除草劑脅迫下谷子雜交種和常規(guī)種保護(hù)酶活性的比較

朱紅燕，任永康，孫 然

（1.山西新威科農(nóng)業(yè)科技有限公司，山西 太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太原 030031；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，山西 太原 030006）

谷子原產(chǎn)于我國，歷史悠久，享有“百谷之長” 的美稱[1-2]，是人們十分喜愛的小雜糧作物。米粒營養(yǎng)豐富[3-5]，藥用價(jià)值尚高[6]，內(nèi)含10%左右的蛋白質(zhì)，1.7%左右的脂肪和各類維生素和胡蘿卜素以及有機(jī)元素[7]。谷子在生長過程中如遇陰雨連綿的天氣便很容易形成草荒，對(duì)此又很難防治。雜草危害十分嚴(yán)重，不僅加大了田間作業(yè)的勞動(dòng)強(qiáng)度，而且還嚴(yán)重影響了雜交谷的產(chǎn)量和品質(zhì)，因此，研究化學(xué)除草技術(shù)勢(shì)在必行[8-9]。任建躍[10]研究了除草劑處理土壤對(duì)晉谷32號(hào)谷子生物特性的影響，結(jié)果表明，乙草胺100 mL/hm2+嗪草酮3.3 g/hm2對(duì)谷子生長無影響，其余除草劑則對(duì)谷子生長發(fā)育不安全。王鑫等[11]探究了不同濃度單嘧磺隆對(duì)谷子營養(yǎng)價(jià)值的影響，結(jié)果表明，隨著單嘧磺隆濃度的提高，谷子成熟籽粒中脂肪含量逐漸下降，總淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉含量逐漸上升。武翠卿[12]研究了除草劑對(duì)谷子生長發(fā)育的影響及其殺草效果，結(jié)果表明，當(dāng)植物處于除草劑脅迫條件下，晉谷32號(hào)過氧化物酶系統(tǒng)受傷害的程度較小，體內(nèi)過氧化物酶（POD）的活性增大從而會(huì)保護(hù)或恢復(fù)膜的完整性。李萍等[13]研究了不同谷子品種對(duì)除草劑的耐受性，結(jié)果表明，施用撲草凈之后，晉谷32號(hào)POD酶活性有所提高，對(duì)撲草凈有一定的耐藥性。解麗麗[14]研究了除草劑對(duì)谷子生長特性和產(chǎn)量性狀的影響，結(jié)果表明，張雜谷10號(hào)POD的活性隨著烯禾啶的濃度先升高后下降，得出了除草劑作用下的最適濃度。幼苗對(duì)除草劑的脅迫都是敏感的，外界脅迫下，谷子有相應(yīng)的保護(hù)系統(tǒng)進(jìn)行及時(shí)防御與應(yīng)對(duì)，作為保護(hù)酶的超氧化物岐化酶（SOD），過氧化物酶（POD），過氧化氫酶（CAT）具有較強(qiáng)的抗氧化性，可以解離谷子內(nèi)因外壓產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞膜等生物大分子具有破壞作用的活性氧爆發(fā)，從而預(yù)防脅迫危害，加強(qiáng)谷子對(duì)除草劑的抗逆性，主要表現(xiàn)在保護(hù)酶含量的變化上。近年來，除草劑脅迫下谷子雜交種與常規(guī)種保護(hù)酶活性比較的研究還鮮見報(bào)道。

烯禾啶殺草譜廣，易溶于有機(jī)溶劑，無腐蝕性，能有效防除多種1年生雜草和多年生雜草，本研究通過2因素4水平試驗(yàn)，探究不同烯禾啶濃度下張雜谷5號(hào)、張雜谷13號(hào)、晉谷21號(hào)和晉谷59號(hào)中SOD、POD和CAT的保護(hù)酶含量，旨在為谷田除草劑的大面積應(yīng)用和雜交谷的大力推廣提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2018年5—9月進(jìn)行，試驗(yàn)地設(shè)在山西省晉中市榆次區(qū)什貼鎮(zhèn)山莊頭村試驗(yàn)田（東經(jīng)112.86°，北緯為37.81°），試驗(yàn)地前茬作物為馬鈴薯。該地土壤基本理化性質(zhì)為：pH值8.2，有機(jī)質(zhì)含量18.3 g/kg，全氮含量0.92 g/kg，堿解氮含量78 mg/kg，全磷含量0.66 g/kg，速效磷含量18 mg/kg，全鉀含量25.7 g/kg，速效鉀含量105 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)材料

供試品種為張雜谷5號(hào)、張雜谷13號(hào)、晉谷21號(hào)和晉谷59號(hào)。試驗(yàn)用的除草劑是湖北恒景瑞化有限公司生產(chǎn)的12.5%烯禾啶乳油。

