嘧啶合成關(guān)鍵酶CAD促進食管癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的機制探討*

謝小珊， 余楓海， 馬 寧， 潘啟豪， 黃曉玲， 金慧林， 孟祥祺， 李孟鴻

（中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院廣東省結(jié)直腸盆底疾病研究重點實驗室，廣東省胃腸病學(xué)研究所，廣東 廣州 510655）

食管癌是全球常見的胃腸道惡性腫瘤之一，其中食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）約占所有食管癌病例的 90%［1］。根據(jù)2021 年全球癌癥統(tǒng)計，食管癌是第七大致死癌癥［2］。由于其復(fù)發(fā)、入侵和轉(zhuǎn)移率高，食管癌在初步診斷后的5 年生存率低于13%［3］。氨基甲酰磷酸合成酶2-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶-二氫乳清酶（carbamoyl-phosphate synthetase 2，aspartate transcarbamylase，and dihydroorotase，CAD）三功能酶作為嘧啶核苷酸合成前3 個步驟的關(guān)鍵酶，是一種多功能蛋白質(zhì)［4-5］，在肝癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤、肺腺癌等多種腫瘤中表達上調(diào)［6-9］，但其在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用與機制目前未見報道。本研究通過細胞學(xué)實驗、分子生物學(xué)實驗及癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）、基因表達數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）等生物信息學(xué)分析，探索CAD 三功能酶在食管癌的生物學(xué)功能和潛在機制，以期為食管癌開發(fā)新的治療策略提供參考資料。

材料和方法

1 細胞

實驗中所用的人源食管癌細胞系TE5、KYSE70和KYSE270 均源自實驗室收藏，在含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，并置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。

2 主要試劑和儀器

RPMI-1640 培養(yǎng)液、胰蛋白酶和Matrigel 購自Corning；胎牛血清購自 Gibco；Lipofectamine 2000（Thermo Fisher）；PrimeSTAR HS DNA Polymerase（TaKaRa）；BamH I 和XhoI 內(nèi)切酶（New England Bio-Labs）；ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit（Vazyme）；pcDNA 3.1 載體（Addgene）；Transwell 小室（Falcon）；Trizol Reagent（Ambion）；RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega）；2× SYBR Green（BIMAKE）；BCA 蛋白定量試劑盒（貝博生物）；磷酸酶和蛋白酶抑制劑cocktail（Bimake）；兔抗 CAD、MYC、Snail 和 vimentin抗體（Cell Signaling Technology）；鼠抗Flag-Tag 和βactin 抗體（Sigma-Aldrich）；鼠抗β-catenin 抗體（BD Biosciences）；辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗（Thermo）；ECL Substrate（Bio-Rad）；小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

活細胞動態(tài)成像與分析儀（IncuCyte）購于Essen BioScience；實時熒光定量PCR 儀購于Roche；全自動酶標儀購自BioTek；PCR分析儀與電泳儀均購自Bio-Rad。

3 主要方法

3.1 TCGA 與 GEO 數(shù) 據(jù) 分 析 從 TCGA 與 GEO 數(shù)據(jù)庫下載食管癌的基因表達數(shù)據(jù)，根據(jù)腫瘤組織和癌旁正常組織中CAD基因相對表達量（數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布和方差齊性），通過t檢驗對差異進行分析［10］。

3.2CAD質(zhì)粒構(gòu)建 以 HEK293T 細胞 cDNA 為模板，加入CAD的 PCR 引物（上游序列為 5＇-GCGGCCCTAGTGTTGGAGGACG-3＇，下 游 序 列 為 5＇-CTAGAAACGGCCCAGCACGGTGG-3＇）以 及 Prime-STAR HS DNA Polymerase 進行 PCR，將CAD基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)序列與帶有Flag 標簽的pcDNA 3.1 載體通過同源重組的方式進行連接，用DH5α 感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化，搖菌，提取質(zhì)粒，測序成功后得到目的質(zhì)粒Flag-CAD。

