用微衛(wèi)星標(biāo)記分析北方春糜子區(qū)黍稷的遺傳差異

段政勇，邢 志，王海崗，陳 凌，Dipak K Santra ，王瑞云，，喬治軍，

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)基因資源研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031；3.內(nèi)布拉斯加大學(xué)林肯分校農(nóng)藝系小宗糧豆研究與推廣中心，美國 內(nèi)布拉斯加州 69361）

黍稷（Panicum miliaceumL.）屬于禾本科黍?qū)?，又名糜黍、糜子。黍稷栽培歷史可以追溯到1萬年以前，是我國北方的主栽作物[1]，在歐亞大陸的許多干旱地區(qū)均有分布[2]。黍稷具有生長周期短、抗鹽抗旱、耐貧瘠的特性，蘊(yùn)含著豐富的抗逆基因，一般在溫暖的季節(jié)生長、成熟、結(jié)實(shí)，并能夠充分利用水資源，是旱地半干旱地栽培的主要農(nóng)作物[3-4]。黍稷營養(yǎng)豐富，淀粉、高膳食纖維、蛋白質(zhì)以及多種維生素為其主要組成部分，對(duì)人體有著較高的營養(yǎng)價(jià)值，黍稷還含有豐富的礦質(zhì)元素、多酚、黃酮等，能夠降血糖、增強(qiáng)人體機(jī)制、預(yù)防多種疾病[5-7]。黍稷生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)[8]，分布廣泛，種質(zhì)資源種類繁多，基因組信息多樣，針對(duì)黍稷抗旱、耐高溫及蒸騰速率低等優(yōu)良特性進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)價(jià)和遺傳背景分析，有助于對(duì)抗旱、保水等基因資源的挖掘和高效利用[9]，也有助于黍稷品種資源的鑒定、選育、改良。

利用分子標(biāo)記開展作物遺傳多樣性分析是作物種質(zhì)資源遺傳背景研究的重要手段，微衛(wèi)星標(biāo)記作為重要的遺傳標(biāo)記之一[10]，可以有效鑒別基因型，目前被廣泛用于構(gòu)建指紋圖譜[11]、評(píng)估作物遺傳多樣性[12]以及鑒定品種等方面[13-14]。隨著微衛(wèi)星標(biāo)記迅速發(fā)展，利用其對(duì)黍稷遺傳背景研究已經(jīng)成為主流方式。HU等[15]最先利用種間SSR標(biāo)記分析了我國糜子的遺傳差異特性。2010年，CHO等[16]首次構(gòu)建了25個(gè)黍稷微衛(wèi)星標(biāo)記，并針對(duì)50份供試材料分析黍稷資源遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)。石甜甜等[17]用144個(gè)SSR標(biāo)記評(píng)估國內(nèi)外5個(gè)生態(tài)區(qū)黍稷材料的遺傳差異性，并對(duì)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)做了綜合分析，發(fā)現(xiàn)北方春糜子區(qū)的遺傳多樣性更為豐富，為北方春糜子區(qū)黍稷材料的遺傳研究和遺傳育種指出了方向。HUNT等[18]利用16個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)成功將歐亞大陸98個(gè)地方品種的遺傳多樣性進(jìn)行分析，探討了黍稷在歐亞大陸范圍內(nèi)的系統(tǒng)地理結(jié)構(gòu)。RAJPUT等[14]運(yùn)用比較基因組學(xué)發(fā)展了來源于柳枝稷基因組的SSR標(biāo)記，檢測并評(píng)估柳枝稷SSR標(biāo)記在糜子中的應(yīng)用。王瑞云等[19]利用85對(duì)引物對(duì)我國6個(gè)生態(tài)地區(qū)的98份黍稷材料展開研究，分析得到的遺傳主要參數(shù)，多態(tài)性信息含量（PIC）為0.400 0~0.728 1，平均為0.472 3。連帥等[20]研究了5個(gè)生態(tài)地區(qū)的40份黍稷的遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)15個(gè)等位變異，平均多態(tài)性信息含量為0.48。董俊麗等[21]利用96份黍稷種質(zhì)資源對(duì)我國各地區(qū)的黍稷資源的遺傳差別進(jìn)行了分析，同時(shí)也研究了我國黍稷與俄羅斯黍稷之間的遺傳差異，結(jié)果表明，俄羅斯的黍稷資源與我國的黍稷資源有較大的差別，我國和俄羅斯的黍稷種質(zhì)資源有很大的遺傳距離。LIU等[22]采用67對(duì)SSR引物對(duì)4個(gè)群組的黍稷栽培種和地方品種的遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)估并分析其主成分，共檢測到179個(gè)等位變異，共有67個(gè)標(biāo)記，平均為2.672，有效等位基因數(shù)（Ne）平均為1.995，遺傳多樣性指數(shù)（I）平均為0.725。王璐琳等[23]開發(fā)了17個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，并分析了不同黍稷之間的遺傳差異，新標(biāo)記使得黍稷分子標(biāo)記更為豐富，方便了對(duì)黍稷的遺傳研究?？苁缇萚24]利用22對(duì)引物對(duì)國內(nèi)131份黍稷材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，共檢測出128個(gè)主要等位變異，平均每個(gè)位點(diǎn)為5.82，I平均為0.628 4，Ne平均為0.587 4，結(jié)果表明，不同生態(tài)區(qū)的黍稷資源遺傳差異較大，但不同生態(tài)區(qū)之間存在基因交流。盡管前人利用分子標(biāo)記對(duì)黍稷遺傳多樣性進(jìn)行了大量研究，但目前尚缺乏可進(jìn)行準(zhǔn)確可靠遺傳差異分析的分子標(biāo)記，所以，構(gòu)建大批微衛(wèi)星標(biāo)記以促進(jìn)黍稷的高效利用勢在必行[25]。而且我國黍稷資源眾多，各個(gè)地區(qū)遺傳差異性較大，遺傳背景復(fù)雜，而黍稷屬于小雜糧作物，對(duì)資源遺傳多樣性的研究也不夠。