1.3 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用2因素4水平完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，共16個(gè)處理組合，隨機(jī)安排小區(qū)，試驗(yàn)區(qū)周圍設(shè)保護(hù)行，每個(gè)處理重復(fù)3次。播前統(tǒng)一灌水，統(tǒng)一旋耕。待3~5葉期時(shí)根據(jù)設(shè)計(jì)密度統(tǒng)一間苗、定苗。待6~7葉期時(shí)，谷子分別噴施4種濃度梯度的12.5%烯禾啶乳油：0（清水對(duì)照）、1.25、2.50、5.00 mL/L。其中，2.5 mL/L為12.5%烯禾啶乳油除草劑的產(chǎn)品推薦使用濃度。7 d后，分別稱取4個(gè)不同品種谷子的葉片待用。每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.4.1 超氧化物岐化酶（SOD）活性測(cè)定 SOD活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑光化還原法[15]。取0.6 g谷子的莖葉于研缽中，加入7.5 mL的磷酸緩沖液以及少量的二氧化硅和碳酸鈣，研磨成漿，過濾后加入緩沖液于10 mL離心管中離心10 min。取保護(hù)酶上清液均分在3個(gè)離心管中，分別為POD、SOD和CAT酶提取液。用上述相同的方法分別處理4個(gè)不同品種谷子4個(gè)濃度的莖葉，將酶提取液置于0~4℃的冰箱中待用。

標(biāo)準(zhǔn)組依次加入下列溶液：2 mL的磷酸緩沖液，0.2 mL的甲硫氨酸溶液，0.2 mL的氮藍(lán)四唑溶液，0.2 mL的EDTA-Na2，0.2 mL的核黃素，0.2 mL的蒸餾水，總體積為3 mL。試驗(yàn)組加溶液的順序依次為：2 mL的SOD酶提取液，0.2 mL的甲硫氨酸溶液，0.2 mL的氮藍(lán)四唑溶液，0.2 mL的EDTA-Na2，0.2 mL的核黃素，0.2 mL的蒸餾水，總體積為3 mL。處理后將所有試管于日光燈下反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后，分別測(cè)定各試管560 nm波長下的吸光度值。

式中，A0為標(biāo)準(zhǔn)組的吸光度值；AS為試驗(yàn)組的消光度值；VT為反應(yīng)總體積3 mL；V1為反應(yīng)中SOD酶提取液的用量（2 mL）；W為谷子莖葉鮮質(zhì)量（0.2 g）。

用公式（1）對(duì)16組試驗(yàn)數(shù)據(jù)與一組標(biāo)準(zhǔn)組數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算與整理。

1.4.2 過氧化物酶（POD）活性測(cè)定 過氧化物酶（POD）活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[16-17]。取光徑1 cm的比色杯，一支為對(duì)照組，加入磷酸緩沖液0.1 mL，反應(yīng)混合液2 mL；另16支為試驗(yàn)組，各加入POD酶液0.1 mL，反應(yīng)混合液2 mL。在波長470 nm下測(cè)定OD值，酶活性用每分鐘吸光度變化值表示。

式中，ΔA為某時(shí)間內(nèi)吸光值的變化量；V為提取POD酶提取液的總體積（3 mL）；W為谷子莖葉鮮質(zhì)量（0.2 g）；Vt為反應(yīng)中POD酶提取液的用量（0.1 mL）。

1.4.3 過氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定 過氧化氫酶（CAT）活性的測(cè)定采用高錳酸鉀滴定法[18]。試驗(yàn)組錐形瓶中各依次加入酶提取液1.5 mL，雙氧水1.5 mL；標(biāo)準(zhǔn)組錐形瓶中依次加入磷酸緩沖液1.5 mL，雙氧水1.5 mL。2組同時(shí)保溫一段時(shí)間后各加入1.5 mL的硫酸，分別用高錳酸鉀滴定法，記錄各試驗(yàn)組出現(xiàn)顏色變化的時(shí)間。

式中，A為標(biāo)準(zhǔn)組高錳酸鉀滴定量；B為試驗(yàn)組高錳酸鉀滴定量；VT為提取CAT酶液的總體積（3 mL）；VS為反應(yīng)中CAT酶提取液的用量（1.5 mL）；W為谷子莖葉鮮質(zhì)量（0.2 g）；t為試驗(yàn)組反應(yīng)的時(shí)間。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與研究，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析；采用Tukey法進(jìn)行多重比較（P＜0.05和P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種之間谷子保護(hù)酶（SOD、POD和CAT）活性的比較

在清水處理中，張雜谷5號(hào)的POD和SOD保護(hù)酶活性顯著高于其他3種谷子，晉谷21號(hào)的CAT保護(hù)酶活性顯著高于其他3種谷子（P＜0.01）（表1）。