3.3 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 待TE5、KYSE70或KYSE270細胞融合至70%左右，將CADsiRNA #2（si #2，序列為 5＇-UCCGAAAGAUGGGAUAUAATT-3＇）、si #3（序列為5＇-UGACCAUUGGCAGCUAUAATT-3＇）、陰性對照 siRNA（si #NC，序列為 5＇-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3＇）或 Flag-CAD 質(zhì)粒、MYC 質(zhì)粒和 pcDNA 3.1 質(zhì)粒（vector）分別用 Lipofectamine 2000 進行轉(zhuǎn)染。48 h 后，提取細胞總RNA 或總蛋白，分別用RT-qPCR和Western blot實驗檢測mRNA及蛋白水平，以確保轉(zhuǎn)染效率較好。

3.4 Transwell 遷移和侵襲實驗 對于遷移實驗，將Transwell 小室置于 24 孔板上，上室接種 2×105細胞（無血清培養(yǎng)液），下室加入10%RPMI-1640 培養(yǎng)液。23 h 后，將細胞用0.5%的結(jié)晶紫（甲醇配制）進行染色，用棉簽擦除上室未遷移的細胞，使用顯微鏡拍攝3 個獨立視野，并進行細胞計數(shù)。對于侵襲實驗，先在 Transwell 小室預(yù)鋪 50 μL 稀釋的 Matrigel，上室接種3×105細胞（無血清培養(yǎng)液），其余操作與遷移實驗大致相同。

3.5 集落形成實驗 將細胞進行計數(shù)，每孔接種300 個細胞至培養(yǎng)板，每個處理組鋪3 個復(fù)孔。用10% 胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)，每兩天更換培養(yǎng)液。10 d 后，棄去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定20 min，再用0.5%的結(jié)晶紫染色30 min，掃描后對集落進行計數(shù)［11］。

3.6 RT-qPCR 實驗 使用Trizol 試劑提取細胞的總RNA，根據(jù)Promega 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進行實時熒光定量PCR 實驗。βactin 作為內(nèi)參照，通過 2-ΔΔCt公式計算出 mRNA 的相對表達量。RT-qPCR引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. Sequences of the primers for RT-qPCR

3.7 Western blot實驗 棄去細胞培養(yǎng)液，用磷酸緩沖鹽溶液PBS 洗2 次細胞，棄盡PBS，往細胞加入蛋白裂解液（已預(yù)先加入磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑），冰上裂解15 min 后，進行超聲，離心15 min，取上清，進行BCA 蛋白定量，制備蛋白樣品并使其變性。SDS-PAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，敷上Ⅰ抗4 ℃搖床過夜。TBST 洗膜后，常溫孵育Ⅱ抗1 h，再次用TBST 洗膜，而后進行ECL顯色［12］。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，使用GraphPad Prism 5 軟件作圖。實驗結(jié)果用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。兩組間均數(shù)比較采用Student＇st檢驗；CAD與MYC的mRNA相關(guān)性采用Pearson關(guān)聯(lián)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CAD基因在食管癌及多種腫瘤中高表達

GEPIA 網(wǎng)站分析結(jié)果顯示，CAD基因在食管癌（ESCA）、彌漫性大B 細胞淋巴瘤（DLBC）、胰腺癌（PAAD）、胃腺癌（STAD）等多種腫瘤樣本中的表達顯著高于癌旁組織（圖1A）。對TCGA和GEO中食管癌組織的CAD 表達量進行分析，與癌旁組織相比，CAD基因在腫瘤中的表達顯著升高（P＜0.01），見圖1B、C。cBioPortal 腫瘤基因組學(xué)（cBioPortal for Cancer Genomics）網(wǎng)站分析顯示，CAD基因在食管癌中的擴增率達到6%（圖1D）。