本研究利用80對(duì)高基元SSR引物對(duì)48份北方春糜子區(qū)的黍稷材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測其多態(tài)性，以了解北方春糜子生態(tài)區(qū)的黍稷遺傳差異，旨在為進(jìn)一步改良種質(zhì)資源和篩選優(yōu)質(zhì)基因提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為48份黍稷資源，來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所（具有統(tǒng)一編號(hào)），農(nóng)家種和育成品種（無統(tǒng)一編號(hào)）由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院糜子分子育種實(shí)驗(yàn)室收集，分布于北方春糜子區(qū)的青海、甘肅、內(nèi)蒙古、山西等4個(gè)省份（表1）。

表1 48份黍稷資源概況Tab.1 Overview of 48 broomcorn millet resources

1.2 基因組DNA提取與DNA質(zhì)量檢測

選取試驗(yàn)材料，剪取三葉期幼苗葉片，用保鮮袋封存放置在-80℃冰箱備用。利用改良的CTAB法[26]將葉片進(jìn)行研磨后經(jīng)過離心管離心提取黍稷基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，并用NanodropND1000核酸濃度檢測儀檢測DNA的濃度。測定濃度后加入雙純水稀釋濃度調(diào)至30~80 ng/μL。

1.3 PCR擴(kuò)增及聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序來源于陳小紅等[25]的方法，退火溫度根據(jù)不同Tm值設(shè)定，PCR產(chǎn)物于4℃保存，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將不同樣品PCR擴(kuò)增出條帶以（0，1）進(jìn)行記錄，構(gòu)建數(shù)字指紋圖譜。用PowerMarker 3.25[27]分析多態(tài)性信息含量，用PopGen 1.32[28]對(duì)80對(duì)SSR引物擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行多樣性分析，用MEGA 5.0[29]構(gòu)建聚類圖，用Structure 2.2[30]分析群體遺傳結(jié)構(gòu)，用NTSYSpc 2.11進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于特異性SSR標(biāo)記的遺傳多樣性分析

用80對(duì)高基元SSR引物擴(kuò)增48份黍稷材料，結(jié)果表明（表2），在48份材料中檢測到206個(gè)等位變異，共有80個(gè)標(biāo)記，每個(gè)位點(diǎn)檢測到2~3個(gè)，平均為2.575個(gè)；其中，產(chǎn)生2個(gè)變異的位點(diǎn)有34個(gè)，產(chǎn)生3個(gè)變異的位點(diǎn)有46個(gè)。80個(gè)位點(diǎn)多樣性指數(shù)介 于0.665 5（RYW95）~1.078 6（RYW166），平均為0.860 8；有效等位基因數(shù)介于1.896 1（RYW95）~2.888 7（RYW166），平均為2.312 6。Nei's期望雜合度最大的是0.653 8，最小的是0.472 6，平均為0.559 3。80個(gè)位點(diǎn)PIC值介于0.185 0（RYW151）~0.706 2（RYW111），平均為0.453 6。

表2 80對(duì)引物測定的遺傳參數(shù)Tab.2 Genetic parameters measured by 80 pairs of primers

續(xù)表2 80對(duì)引物測定的遺傳參數(shù)Tab.2（Continued） Genetic parameters measured by 80 pairs of primers

