過(guò)表達(dá)PYNOD調(diào)控LPS介導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞極化的機(jī)制研究*

曾 琪， 俞梅琴， 劉艷娟

（1贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院超聲科，江西 贛州 341001；2贛南醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341001；3湖南省人民醫(yī)院/湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院急救醫(yī)學(xué)研究所，急危重癥代謝組學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410005）

神經(jīng)退行性疾病是一類(lèi)大腦和脊髓神經(jīng)元逐漸喪失，導(dǎo)致個(gè)體行為和認(rèn)知能力異常為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?］。炎癥反應(yīng)被認(rèn)為在神經(jīng)退行性疾病過(guò)程中起關(guān)鍵作用［2］，而小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)炎癥反應(yīng)中的重要細(xì)胞之一［3］；在神經(jīng)退行性疾病中處于中心地位［4］。小膠質(zhì)細(xì)胞受到不同的刺激時(shí)會(huì)發(fā)生表型和功能的不同分化，稱(chēng)為小膠質(zhì)細(xì)胞極化。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞M1 型極化，分泌促炎因子從而促進(jìn)神經(jīng)炎癥反應(yīng)［5］。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化是神經(jīng)退行性疾病防治的重要策略之一。

在機(jī)體的免疫炎癥系統(tǒng)中，免疫細(xì)胞可通過(guò)模式識(shí)別受體識(shí)別病原相關(guān)分子模式，NOD 樣受體（NOD-like receptors，NLRs）屬于胞漿型模式識(shí)別受體［6］。PYNOD 是 NLRs 家族中首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的炎癥反應(yīng)負(fù)調(diào)節(jié)成員［7］。作者團(tuán)隊(duì)前期研究證實(shí)PYNOD能減輕 LPS 介導(dǎo)的 BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)［8-9］，但具體機(jī)制尚未完全闡明。多種信號(hào)通路參與極化的調(diào)控［10］，核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路參與不同炎癥反應(yīng)和促炎因子的表達(dá)調(diào)控，被認(rèn)為對(duì)M1型極化具有重要調(diào)控作用；而過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）則對(duì) M2 型極化起促進(jìn)作用。PYNOD 對(duì)神經(jīng)炎癥的負(fù)性調(diào)控是否與小膠質(zhì)細(xì)胞極化有關(guān)尚不清楚。因此，本研究中采用LPS 體外刺激BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞，觀察PYNOD 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響，并探討其可能機(jī)制。

材料和方法

1 主要試劑和儀器

BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞和PYNOD 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒由本室保存；MEM 培養(yǎng)液購(gòu)自上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清購(gòu)自BI；PBS、胰酶、100×青霉素/鏈霉素購(gòu)自Biosharp；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑陽(yáng)離子聚合物Jet-PeiTM購(gòu)自PolyPlus；LPS 購(gòu)自Sigma；白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和 IL-10 ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司；RNA 提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑購(gòu)自TaKaRa；PYNOD、P65、磷酸化 P65（phosphorylated P65，p-P65）、PPARγ 和GAPDH 抗體以及羊抗兔II 抗購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；ECL 發(fā)光液和PVDF 膜購(gòu)自Millipore。酶標(biāo)儀（BioTek）；蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜和化學(xué)發(fā)光成像儀（Bio-Rad）。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞用含10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。在細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、融合度為80%左右時(shí)進(jìn)行傳代或接種鋪板操作。

2.2 分組處理 將BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞分為正常對(duì)照（control）組；LPS組：500 μg/L LPS 處理 48 h；空質(zhì)粒對(duì)照組［ngeative control（NC）+LPS組］：空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h 后，給予500 μg/L LPS 處理48 h；過(guò)表達(dá)PYNOD組（PYNOD+LPS組）：PYNOD 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后，給予500μg/L LPS處理48 h。

2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和PYNOD 表達(dá) 將BV2 細(xì)胞以每孔1×106接種至6 孔板，按陽(yáng)離子聚合物JetPeiTM說(shuō)明書(shū)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BV2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，并采用real-time PCR 和 Western blot 檢 測(cè) PYNOD 的 mRNA和蛋白表達(dá)情況。

2.4 Real-time PCR 法檢測(cè) BV2 細(xì)胞中 PYNOD、IL-6、TNF-α 和 IL-10 的 mRNA 表達(dá) 將 BV2 細(xì)胞以每孔1×106接種至6 孔板，依照不同分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作后，用PBS 緩沖液清洗3 次，加入RNA 提取試劑裂解細(xì)胞，提取總RNA，并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后用熒光定量PCR試劑，以GAPDH 作為內(nèi)參照，采用 2-ΔΔCt法［11］分析 PYNOD、IL-6、TNF-α 和IL-10 的mRNA 表達(dá)情況。引物由上海生工生物公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for real-time PCR

