線粒體分裂在肺動脈高壓肺血管重構(gòu)中的作用*

蔣智淵， 林葆菁， 黃榮杰

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣西 南寧 530021）

肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是一類以肺血管阻力進(jìn)行性升高為主要特征的疾病，其發(fā)病率約為每年2.0~7.6/100 萬，患病率則為11~26/100萬［1］。PH致殘、致死率高，預(yù)后差，是目前心血管疾病治療的難點(diǎn)之一［1］。目前治療PH 的藥物包括L型鈣離子通道拮抗劑、磷酸二酯酶抑制劑、可溶性鳥苷酸環(huán)化酶激動劑、內(nèi)皮素受體拮抗劑和前列環(huán)素激動劑。上述藥物主要針對肺血管收縮，而對于PH 發(fā)病中最重要的環(huán)節(jié)——肺血管重構(gòu)的作用有限［1-2］。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和平滑肌細(xì)胞增生是肺血管重構(gòu)的中心環(huán)節(jié)［2］。肺血管重構(gòu)發(fā)生的機(jī)制復(fù)雜，涉及骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體2 信號通路受損［3］、生長因子信號通路異常激活（如血管內(nèi)皮生長因子信號通路和血小板源生長因子信號通路）［4-5］、離子通道功能異常（如鉀通道亞家族 K 成員 3）［6］、炎癥損傷［7］、氧化應(yīng)激［7］、能量代謝異常［8］等。線粒體是機(jī)體最重要的產(chǎn)能場所，線粒體功能異常不僅引起肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞（pulmonary artery endothelial cells，PAECs）和肺動脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）能量代謝障礙，還可以產(chǎn)生大量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），增加氧化應(yīng)激和激活炎癥反應(yīng)，因此線粒體功能障礙與PH 的發(fā)生密切相關(guān)［9］。線粒體分裂是線粒體動力代謝的重要組成部分，它與線粒體融合一起，動態(tài)維持著線粒體正常功能。本文將從線粒體分裂在肺血管重構(gòu)中的作用進(jìn)行闡述，以期為PH的治療提供新的思路。

1 線粒體動力代謝的過程

線粒體是細(xì)胞內(nèi)最重要的供能場所，線粒體通過不斷融合與分裂維持代謝平衡。輕度能量缺乏時，線粒體融合成管狀網(wǎng)絡(luò)使產(chǎn)能最大化，滿足機(jī)體需要。而當(dāng)持續(xù)、嚴(yán)重的應(yīng)激時，線粒體發(fā)生分裂，產(chǎn)生大量線粒體碎片和ROS，對蛋白、脂質(zhì)和線粒體DNA造成損害，造成能量供應(yīng)障礙［10］。

線粒體分裂時首先通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接觸，發(fā)生收縮反應(yīng)，接著發(fā)動蛋白相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，DRP1）在DRP1 適配體——線粒體分裂因子（mitochondrial fission factor，MFF）、線粒體動力蛋白49 kD（mitochondrial dynamics protein of 49 kD，MiD49）和MiD51的協(xié)同下，被招募到線粒體外膜，促進(jìn)線粒體外膜的收縮和分裂，從而啟動線粒體分裂的過程。線粒體融合則由相鄰線粒體通過外膜和內(nèi)膜的融合完成。線粒體融合蛋白1（mitofusin 1，MFN1）和MFN2 介導(dǎo)線粒體外膜的融合，視神經(jīng)萎縮蛋白1（optic atrophy 1，OPA1）則介導(dǎo)線粒體內(nèi)膜的融合［11］。

2 線粒體分裂與PH

2.1 線粒體分裂與PASMCs PASMCs 增殖和凋亡抵抗導(dǎo)致肺動脈收縮和狹窄，是PH 發(fā)生的重要原因。Marsboom 等［12］發(fā)現(xiàn) PH 患者 PASMCs 線粒體分裂明顯增加，且細(xì)胞增殖明顯，通過抑制線粒體分裂可有效的減緩 PH 患者 PASMCs 增殖。Zhang 等［13］發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)的PH 大鼠模型中，肺動脈中層肥厚，且缺氧誘導(dǎo)的大鼠PASMCs 線粒體分裂明顯增加。Parra 等［14］也發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)人 PASMCs 線粒體分裂，促進(jìn)PASMCs 增殖，抑制線粒體分裂可以減少PASMCs增殖。在注射野百合堿構(gòu)建的PH大鼠模型中，同樣存在著線粒體過度分裂所致的PASMCs 增殖現(xiàn)象［15］。此外，Wang 等［16］發(fā)現(xiàn)慢性肺血栓性 PH患者PASMCs 線粒體過度分裂，出現(xiàn)去分化和明顯的增殖，抑制線粒體分裂可以阻止上述情況的發(fā)生。上述研究提示，線粒體過度分裂所致的PASMCs 增殖在PH的發(fā)生中起著重要作用。