Figure 1. CAD gene was overexpressed in esophageal carcinoma and some other types of cancer. A：GEPIA website displayed that CAD gene expression in tumor samples was significantly higher than that in adjacent normal tissues in various kinds of cancer（T：tumor tissues；N：adjacent normal tissues；ESCA：esophageal carcinoma；DLBC：diffuse large B-cell lymphoma；HNSC：head and neck squamous cell carcinoma；PAAD：pancreatic adenocarcinoma；SKCM：skin cutaneous melanoma；STAD：stomach adenocarcinoma；THYM：thymoma）；B and C：the expression of CAD gene in tumor tissues was much higher than that in adjacent normal tissues based on TCGA and GEO ESCA datasets；D：cBioPortal website showed that the amplification rate of CAD was 6%in esophageal carcinoma. Mean±SD.**P＜0.01 vs normal.圖1 CAD基因在食管癌及多種腫瘤中高表達

2 敲減CAD 抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力

轉(zhuǎn)染siRNA（針對不同靶點的兩條siRNA）敲減CAD的表達后，通過Western blot 檢測敲減效率。結(jié)果顯示，兩條siRNA 干擾序列均能有效敲減CAD的表達，見圖2A。使用活細胞動態(tài)成像與分析系統(tǒng)（IncuCyte）和集落形成實驗記錄食管癌細胞TE5 的生長增殖情況，使用Transwell 實驗記錄食管癌細胞TE5 和 KYSE70 的遷移和侵襲情況。如圖 2B、C 所示，敲減CAD表達后TE5 細胞生長能力顯著下降，集落形成數(shù)量顯著減少（P＜0.05 或P＜0.01）。Transwell實驗結(jié)果顯示，與si#NC 對照組相比，敲減CAD后TE5 和KYSE70 細胞的遷移和侵襲細胞數(shù)顯著減少（P＜0.01），見圖2D。

Figure 2. Knockdown of CAD inhibited the proliferative，migratory and invasive abilities of esophageal carcinoma cells. A：Western blot was used to detect the knockdown efficiency of indicated siRNAs for CAD expression in TE5 cells；B：Incucyte System was used to determine the proliferative ability of TE5 cells；C：the proliferation of TE5 cells was detected by focus formation assay；D：the migratory and invasive abilities of TE5 and KYSE70 cells were detected by Transwell assay（scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs si#NC group.圖2 敲減CAD抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力

3 過表達CAD 增強食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力

在TE5 和KESE270 細胞中轉(zhuǎn)染帶有Flag 標簽的CAD過表達質(zhì)粒，Western blot 結(jié)果顯示 Flag 標簽的CAD質(zhì)粒成功表達（圖3A）。活細胞動態(tài)成像與分析系統(tǒng)結(jié)果顯示，過表達CAD后TE5 和KYSE270 細胞的生長顯著加快（P＜0.05 或P＜0.01），見圖 3B。集落形成實驗顯示，過表達CAD后細胞的集落數(shù)量和大小均顯著高于對照組（P＜0.01），見圖3C。Transwell 結(jié)果顯示，TE5 和 KYSE270 細胞在過表達CAD后遷移和侵襲的細胞數(shù)均顯著增多（P＜0.01），見圖3D。

4 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）顯示β-catenin、MYC 和糖酵解通路富集在CAD高表達組中

將TCGA 數(shù)據(jù)庫中的食管癌mRNA 數(shù)據(jù)進行GSEA，根據(jù)歸一化富集分數(shù)（normalized enrichment score，NES）的高低，圖4A對GSEA結(jié)果進行了排序。如圖 4B 所示，β-catenin、MYC 和糖酵解通路都富集在CAD高表達組（P＜0.05）。

Figure 3. Overexpression of CAD promoted the proliferation，migration and invasion of esophageal carcinoma cells. A：the overexpression efficiency was detected by Western blot after transfection with Flag-CAD plasmid；B and C：the proliferation of TE5 and KYSE270 cells was determined by IncuCyte System and focus formation assay；D：the changes of migration and invasion were detected by Transwell assay（scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs vector group.圖3 過表達CAD增強食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力

5 敲減CAD 抑制β-catenin/MYC、糖酵解及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）信號通路