2.5 ELISA 法檢測(cè) BV2 細(xì)胞上清中 IL-6、TNF-α 和IL-10的水平 將BV2細(xì)胞以每孔1×104接種至96孔板，依照不同分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作后，4 ℃、200×g離心15 min，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清至1.5 mL 離心管，保存于-80 ℃?zhèn)溆?。ELISA 操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，測(cè)定在450 nm 波長(zhǎng)下的吸光度，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)BV2 細(xì)胞上清樣本中 IL-6、TNF-α 和 IL-10 的含量進(jìn)行計(jì)算。

2.6 Western blot 法檢測(cè) BV2 細(xì)胞中 PYNOD、p-P65和PPARγ 的蛋白表達(dá) 將BV2 細(xì)胞以每孔1×106接種至6 孔板，依照不同分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作后，用PBS清洗細(xì)胞3次，RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA 試劑盒對(duì)細(xì)胞樣本進(jìn)行蛋白定量后煮沸變性。取30μg總蛋白通過(guò)12%的SDS-PAGE 分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜后用5%的脫脂奶粉室溫下封閉1 h，分別加入相應(yīng)Ⅰ抗（1∶1 000 稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜。TBS-T 清洗3次后，加入Ⅱ抗（1∶5 000 稀釋?zhuān)┦覝胤跤? h。TBS-T清洗3次后，加入ECL發(fā)光液后成像采集，以GAPDH作為內(nèi)參照，分析PYNOD和PPARγ等目的蛋白的相對(duì)表達(dá)情況，以總P65 作為內(nèi)參照，分析p-P65 蛋白水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。圖形繪制和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 8 軟件。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 LPS 介導(dǎo) BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞 IL-6、TNF-α 和 IL-10的表達(dá)和分泌情況

Real-time PCR 和ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)500μg/L LPS 處理后，BV2 細(xì)胞中 M1 型細(xì)胞因子 IL-6 和TNF-α 的mRNA 表達(dá)水平和分泌量較對(duì)照組均顯著升高（P＜0.01），M2 型細(xì)胞因子 IL-10 的mRNA 表達(dá)水平和分泌量也較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖1及表2。

Figure 1. Relative mRNA expression of inflammatory factors in LPS-mediated BV2 cells. Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖1 LPS介導(dǎo)BV2細(xì)胞相關(guān)炎癥因子mRNA的表達(dá)情況

表2 LPS介導(dǎo)BV2細(xì)胞炎癥因子分泌情況Table 2. Release of inflammatory factors in LPS-mediated BV2 cells（ng/L. Mean±SD. n=6）

2 LPS 介導(dǎo)的 BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中 p-P65 和 PPARγ的蛋白水平

Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng) 500 μg/L LPS 處理后，BV2 細(xì)胞M1 型極化的轉(zhuǎn)錄因子p-P65 蛋白水平較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05），而M2型極化的轉(zhuǎn)錄因子PPARγ 蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

3 BV2細(xì)胞PYNOD過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的驗(yàn)證

Real-time PCR 和 Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，與空質(zhì)粒對(duì)照轉(zhuǎn)染的BV2 細(xì)胞相比，PYNOD 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BV2 細(xì)胞中PYNOD 的mRNA 和蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3。這說(shuō)明PYNOD 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞。

4 PYNOD 過(guò)表達(dá)對(duì)LPS 介導(dǎo)的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-6、TNF-α和IL-10表達(dá)和分泌的影響

Figure 2. The protein levels of p-P65 and PPARγ in LPS-mediated BV2 cells. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group.圖2 LPS介導(dǎo)的BV2細(xì)胞中p-P65和PPARγ的蛋白水平

Figure 3. The mRNA（A）and protein（B）expression of PYNOD in PYNOD overexpression plasmid-transfected BV2 cells. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs NC group.圖3 轉(zhuǎn)染PYNOD過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的BV2細(xì)胞中PYNOD的表達(dá)情況

Real-time PCR 和ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC+LPS組相比，PYNOD 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BV2 細(xì)胞經(jīng)500μg/L LPS處理后M1型細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的mRNA 水平和細(xì)胞上清中含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），而 M2 型細(xì)胞因子 IL-10 的 mRNA 水平和細(xì)胞上清中含量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)圖4及表3。

Figure 4. The mRNA expression of inflammatory factors in LPS-mediated BV2 cells after PYNOD overexpression. Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs NC+LPS group.圖4 PYNOD過(guò)表達(dá)后LPS介導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥因子的mRNA表達(dá)情況