2.2 線粒體分裂與PAECs PAECs 功能異常、遷移能力增加、異常增殖和凋亡抵抗是肺血管梗阻性病變形成的重要原因，與肺動脈壓力增高密切相關(guān)［17-18］。PH 患者PAECs 增殖和遷移能力明顯增強(qiáng)，提示PAECs 增殖和遷移異常在PH 的發(fā)生中起著重要作用［17］。Suresh 等［19］利用 SU5416/低氧構(gòu)建 PH 大鼠模型，發(fā)現(xiàn)PH大鼠PAECs增殖和遷移能力增強(qiáng)，并且伴有線粒體過度分裂。Shen等［20］發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)PAECs線粒體分裂增加，細(xì)胞增殖和遷移能力明顯增強(qiáng)，抑制線粒體分裂，可減弱PAECs增殖和遷移。而在缺氧誘導(dǎo)的小鼠模型中，線粒體分裂增加，與肺新生血管增多有關(guān)，抑制線粒體分裂可以減少肺血管新生，減輕右心室收縮壓和右室肥厚。上述研究表明，線粒體過度分裂促進(jìn)PAECs的增殖與遷移，導(dǎo)致PH的發(fā)生。

3 PH中線粒體分裂的調(diào)控靶點(diǎn)

3.1 DRP1 DRP1 在線粒體分裂的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，在各種病理因素刺激下，DRP1 由細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移至線粒體外膜，促進(jìn)線粒體外膜的收縮和分裂，從而啟動線粒體分裂的過程。已有大量的證據(jù)表明，下調(diào)DRP1 可以逆轉(zhuǎn)PH 的形成。Marsboom等［12］發(fā)現(xiàn) PH 患者 PASMCs 中 DRP1 表達(dá)明顯升高，第616 位點(diǎn)絲氨酸磷酸化比例增加，線粒體的分裂明顯增加，同時細(xì)胞的增殖顯著增加。采用DRP1抑制劑Mdivi-1 或RNA 干擾下調(diào)DRP1 表達(dá)，可以顯著減少PH 患者PASMCs 的增殖。他們同時利用慢性缺氧、二氯化鈷或野百合堿腹腔內(nèi)注射構(gòu)建大鼠PH模型。他們發(fā)現(xiàn)，上述PH 模型中PASMCs 線粒體分裂增加，均與缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）激活，通過 cyclin B1/CDK1 信號通路，上調(diào)DRP1 的表達(dá)和DRP1 第616 位點(diǎn)絲氨酸磷酸化比例有關(guān)，通過Mdivi-1 抑制DRP1 活性，可以減少上述動物模型PASMCs 增殖，改善活動能力和右心室功能。Zhang 等［13］發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)的 PH 大鼠模型中，ROS 和線粒體來源的ROS，通過上調(diào)DRP1，促進(jìn)線粒體分裂，從而導(dǎo)致PASMCs 增殖，PASMCs 凋亡減少。而通過下調(diào)DRP1表達(dá)，則可以減少缺氧誘導(dǎo)的PASMCs 增殖。Parra 等［14］的研究則提示，可以通過抑制DRP1 活性或負(fù)性突變抑制DRP1 的功能，減少線粒體分裂，減緩低氧誘導(dǎo)的PASMCs 增殖。Zhao等［21］也發(fā)現(xiàn)，慢性缺氧導(dǎo)致 PASMCs 線粒體分裂和細(xì)胞增殖，乙醛脫氫酶2 通過下調(diào)4-羥基壬烯醛/HIF-1/DRP1 信號通路，減少PASMCs 線粒體分裂和細(xì)胞增殖，從而減輕PH。Shen 等［20］的研究則提示，通過抑制DRP1還可以減少內(nèi)皮細(xì)胞線粒體分裂，降低PAECs 的增殖和遷移能力，從而減輕PH。此外，Dai等［22］發(fā)現(xiàn)，高氧誘導(dǎo)的支氣管肺發(fā)育不良新生大鼠模型，在進(jìn)入正常氧濃度環(huán)境后，肺動脈的阻力明顯增加，而抑制DRP1表達(dá)則可以改善這類大鼠的肺血管發(fā)育，降低肺動脈壓力。上述研究表明，通過抑制DRP1，減少線粒體分裂，可以抑制PASMCs 和PAECs的異常增殖，有望成為PH治療的潛在靶點(diǎn)。