通過方差分析得到不同品種之間谷子的3種保護(hù)酶活性都存在極顯著差異（P＜0.01）,多重比較結(jié)果顯示（表1），在5%顯著水平上，張雜谷13號(hào)和晉谷59號(hào)的CAT保護(hù)酶活性不存在顯著性差異，但張雜谷5號(hào)的CAT保護(hù)酶活性同晉谷21號(hào)相比較，存在顯著的差異（P＜0.05）；張雜谷13號(hào)的SOD保護(hù)酶活性同晉谷21號(hào)相比較，無顯著性差異，但張雜谷5號(hào)的SOD保護(hù)酶活性同晉谷59號(hào)相比較，存在顯著性差異（P＜0.05）；4種谷子的POD保護(hù)酶活性都存在顯著差異（P＜0.05），并且POD保護(hù)酶活性由高到低的順序?yàn)閺堧s谷5號(hào)＞晉谷21號(hào)＞張雜谷13號(hào)＞晉谷59號(hào)。4種谷子的SOD保護(hù)酶活性由高到低的順序?yàn)閺堧s谷5號(hào)＞晉谷21號(hào)＞張雜谷13號(hào)＞晉谷59號(hào)。4種谷子的CAT保護(hù)酶活性由高到低順序?yàn)闀x谷21號(hào)>張雜谷5號(hào)>晉谷59號(hào)>張雜谷13號(hào)。

表1 不同品種之間3種保護(hù)酶活性Tukey法多重比較結(jié)果Tab.1 Multiple comparison results of activities of three protective enzymes between different foxtail millet varieties by Tukey method

2.2 不同烯禾啶濃度下谷子保護(hù)酶（SOD、POD和CAT）活性的比較

4種谷子的POD和SOD保護(hù)酶活性的平均值隨著烯禾啶濃度的升高逐漸增強(qiáng)，CAT酶活性隨著烯禾啶濃度的升高先增強(qiáng)后降低（表2）。

通過方差分析可以得出，不同烯禾啶濃度下谷子的3種保護(hù)酶活性都存在極顯著差異（P＜0.01）。由表2可知，在5%顯著水平上，4種除草劑濃度下3種保護(hù)酶活性均存在顯著性差異（P＜0.05）。其中，POD保護(hù)酶活性和SOD保護(hù)酶活性在5 mL/L的12.5%烯禾啶乳油濃度下顯著高于其他濃度（P＜0.05）；CAT保護(hù)酶活性在1.25 mL/L的12.5%烯禾啶乳油濃度下顯著高于其他濃度（P＜0.05）；谷子3種保護(hù)酶活性在清水對(duì)照下顯著低于施用除草劑的各處理（P＜0.05）。綜上可以得出，5 mL/L的12.5%烯禾啶乳油濃度下POD和SOD酶活性最佳；1.25 mL/L的12.5%烯禾啶乳油濃度下CAT酶活性最佳；清水對(duì)照下，3種保護(hù)酶活性均最低。

表2 不同烯禾啶濃度下3種保護(hù)酶活性Tukey法多重比較結(jié)果Tab.2 Multiple comparison results of activities of three protective enzyme under different concentrations of sethoxydim by Tukey method

2.3 不同烯禾啶濃度下不同品種之間谷子保護(hù)酶（SOD、POD和CAT）活性的比較

不同烯禾啶濃度下不同谷子品種之間3種保護(hù)酶活性存在顯著差異（P＜0.05），張雜谷5號(hào)的POD和SOD保護(hù)酶活性在12.5%烯禾啶乳油5 mL/L濃度下最高；晉谷21號(hào)CAT酶活性在除草劑1.25 mL/L濃度下最高；4種谷子3種保護(hù)酶活性在清水對(duì)照處理均最低（表3）。

表3 不同烯禾啶濃度下不同品種之間谷子3種保護(hù)酶活性多重比較結(jié)果Tab.3 Multiple comparison of activities of three protective enzymes in foxtail millet under different concentrations of sethoxydim

進(jìn)行多重比較分析得出（表3），在5%顯著水平上，不同烯禾啶濃度下不同品種之間谷子3種保護(hù)酶活性都存在顯著性差異。由表3可知，5 mL/L的12.5%烯禾啶乳油處理張雜谷5號(hào)組合POD與SOD酶活性顯著高于其他組合。晉谷59號(hào)清水處理的POD酶活性顯著低于其他谷子品種（P＜0.05）；張雜谷13號(hào)清水處理的SOD酶活性顯著低于其他谷子品種；1.25 mL/L的12.5%烯禾啶乳油處理晉谷21號(hào)組合CAT酶活性顯著高于其他組合，張雜谷13號(hào)清水處理的CAT酶活性顯著低于其他品種（P＜0.05）。

