

3 不同治療方案對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響

Figure 2. The effects of dexamethasone（Dex）and Guipi decoction（GPD）combined with Dex on serum cytokine levels in immune thrombocytopenia（ITP）patients. A：serum tumor necrosis factor-α（TNF-α）concentration；B：serum interferon-γ（IFN-γ）concentration；C：serum 5-hydroxytryptamine（5-HT）concentration. Mean±SD.*P＜0.05 vs ITP group；#P＜0.05 vs Dex group.圖2 各組血清中細(xì)胞因子水平的比較

與初診ITP組比較，Dex治療組和Dex+GPD 聯(lián)合治療組巨噬細(xì)胞的CD206 表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），CD80 表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與Dex治療組比較，Dex+GPD 聯(lián)合治療組巨噬細(xì)胞的CD206 表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），CD80 表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖3A、B。與初診ITP組比較，Dex 治療組和Dex+GPD 聯(lián)合治療組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-10 濃度均顯著升高（P＜0.05），IL-12 濃度均顯著降低（P＜0.05）；與 Dex 治療組比較，Dex+GPD 聯(lián)合治療組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-10 濃度均顯著升高（P＜0.05），IL-12 濃度均顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖3C、D。

4 各組p65和IDO蛋白表達(dá)及p-p65水平的比較

與初診ITP組比較，Dex治療組和Dex+GPD 聯(lián)合治療組巨噬細(xì)胞的IDO 和p-p65 蛋白水平均顯著降低（P＜0.05）；與Dex 治療組比較，Dex+GPD 聯(lián)合治療組巨噬細(xì)胞的IDO和p-p65蛋白水平均顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

討 論

新診斷ITP的治療目標(biāo)是獲得更好的反應(yīng)、長(zhǎng)期維持緩解并最大限度地減少出血。此外，必須權(quán)衡治療的益處與其潛在風(fēng)險(xiǎn)。多年來(lái)，美國(guó)血液學(xué)會(huì)的指南一直建議將較長(zhǎng)療程的皮質(zhì)類固醇作為一線標(biāo)準(zhǔn)治療。與Dex 單藥治療相比，利妥昔單抗聯(lián)合治療可提高長(zhǎng)期持續(xù)緩解率，此外聯(lián)合治療在觀察早期顯示出更好的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）上調(diào)效果。然而，Dex 聯(lián)合利妥昔單抗仍不能降低成人ITP的復(fù)發(fā)率。因此，仍需新的治療策略來(lái)更好低改善ITP患者預(yù)后。

ITP根據(jù)其臨床表現(xiàn)屬中醫(yī)“紫斑”、“血證”、“衄血”、“發(fā)斑”等范疇，于2008 年的“常見(jiàn)血液病中醫(yī)病名專題討論會(huì)”上定名為“紫癜病”［16］?！吨嗅t(yī)內(nèi)科學(xué)》將血證（紫斑）分為三種證型：血熱妄行、陰虛火旺、氣不攝血。有研究認(rèn)為，純虛類證型出現(xiàn)頻次居于各類證型之首，虛損涉及氣、血、陰、陽(yáng)、肝、脾、腎，其中涉及到氣虛證型的頻次較高，提示ITP虛損是以氣虛為主［17］。其中疲勞乏力是氣虛型ITP 較為突出的表現(xiàn)之一。Dex 可在幾天到幾周后顯示出初步效果，然而皮質(zhì)類固醇相關(guān)并發(fā)癥限制了其長(zhǎng)期作用和療效。因此，越來(lái)越多的關(guān)于與二線藥物聯(lián)合方案的研究旨在提高療效并獲得長(zhǎng)期緩解。

本院血液科對(duì)ITP進(jìn)行了系統(tǒng)和深入的研究，根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論結(jié)合多年臨床實(shí)踐總結(jié)，針對(duì)氣虛型ITP 患者采用Dex+GPD 聯(lián)合治療。我們的結(jié)果顯示，Dex+GPD聯(lián)合治療具有顯著臨床效果。

Figure 3. The effects of dexamethasone（Dex）and Guipi decoction（GPD）combined with Dex on the polarization of the macrophages from immune thrombocytopenia（ITP）patients. A：the expression of CD206 in peripheral blood mononuclear cells detected by flow cytometry；B：the expression of CD80 in peripheral blood mononuclear cells detected by flow cytometry；C：the concentration of interleukin（IL）-10 in the cell culture supernatant detected by ELISA；D：the concentration of IL-12 in the cell culture supernatant detected by ELISA. MFI：mean fluorescence intensity. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs ITP group；#P＜0.05 vs Dex group.圖3 各組巨噬細(xì)胞極化的誘導(dǎo)