3.2 DRP1 適配體 DRP1 由細(xì)胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)移至線粒體外膜的過程需要其適配體的協(xié)同，這些適配體包括線粒體分裂蛋白1（fission 1，F(xiàn)IS1）、MFF、MiD49和MiD51。FIS1 目前認(rèn)為不是線粒體分裂所必需的成分［11，23］。近期，有研究對 DRP1 適配體在 PH 發(fā)生中的作用進(jìn)行了探索。研究顯示，無論是在PH 患者，還是PH 大鼠模型的肺動脈內(nèi)膜、中層MiD49 和MiD51 的 表 達(dá) 均 明 顯 升 高 ，PH 患 者 PASMCs 中MiD49和MiD51表達(dá)也明顯升高。通過RNA 干擾降低MiD49 或MiD51 表達(dá)，可以逆轉(zhuǎn)脈高壓患者PASMCs 線粒體分裂，同時減少PASMCs 增殖，增加PASMCs 凋亡，從而減緩PH 的發(fā)展。他們同時發(fā)現(xiàn)MiD49和MiD51均是 microRNA-34a-3p 的靶基因，上調(diào)microRNA-34a-3p 可以取得相似的效果。而下調(diào)DRP1 的另外兩個適配體FIS1 和MFF，則無法抑制PASMCs 線粒體分裂，減少 PASMCs 增殖［24］。上述研究提示，抑制 DRP1 適配體 MiD49 和 MiD51，同樣可以作為PH治療的潛在靶點(diǎn)。

DRP1 適配體在PAECs 線粒體分裂中的作用尚未見報(bào)道。近期，有研究報(bào)道DRP1適配體在其他血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體中的作用。Zhou 等［25］發(fā)現(xiàn)，線粒體分裂增加與心肌缺血再灌注損傷有關(guān)。他們發(fā)現(xiàn)在缺氧復(fù)氧小鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中FIS1、MiD49和MiD51 表達(dá)增加，線粒體分裂增加，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和凋亡增加，從而導(dǎo)致缺血再灌注損傷。此外，他們還發(fā)現(xiàn)，敲除MFF基因可以減少線粒體分裂，改善小鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，減少心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡［26］。上述研究表明，F(xiàn)IS1、MFF、MiD49和MiD51均與心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體分裂增加、細(xì)胞功能障礙有關(guān)。但在體循環(huán)血管內(nèi)皮細(xì)胞中線粒體分裂導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，而在PAECs 中線粒體分裂增加則表現(xiàn)為細(xì)胞增殖和凋亡抵抗，這是否與體肺循環(huán)血管內(nèi)皮細(xì)胞生理特性上的差異有關(guān)，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.3 線粒體融合相關(guān)蛋白 線粒體融合相關(guān)蛋白包括MFN1、MFN2和OPA1，MFN1和MFN2介導(dǎo)線粒體外膜的融合，OPA1則介導(dǎo)線粒體內(nèi)膜的融合。抑制MFN1、MFN2 或OPA1 將會減少線粒體融合，促進(jìn)線粒體分裂。因此，MFN1、MFN2 或 OPA1 也有可能成為干預(yù) PH 的靶點(diǎn)。Ryan 等［27］發(fā)現(xiàn)，PH 患者和 PH大鼠的 PASMCs 中 MFN2 表達(dá)明顯下調(diào)，而 MFN1 和OPA1 表達(dá)則無明顯變化。在正常PASMCs 中下調(diào)MFN2，可增加線粒體分裂，促進(jìn)PASMCs 增殖。PH患者和PH 大鼠的PASMCs 線粒體分裂增加，細(xì)胞增殖明顯，而上調(diào)MFN2 則可以減少線粒體分裂，增加線粒體融合，從而減少PASMCs 增殖。在PH 大鼠中上調(diào)MFN2，可以增加大鼠的行走距離，降低肺血管阻力，降低肺動脈中層厚度，從而明顯減輕PH。Fang等［28］也發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)的PH大鼠，MFN2表達(dá)下調(diào)，PASMCs 增殖明顯，凋亡減少，過表達(dá)MFN2 可以逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)的PASMCs 增殖和凋亡減少。此外，Zhu等［29］和Lu等［30］的研究也均表明，MFN2表達(dá)下調(diào)與PASMCs 增殖和凋亡減少有關(guān)，而上調(diào)MFN2 表達(dá)則可通過增加線粒體融合，減少線粒體分裂，降低PASMCs 增殖，增加PASMCs 凋亡，從而維持兩者之間的平衡。上述的研究提示，上調(diào)MFN2 可作為干預(yù)PH的潛在靶點(diǎn)。