表3 PYNOD過(guò)表達(dá)后LPS介導(dǎo)BV2細(xì)胞炎癥因子釋放情況Table 3. Release of inflammatory factors in LPS-mediated BV2 cells after PYNOD overexpression（ng/L. Mean±SD. n=6）

5 PYNOD 過(guò)表達(dá)對(duì)LPS 介導(dǎo)的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中p-P65和PPARγ蛋白水平的影響

Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC+LPS組相比，PYNOD 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BV2 細(xì)胞經(jīng)500μg/L LPS處理后M1型極化的轉(zhuǎn)錄因子p-P65蛋白水平顯著降低（P＜0.05），而M2 型極化的轉(zhuǎn)錄因子PPARγ 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)圖5。

Figure 5. The protein levels of p-P65 and PPARγ in LPS-mediated BV2 cells after PYNOD overexpression. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs NC+LPS group.圖5 PYNOD過(guò)表達(dá)后LPS介導(dǎo)的BV2細(xì)胞中p-P65和PPARγ的蛋白水平

討 論

神經(jīng)炎癥被認(rèn)為在神經(jīng)退行性疾病的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［12］，其主要病理特征是腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。小膠質(zhì)細(xì)胞相當(dāng)于腦和脊髓中的巨噬細(xì)胞，是腦內(nèi)常駐的免疫效應(yīng)細(xì)胞［13］，在維持機(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和損傷修復(fù)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞在不同的微環(huán)境下極化成促炎的M1 型和抗炎的M2 型，釋放不同類(lèi)型的細(xì)胞因子而發(fā)揮作用［14］。本研究結(jié)果顯示，LPS介導(dǎo) BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞 M1 型細(xì)胞因子 IL-6 和 TNF-α 及M2 型細(xì)胞因子IL-10 的表達(dá)和釋放均增加，且M1 型細(xì)胞因子增加程度明顯高于M2 型細(xì)胞因子。IL-6和TNF-α 的升高表明LPS 促進(jìn)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，而IL-10 的升高可能是細(xì)胞對(duì)LPS 刺激后的反饋性升高，發(fā)揮一定的保護(hù)作用，與前人報(bào)道［15］的結(jié)果一致。

小膠質(zhì)細(xì)胞極化受到細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，不同的轉(zhuǎn)錄因子激活啟動(dòng)不同基因表達(dá)以實(shí)現(xiàn)表型特征［16］。NF-κB 和 PPARγ 分別是小膠質(zhì)細(xì)胞M1 型和 M2 型極化的特異性轉(zhuǎn)錄因子［17］。NF-κB 是公認(rèn)的促炎因子，能轉(zhuǎn)錄調(diào)控IL-6 和TNF-α 的表達(dá)和釋放，而 PPARγ 能誘導(dǎo)細(xì)胞釋放 IL-4 和 IL-13，誘導(dǎo) M2 型細(xì)胞極化［18］。本研究結(jié)果顯示，LPS 介導(dǎo)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞 p-P65 高表達(dá)，PPARγ 低表達(dá)，表明LPS的確促進(jìn)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化。

NLRs 家族成員之一的NLRP3 作為炎癥小體重要的組成部分［19］，有研究報(bào)道其能夠通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞 M1 型極化發(fā)揮促炎作用［20］。而 PYNOD 是 NLRs家族中負(fù)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)成員［21］。我們通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)PYNOD，發(fā)現(xiàn)PYNOD 高表達(dá)后LPS 介導(dǎo)IL-6和TNF-α 表達(dá)和釋放受抑制，而IL-10 則進(jìn)一步升高，表明PYNOD 在神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)揮抗炎作用。而進(jìn)一步針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的研究顯示：PYNOD 能降低 p-P65 活性，升高 PPARγ 表達(dá)，提示PYNOD 可能通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的轉(zhuǎn)錄因子活性或表達(dá)而調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞不同類(lèi)型的極化。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，PYNOD 可與ASC 蛋白的PYD 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB 活性［8］；此外PYNOD 減少I(mǎi)L-1β 的產(chǎn)生，另有研究報(bào)道IL-1β能下調(diào) PPARγ 表達(dá)［22］，這些可能是 PYNOD 調(diào)控NF-κB和PPARγ的機(jī)制。

綜上所述，PYNOD 能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞M1 極化，促進(jìn)M2極化，其機(jī)制可能與降低轉(zhuǎn)錄因子p-P65活性和升高PPARγ 表達(dá)活性有關(guān)。我們的研究為PYNOD 發(fā)揮炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)作用和減輕神經(jīng)炎癥等提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。