2.2 不同來源黍稷資源群體間的遺傳變異分析

對(duì)北方春糜子區(qū)的4個(gè)省區(qū)黍稷資源的遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行分析（表3），發(fā)現(xiàn)青海材料PIC值最高，山西的PIC值最低。甘肅與山西試材的遺傳距離（0.045 6）最大（表4），遺傳一致度（0.955 5）最低；內(nèi)蒙古與山西試材的遺傳距離（0.028 6）最小，遺傳一致度（0.973 6）最高。

表3 不同來源黍稷的遺傳多樣性分析Tab.3 Genetic diversity analysis of broomcorn millet from di fferent sources

表4 不同群體黍稷資源的遺傳距離與遺傳一致度Tab.4 Genetic distance and genetic consistency of different populations of broomcorn millet resources

2.3 不同地區(qū)黍稷的聚類分析

根據(jù)UPGMA聚類（圖1），將48份試材歸為3個(gè)群組，第Ⅰ群組含有5份試材，其中青海資源最多（4份），占80%。第Ⅱ群組有17份試材，主要包括山西資源（9份），占52.94%。第Ⅲ群組有26份試材，包含甘肅和內(nèi)蒙古的黍稷資源，甘肅黍稷資源（9份）占34.62%，內(nèi)蒙古黍稷資源（12份）占46.15%。從聚類分析可以看出，第Ⅰ類群有著少量的甘肅黍稷，第Ⅱ類群有著少量的內(nèi)蒙古黍稷和甘肅黍稷，第Ⅲ類群有著少量的山西黍稷，各群體之間存在著少量的交叉現(xiàn)象。

2.4 基于模型的黍稷資源群體結(jié)構(gòu)分析

對(duì)黍稷試材的所有基因建庫，然后建立模型進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)48份黍稷試材的等位變異頻率特征數(shù)Delta K在K=4處峰值明顯（圖2）。

利用Structure將黍稷試材劃分為4個(gè)群組（表5、圖3）。其中，紅色類群9份，包括青海5份、甘肅2份、內(nèi)蒙古1份、山西1份；綠色類群14份，包括青海3份、甘肅3份、內(nèi)蒙古6份、山西2份；藍(lán)色類群12份，包括青海2份、甘肅6份、內(nèi)蒙古2份、山西2份；黃色類群13份，包括青海3份、內(nèi)蒙古5份、山西5份。

表5 遺傳結(jié)構(gòu)圖中各類群的統(tǒng)計(jì)Tab.5 Statistics of groups in structure graph 份

對(duì)K=4遺傳結(jié)構(gòu)（圖3）和每個(gè)類群的遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行分析評(píng)估（表6）。從PIC值來看，紅色類群（0.467 9）＞藍(lán)色類群（0.397 6）＞綠色類群（0.382 7）＞黃色類群（0.377 9）；根據(jù)多樣性指數(shù)比較可以得到，紅色類群（0.848 0）＞藍(lán)色類群（0.845 9）＞綠色類群（0.836 9）＞黃色類群（0.805 3）；紅色類群的參數(shù)均最高；黃色類群的參數(shù)均最低。綜合來看，4個(gè)類群的遺傳多樣性豐富度的大小為紅色類群＞藍(lán)色類群＞綠色類群＞黃色類群。

表6 遺傳結(jié)構(gòu)圖中各分類群的多樣性統(tǒng)計(jì)Tab.6 Diversity statistics of groups in structure graph

2.5 不同地區(qū)黍稷的主成分分析

從圖4可以看出，前3個(gè)主要組件PC1（Dim-1）、PC2（Dim-2）、PC3（Dim-3）分別解釋總方差的14.80%、5.04%、4.31%，這些主要組件累積解釋了24.15%的遺傳變異。PC將北方春糜子區(qū)的所有黍稷試材劃分為了4個(gè)類群，第1類群共13份，全部來自青海；第2類群共10份，全部來自甘肅；第3類群共17份，其中包括內(nèi)蒙古的全部試材，1份甘肅試材和2份山西試材；第4類群共8份，全部來自山西，這與聚類分析結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論與討論