Figure 4. The effects of dexamethasone（Dex）and Guipi decoction（GPD）combined with Dex on the protein levels of nuclear factorκB（NF-κB）p65，p-p65 and indoleamine 2，3-dioxygenase（IDO）in the macrophages from immune thrombocytopenia（ITP）patients were detected by Western blot. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs ITP group；#P＜0.05 vs Dex group.圖4 各組p-p65和IDO的Western blot檢測(cè)結(jié)果

越來(lái)越多的證據(jù)表明，ITP 期間的主要問(wèn)題是效應(yīng)子和調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞之間的不平衡相互作用。例如Th1/Th2 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）和Treg 等的比例失調(diào)，導(dǎo)致免疫耐受性扭曲，免疫細(xì)胞清除血小板增加，以及血小板生成受損。雖然尚不完全清楚針對(duì)血小板抗原的自身抗體是如何產(chǎn)生的，但它們對(duì)血小板清除和產(chǎn)生的影響現(xiàn)已完全闡明。Treg和DC之間的相互作用在ITP中受抑制。由于ITP 患者中的Treg 水平較低，這導(dǎo)致DC 的免疫調(diào)節(jié)酶IDO1 表達(dá)降低，并且可以向其他免疫細(xì)胞呈遞（自身）抗原的成熟DC 水平增加。另一項(xiàng)研究進(jìn)一步表明了DC 在ITP 中誘導(dǎo)耐受的重要作用，其中靜脈輸注免疫球蛋白在鼠模型中通過(guò)DC 介導(dǎo)其作用。巨噬細(xì)胞在適應(yīng)性免疫和先天免疫中都發(fā)揮重要作用，它們?cè)陧憫?yīng)不同的環(huán)境刺激時(shí)會(huì)分化為經(jīng)典激活的M1型或交替激活的M2型［18-19］。巨噬細(xì)胞的M1極化具有促炎作用，而M2 極化具有免疫抑制作用［20］。M2 型巨噬細(xì)胞的免疫抑制作用是增加IL-10的產(chǎn)生和抑制IL-12 和TNF-α 的表達(dá)，進(jìn)而影響ITP的發(fā)展［21］。NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為炎癥反應(yīng)的重要靶點(diǎn)，已成為分子生物學(xué)中廣泛研究的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)。大多數(shù)研究報(bào)道，NF-κB 通路可能導(dǎo)致自身免疫性疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、免疫性血小板減少癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎癥性腸病和銀屑病等［22-23］。Ji 等［24］研究顯示，NF-κB 可以控制 T 細(xì)胞的發(fā)育，同時(shí)與ITP 中的T 細(xì)胞耐受相關(guān)。此外有文章報(bào)道了NF-κB 在巨噬細(xì)胞極化中的作用，為本研究提供了一些思路［25-26］。針對(duì)氣虛型ITP 患者采用Dex+GPD聯(lián)合治療，可調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化平衡。

本實(shí)驗(yàn)收集64 例初診氣虛型ITP 患者，隨機(jī)分成Dex組和Dex+GPD 聯(lián)合治療組。通過(guò)血細(xì)胞分析儀顯示兩組治療均能夠升高血小板數(shù)量，且Dex+GPD 聯(lián)合治療組效果更為顯著；同時(shí)Dex+GPD 聯(lián)合治療能更明顯降低血清TNF-α和IFN-γ水平，升高5-HT 水平。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞表型顯示，Dex+GPD 治療更易促進(jìn)M2型極化指標(biāo)CD206的上調(diào)，同時(shí)抑制M1 型極化指標(biāo)CD80 的下調(diào)，p-p65 蛋白水平下調(diào)。這些結(jié)果提示GPD 能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，有效恢復(fù)氣虛型ITP血小板的數(shù)量。

綜上所述，GPD 聯(lián)合西醫(yī)治療可以有效改善氣虛型ITP 的臨床進(jìn)程，其可能機(jī)制是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2 極化，增加IL-10和 5-HT 的產(chǎn)生，抑制 IL-12 及 TNF-α 的表達(dá)。本研究為臨床治療氣虛型ITP提供了參考資料。