通過表3具體分析，在4個(gè)濃度梯度下，每種谷子的POD和SOD保護(hù)酶活性都會(huì)隨烯禾啶濃度的增加而增加，CAT保護(hù)酶活性都會(huì)隨禾啶濃度的增加先增加后下降。當(dāng)4個(gè)谷種都處于12.5%烯禾啶乳油5 mL/L濃度時(shí)，張雜谷5號(hào)的POD和SOD保護(hù)酶活性顯著高于其他品種（P＜0.05）；12.5%烯禾啶乳油1.25 mL/L濃度時(shí)，晉谷21號(hào)的CAT保護(hù)酶活性顯著高于其他品種（P＜0.05），且4種谷種在清水對(duì)照下3種保護(hù)酶活性均最低。

3 結(jié)論與討論

除草劑作為外界干擾元素之一，會(huì)對(duì)谷子直接或間接產(chǎn)生破壞與威脅，此時(shí)SOD、POD和CAT作為保護(hù)酶系統(tǒng)之一，會(huì)相應(yīng)作出保護(hù)與防衛(wèi)。其中，SOD和POD保護(hù)酶都能夠有效地清除谷子體內(nèi)有害的自由基O2-，生成對(duì)谷子無害的氧氣和毒害較低的過氧化氫；CAT保護(hù)酶對(duì)在SOD和POD保護(hù)酶作用下形成的過氧化氫進(jìn)行催化與解離，最終使植物機(jī)能系統(tǒng)達(dá)到環(huán)境安全與動(dòng)態(tài)平衡的水準(zhǔn)。3種保護(hù)酶的存在不僅促進(jìn)了谷子的良好發(fā)育，而且高效地提高了谷子的抗逆性，作用舉足輕重。

據(jù)了解，對(duì)植物體內(nèi)保護(hù)酶活性的試驗(yàn)研究較多。解麗麗[14]研究得出，隨著除草劑12.5%烯禾啶乳油濃度的增加和處理時(shí)間的延長，張雜谷5號(hào)的POD和SOD保護(hù)酶活性不斷提高，而晉谷21號(hào)隨烯禾啶濃度的增加和處理時(shí)間的延長，谷子幾乎接近死亡狀態(tài)。但在早期處理的情況下，這2種谷種的CAT保護(hù)酶活性都出現(xiàn)了頂值現(xiàn)象，呈現(xiàn)倒U形的趨勢(shì)。而且這2種谷子在除草劑為0 mL/L濃度下，3種保護(hù)酶的活性均最低。與本研究結(jié)果相似。雜交谷的抗逆性優(yōu)于常規(guī)谷，這為雜交谷的廣泛推廣與大面積栽培奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

張雜谷5號(hào)的POD與SOD酶活性隨著烯禾啶濃度的升高而增強(qiáng)，且在最高的2倍濃度下活性最高，表明當(dāng)谷子受到外界強(qiáng)烈脅迫與刺激時(shí)，POD與SOD酶能迅速對(duì)干擾作出攻擊，高強(qiáng)度的解離系統(tǒng)內(nèi)經(jīng)脅迫產(chǎn)生的毒害自由基[19]，使系統(tǒng)處于平衡適應(yīng)性狀態(tài)，由此可見，雜交谷的育成可以顯著提高抗性與耐性，為雜交谷的大力推廣作出了事實(shí)依據(jù)。晉谷21號(hào)的CAT酶活性最佳，且在12.5%烯禾啶乳油1.25 mL/L濃度下活性極強(qiáng)。作為新推出的優(yōu)質(zhì)米，適宜除草劑濃度下，CAT酶發(fā)揮了應(yīng)有盡有的防御功能，為常規(guī)谷的大面積種植，高產(chǎn)量培育，適度性抗逆提供了參考價(jià)值與實(shí)用意義。當(dāng)谷子內(nèi)部POD、SOD和CAT保護(hù)酶活性不高時(shí)，受外界脅迫的情況下就會(huì)積累大量有害的自由基，造成系統(tǒng)紊亂，以至于抗性降低，影響谷子的正常發(fā)育。在4個(gè)除草劑濃度梯度下，每種谷子的POD和SOD酶活性都會(huì)隨濃度的增加而增加，CAT酶活性都會(huì)隨濃度的增加先增加后下降，出現(xiàn)這樣的原因可能是因?yàn)镻OD和SOD保護(hù)酶在極惡劣的脅迫下，發(fā)揮的防御作用越大越明顯；而CAT保護(hù)酶自身受脅迫的影響，起始會(huì)出現(xiàn)最適宜的效果，隨著脅迫的增強(qiáng)而作用降低。