劉笑瑜等[31]通過6對(duì)黍稷特異性SSR對(duì)40份黍稷種質(zhì)資源進(jìn)行研究，共檢測出20個(gè)等位基因變異，平均多樣性指數(shù)為0.54，PIC平均值為0.34。連帥等[32]從162對(duì)SSR引物中篩選出了63對(duì)具有多態(tài)性的引物，利用這些多態(tài)性引物檢測出161種等位變異，平均多樣性指數(shù)為0.627 5，PIC平均值為0.485 5。王瑞云等[33]用85對(duì)高基元SSR擴(kuò)增96份國內(nèi)黍稷資源，共檢測出232個(gè)等位變異位點(diǎn)，平均多樣性指數(shù)為0.770 8，PIC平均值為0.472 3。本試驗(yàn)用80對(duì)SSR引物檢測分析后得到206個(gè)等位變異位點(diǎn)，平均為2.575個(gè)；多樣性指數(shù)為0.665 5~1.078 6，平均為0.860 8，PIC平均值為0.453 6。本研究的PIC值比劉笑瑜等[31]的PIC值高，可能是由于本次試驗(yàn)材料比較單一。但本研究發(fā)現(xiàn)，RYW111的各遺傳參數(shù)都比較高，尤其是PIC值，說明RYW111有很好的遺傳變異潛力。本研究與連帥等[32]相比較平均PIC值較低，主要是由于本試驗(yàn)材料選自一個(gè)生態(tài)區(qū)，而連帥等[32]選取的國內(nèi)外黍稷資源來自不同生態(tài)區(qū)，遺傳差異較大，遺傳背景較為豐富。本研究與王瑞云等[33]相比平均PIC值較低，主要是由于王瑞云等[33]試材地理來源差異顯著。

王瑞云等[34]根據(jù)遺傳距離，用15個(gè)標(biāo)記將132份黍稷材料進(jìn)行UPGMA聚類，共分為4個(gè)群組，包括群組Ⅰ（北方春糜子區(qū)）、群組Ⅱ（黃土高原春、東北春糜子區(qū)、夏糜子區(qū)、北方夏糜子區(qū)和北方春糜子區(qū)）、群組Ⅲ（黃土高原春、夏糜子區(qū)）、群組Ⅳ（黃土高原春、北方春糜子區(qū)、夏糜子區(qū)、東北春糜子區(qū)）。連帥等[32]將192個(gè)材料劃分為10個(gè)參試群體，采用UPGMA法繪制了樹狀聚類圖，發(fā)現(xiàn)其遺傳距離頻率在0.06~0.37，頻率為0.09時(shí)將所有參驗(yàn)材料分為三大群組，發(fā)現(xiàn)地理位置差異對(duì)聚類分析有一定影響。本研究則利用UPGMA將北方春糜子區(qū)的48份試材劃分為3個(gè)主要類群，發(fā)現(xiàn)以UPGMA為依據(jù)劃分的第3類群包括來自甘肅、內(nèi)蒙古、青海、山西的材料，而來自青海的材料在3個(gè)類群中都有分布?；赟tructure的聚類結(jié)果表明，第1類群、第2類群、第3類群都包括甘肅、內(nèi)蒙古、青海、山西的材料，第4類群包括青海、內(nèi)蒙古、山西的材料，4個(gè)類群中都有青海、內(nèi)蒙古、山西的材料。一般來說，北方春糜子區(qū)的每個(gè)省份都有相對(duì)清晰的群體結(jié)構(gòu)，與其地理起源基本一致，與BONMAN等[35]、王舒婷等[36]關(guān)于大宗作物和山西黍稷的研究結(jié)果一致。結(jié)果表明，從類群Ⅰ到類群Ⅲ的遺傳參數(shù)有著明顯的差異，還可以清楚地看出各選材的親緣關(guān)系，但群體之間有少數(shù)交叉現(xiàn)象，與王瑞云等[34]具有類似的結(jié)果，材料地理來源對(duì)聚類有一定的影響。HUNT等[18]用16個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)98份黍稷地方品種進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)的分析，聚類分析發(fā)現(xiàn)，每個(gè)集群都顯示出明確的地理相關(guān)。本研究用Structure 2.2對(duì)結(jié)果進(jìn)行聚類分析，在K=2時(shí)，將材料劃分為2個(gè)類群，K=4時(shí)，劃分4個(gè)類群。其結(jié)果也表明，遺傳距離聚類與地理來源有關(guān)。

本試驗(yàn)的48份資源可以劃分為4個(gè)類群，群組劃分的結(jié)果與試材來源省份密切相關(guān)。紅色類群收集的青海黍稷更多，多樣性指數(shù)和PIC值更高，而黃色類群收集的山西黍稷資源更多，多樣性指數(shù)和PIC值較低，這表明青海與山西間遺傳結(jié)構(gòu)有很大差異。總體而言，紅色類群的遺傳多樣性參數(shù)為最高；黃色類群的遺傳多樣性參數(shù)都為最低。結(jié)果表明，青海材料的遺傳多樣性較豐富，而山西材料的遺傳多樣性較低一些。

本研究結(jié)果表明，80對(duì)高基元SSR引物可檢測北方春糜子區(qū)48個(gè)黍稷材料的多態(tài)性；青海省黍稷種質(zhì)資源的遺傳多樣性參數(shù)最為豐富，遺傳背景更為復(fù)雜；遺傳聚類群與參試材料地理來源基本一致。