在GEPIA 網(wǎng)站上對TCGA 食管癌數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示CAD 與MYC 的mRNA 表達呈中度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.43（P＜0.001），見圖5A。RT-qPCR 和 Western blot 結(jié)果顯示，敲減CAD后 MYC 的mRNA和蛋白表達水平同時下降（P＜0.01），見圖5B、C。同時，敲減CAD致使β-catenin 的蛋白表達水平下降，見圖5C。對糖酵解過程各種酶的mRNA 表達進行檢測，結(jié)果顯示，敲減CAD后己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）、血小板型磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，platelet，PFKP）、磷酸甘油酸酯激酶 1（phosphoglycerate kinase 1，PGK1）、烯醇化酶1（eno-lase 1，ENO1）、丙酮酸激酶肌肉同工酶2（pyruvate kinase muscle isozyme 2，PKM2）、乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）的mRNA 表達均受到抑制（P＜0.05 或P＜0.01），見圖 5D。此外，通過Western blot 檢測EMT 相關(guān)標志蛋白的表達，顯示敲減CAD可引起間充質(zhì)標志蛋白vimentin 及轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達下降，見圖5C。

Figure 4. Gene set enrichment analysis（GSEA）revealed that β-catenin，MYC and glycolysis pathways were enriched in high CAD group. A：the ranking of GSEA results enriched in high CAD group；B：β-catenin，MYC targets and glycolysis pathways were enriched in the tissues with high expression of CAD.圖4 基因集富集分析顯示β-catenin、MYC和糖酵解通路富集在CAD高表達組

6 過表達MYC能夠減弱敲減CAD對食管癌細胞增殖能力的抑制

在食管癌細胞KYSE70中敲減CAD，同時過表達MYC，觀察細胞增殖能力的變化。圖6A 的Western Blot 結(jié)果顯示CAD的成功敲減和MYC的過表達情況。如圖6B、C 所示，與對照組相比，敲減CAD表達可以顯著抑制KYSE70細胞的增殖和集落形成能力，而在敲減CAD表達的同時過表達MYC減弱了敲減CAD表達導(dǎo)致的細胞生長和集落形成能力的降低（P＜0.05或P＜0.01）。

Figure 5. Knockdown of CAD negatively regulated β-catenin/MYC，glycolysis pathways and EMT signaling. A：Pearson correlation between CAD and MYC mRNA levels was analyzed by GEPIA website（Pearson correlation coefficient r=0.43，P＜0.001）；B：RT-qPCR was used to detect the mRNA levels of CAD and MYC after knockdown of CAD（normalized to β-actin）；C：Western blot was performed to detect the protein levels of CAD，β-catenin，MYC and EMT-associated proteins（normalized to β-actin）；D：relative mRNA levels of glycolysis-related genes were detected by RT-qPCR（normalized to β-actin）.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs si#NC group.圖5 敲減CAD抑制β-catenin/MYC、糖酵解以及EMT信號通路

討 論

嘧啶核苷酸的從頭合成對哺乳動物細胞的增殖至關(guān)重要，此通路的前三個步驟由多功能酶CAD 催化合成。Lee 等［4］研究顯示，當(dāng) CAD 被 MAPK 磷酸化時，細胞的嘧啶生物合成將被刺激并促進生長。mTORC1 通過 S6 激酶間接磷酸化 CAD 的 S1859 位點從而促進CAD 的寡聚化，進而刺激哺乳動物嘧啶的從頭合成［13］。已有研究證明，CAD 在復(fù)發(fā)性肝癌與轉(zhuǎn)移性乳腺癌中高表達，并與較短的總體生存期相關(guān)［6-7］。由此可見，CAD促進多種腫瘤的進展。但是，CAD 在食管癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用與機制未見報道。此前對于CAD 功能的研究，主要集中在促進嘧啶核苷酸的合成，其更多的功能仍待挖掘。本研究對TCGA 和GEO 多個食管癌數(shù)據(jù)庫進行分析，均顯示CAD 在食管癌中高表達，并通過細胞學(xué)實驗驗證了CAD正調(diào)控食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，提示CAD 在食管癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。但是，CAD 的磷酸化水平是否在不同進展階段的食管癌中發(fā)生變化，仍待探究。