但目前MFN1和OPA1對PASMCs線粒體分裂調(diào)控，及其在PH 中作用的研究相對較少?，F(xiàn)有的證據(jù)顯示MFN1 和OPA1 在PH 患者和動物模型的PASMCs表達(dá)沒有明顯的變化［27］，但翻譯后修飾可能在蛋白表達(dá)總量不變的情況，調(diào)整蛋白分子的功能［11］。因此，并不能除外 MFN1 和 OPA1 通過調(diào)控線粒體分裂參與PH 的發(fā)生。MFN1 和OPA1 對線粒體分裂的調(diào)控已在心肌細(xì)胞中得到驗(yàn)證。研究報(bào)道，缺氧引起心肌細(xì)胞中線粒體分裂增加，融合減少，導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死和功能障礙，而過表達(dá)OPA1可以逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象［31］。PH 大鼠右心室 MFN1 表達(dá)下調(diào)，通過上調(diào)microRNA-140 下調(diào)MFN1 的表達(dá)，可以加重右心室肥厚和增高右心室收縮壓［32］。MFN1和OPA1在PASMCs 中是否具有相似的調(diào)控作用，需要專門針對MFN1或OPA1基因差異表達(dá)或蛋白翻譯后修飾的研究來進(jìn)一步闡明。

近期，有研究發(fā)現(xiàn)在肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中下調(diào)MFN1、MFN2 和OPA1 均可引起線粒體分裂的增加，并且MFN2 還有維持肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能和抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥起著重要的作用。但該研究中下調(diào)MFN2 并沒有對肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力和凋亡造成明顯的影響［33］。因此，盡管抑制MFN1、MFN2 和OPA1 可以促進(jìn)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體分裂，但對它們在肺血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡中的影響，仍有待進(jìn)一步的研究來闡明。

3.4 作用于線粒體動力代謝相關(guān)蛋白的翻譯后修飾 翻譯后修飾對于蛋白分子發(fā)揮其生物學(xué)功能起著重要的作用，比如磷酸化、泛素化等。研究表明，HMGB1（high-mobility group box 1）可通過激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases 1/2，ERK1/2）而促進(jìn)DRP1 磷酸化（但并不改變DRP1 總體表達(dá)水平），引起PASMCs 線粒體分裂增加，促進(jìn) PASMCs 誘導(dǎo) PH 的形成，提示 ERK1/2 信號通路有可能參與了PH 的發(fā)生［15］。亦有研究顯示，PH 患者 PASMCs 中 PINK1（PTEN-induced kinase 1）和蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）可磷酸化MFN2 第 442 位絲氨酸，導(dǎo)致 MFN2 降解增加；抑制PINK1 或PKA 可增加MFN2 表達(dá)，減少線粒體分裂，從而抑制 PASMCs 增殖，誘導(dǎo) PASMCs 凋亡［34］。因此，抑制MFN2 磷酸化信號通路也有可能參與了PH的調(diào)控。上述研究表明，除直接干預(yù)線粒體動力代謝相關(guān)蛋白的基因轉(zhuǎn)錄外，翻譯后修飾也將是調(diào)節(jié)PASMCs線粒體分裂、增殖和凋亡的重要形式。線粒體動力代謝相關(guān)蛋白翻譯后修飾對于PAECs線粒體分裂調(diào)控，及其在PH 發(fā)病中的作用目前尚無相關(guān)研究。相似的證據(jù)來自心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞：核受體亞家族 4 A組成員 1（nuclear receptor subfamily 4，group A，member 1，NR4A1）通過激活酪蛋白激酶2α（casein kinase 2α，CK2α）而磷酸化MFF，從而促進(jìn)線粒體分裂，加重缺氧復(fù)氧后心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷［25］。但在PAECs 是否同樣如此，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