Figure 6. Overexpression of MYC partially attenuated the inhibitory effect of CAD knockdown on the proliferation of esophageal carcinoma cells. A：Western blot was performed to detect CAD and MYC expression after transfection with CAD siRNAs and MYC plasmid in KYSE70 cells；B：IncuCyte System was conducted to determine the proliferation of KYSE70 cells；C：the proliferation of KYSE70 cells was detected by focus formation assay. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs si #NC group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs si#2 or si#3 group.圖6 過表達MYC能夠減輕敲減CAD對食管癌細胞增殖能力的抑制

近年來，代謝重編程以滿足腫瘤細胞的生物合成和能量需求引起了人們的廣泛興趣［14］。細胞能量代謝的重編程是腫瘤的重要標志之一，其中葡萄糖代謝異常是腫瘤代謝的突出特征［15］。當(dāng)氧氣含量充足時，正常細胞的主要能量來源為葡萄糖有氧氧化，但腫瘤細胞更喜歡厭氧糖酵解來維持其生長和生存，這被稱為“瓦博格效應(yīng)”［16］。先前已有不少研究證明，轉(zhuǎn)錄因子MYC 可以直接促進GLUT1及其他糖酵解基因如HK2、PFKP、PGK1、LDHA、ENO1［14，17］、PKM2［18］等的轉(zhuǎn)錄活性，刺激糖酵解途徑的進程。Hideki 等［9］的研究表明，EGFR 信號既維持肺腺癌細胞的有氧糖酵解，又能促進嘧啶合成等多條關(guān)鍵代謝通路。但目前仍未有研究證明，嘧啶合成的關(guān)鍵酶CAD 能夠直接調(diào)控MYC 及糖酵解途徑。本研究對TCGA 食管癌數(shù)據(jù)集進行基因富集分析，顯示糖酵解通路富集在CAD 高表達組，經(jīng)過RT-qPCR 實驗，證實敲減CAD后糖酵解過程一系列酶的mRNA表達水平下 降 ，包括 HK2、PFKP、PGK1、ENO1、PKM2、LDHA 及 GLUT1。而MYC作為這些基因的轉(zhuǎn)錄因子，在敲減CAD后，其mRNA 和蛋白水平也呈現(xiàn)下降趨勢。這些結(jié)果表明，CAD 可能通過調(diào)控MYC和糖酵解途徑，從而與細胞的增殖息息相關(guān)。功能回補實驗結(jié)果證明，MYC 在CAD 調(diào)控食管癌細胞的增殖中擔(dān)任了重要角色。但是，CAD 能否通過MYC調(diào)控其他下游通路如絲氨酸-甘氨酸-單碳（serineglycine-one-carbon，SGOC）代謝等，有待進一步的實驗研究。

同時，MYC 也是 Wnt/β-catenin 信號通路的關(guān)鍵下游靶蛋白［19］。He 等［20］指出，當(dāng)β-catenin 在細胞質(zhì)中積累，轉(zhuǎn)移到細胞核，可激活下游靶基因MYC的轉(zhuǎn)錄，促進結(jié)直腸癌的進展。目前仍無研究報道，CAD能對β-catenin 進行調(diào)控。而本研究的結(jié)果顯示，敲減CAD可減少β-catenin 的蛋白表達水平。由此推斷，CAD 可能通過調(diào)控 β-catenin 來激活 MYC 及其下游通路。此外，EMT 在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，本研究顯示敲減CAD可抑制EMT 關(guān)鍵分子vimentin 和 Snail 的表達，說明 EMT 可能在 CAD 調(diào)控食管癌細胞遷移和侵襲中發(fā)揮重要功能。

綜上所述，本研究證明CAD 促進食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并顯示其調(diào)控β-catenin/MYC/糖酵解途徑及EMT 信號通路，MYC 介導(dǎo)了CAD 對增殖能力的調(diào)控。然而，CAD 以何種機制調(diào)控β-catenin/MYC 通路及食管癌細胞的遷移和侵襲，仍待進一步研究。相關(guān)功能與機制的深入研究與探索，將揭示CAD在食管癌進展中的重要作用與生物學(xué)意義。