盡管線粒體動力代謝相關(guān)蛋白翻譯后修飾已在PASMCs線粒體分裂、增殖和凋亡的調(diào)控中顯示出重要的作用，但翻譯后修飾繁多，且涉及眾多的信號通路。翻譯后修飾包括磷酸化、乙酰化、泛素化、類泛素化、棕櫚?；⒌鞍踪|(zhì)巰基亞硝基化和O-乙酰氨基葡萄糖修飾。磷酸化修飾涉及ERK1/2、糖原合成酶激酶3β、PKA、蛋白激酶B 和CaMKII（Ca2?/calmodulin-dependent protein kinase II）等信號通路。乙?；?飾 涉 及 SIRT （silent information regulator）和MARCH5（membrane-associated ring finger 5）等信號通路。泛素化修飾涉及parkin 和MARCH5 等信號通路。類泛素化修飾則與MAPL（mitochondria-associated protein ligase）信號通路有關(guān)。棕櫚?；揎椫饕c ZDHHC13（zinc finger DHHC-type palmitoyltransferase 13）信號通路有關(guān)［11，35］。此外，OPA1 的功能還與其蛋白的長度有關(guān)，在線粒體蛋白酶OMA1或YME1L 作用下，長片段OPA1 被分解成短片段OPA1，長片段OPA1 促進(jìn)線粒體融合，而短片段OPA1 則促進(jìn)線粒體分裂［36-37］。因此，線粒體動力代謝相關(guān)蛋白翻譯后修飾是一個十分復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，且涉及的信號通路作用的蛋白底物廣泛，不具備特異性，作為PH 潛在治療靶點(diǎn)的可靠性與安全性仍需要進(jìn)一步的研究證實(shí)（圖1）。

Figure 1. Potential target on regulation of mitochondrial fission to alleviate pulmonary hypertension（PH）. PASMCs：pulmonary artery smooth muscle cells；PAECs：pulmonary artery endothelial cells；OMM：outer mitochondrial membrane；IMM：inner mitochondrial membrane；OPA1：optic atrophy 1；HIF-1：hypoxia-inducible factor-1；ROS：reactive oxygen species；MFN：mitofusin；PINK1：PTEN-induced kinase 1；PKA：protein kinase A；DRP1：dynamin-related protein 1；HMGB1：high-mobility group box 1；ERK1/2：extracellular signal-regulated kinases 1/2；MFF：mitochondrial fission factor；MiD49/51：mitochondrial dynamics protein of 49/51 kD.圖1 肺動脈高壓中線粒體分裂的調(diào)控靶點(diǎn)

4 總結(jié)

現(xiàn)有的研究證據(jù)表明，線粒體分裂增加促進(jìn)PASMCs增殖和凋亡抵抗，同時也促進(jìn)PAECs的增殖和遷移。以抑制線粒體分裂為靶點(diǎn)的干預(yù)方式，如抑制 DRP1、MiD49 和 MiD51 及上調(diào) MFN2 在動物模型中均展現(xiàn)出良好減輕PH 的效果，為今后更有效治療PH 提供了廣闊的前景。但有如下問題亟待解決：（1）上述線粒體代謝相關(guān)蛋白在所有哺乳動物細(xì)胞中均起著調(diào)控作用，如何特異性地在PASMCs 和PAECs 中進(jìn)行線粒體分裂抑制？（2）盡管線粒體分裂增加與PAECs 的增殖和凋亡抵抗有關(guān)，但目前僅有DRP1的相關(guān)證據(jù)，對于DRP1適配體、線粒體融合相關(guān)蛋白以及上述蛋白翻譯后修飾在PAECs線粒體分裂、增殖和凋亡中的作用，仍有待闡明。（3）何種程度的線粒體分裂抑制是適度的？研究表明，完全敲除小鼠DRP1，導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死，出現(xiàn)致命性的擴(kuò)張型心肌病［38］。因此，如何適度抑制線粒體分裂，將成為以抑制線粒體分裂為靶點(diǎn)治療PH 最為關(guān)鍵的問題。上述問題也有待今后研究進(jìn)一步探索。