光照對(duì)紫葉稠李花色素苷合成調(diào)控通路的影響

馬 赫,蔡建超,張克中,崔金騰

(北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院/城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室/北京市鄉(xiāng)村景觀規(guī)劃設(shè)計(jì)工程技術(shù)研究中心,北京 102206)

紫葉稠李(Padus virginiana)是薔薇科稠李屬落葉喬木,株高10—14 m,是一種珍貴的彩葉樹(shù)種,在我國(guó)北方,氣溫達(dá)到一定程度,紫葉稠李的初生葉由綠色逐漸轉(zhuǎn)為紫紅色,葉色靚麗極具觀賞價(jià)值[1-2]。

植物葉色變化主要由色素含量的相對(duì)變化引起,花青素是植物體內(nèi)的天然色素[3],可以遮擋部分強(qiáng)光,幫助植物抵御環(huán)境脅迫,降低光合作用對(duì)葉片的傷害[4],朱書(shū)香等[5]通過(guò)研究4種李屬植物,發(fā)現(xiàn)花色素苷能夠形成“光屏障”,吸收植物體內(nèi)的過(guò)剩光,緩解強(qiáng)光對(duì)植物光合作用的影響。

花青素的合成以苯丙氨酸為底物,經(jīng)酶促反應(yīng)、糖基化、?；冗^(guò)程最終達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),參與合成的有PAL、CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR、ANS、UFGT等結(jié)構(gòu)基因及MYB、bHLH、WD40等轉(zhuǎn)錄因子[6]。MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物積累花青素具有重要意義,可通過(guò)調(diào)控花色素苷水平調(diào)控蘋(píng)果果皮的紅色和綠色條紋[7]。在楊樹(shù)中,MYB6正向調(diào)控花青素和單寧生物合成。MYB、bHLH和WD40互作可形成三元復(fù)合物,參與調(diào)節(jié)晚期類(lèi)黃酮生物合成基因的表達(dá)[8]。

本研究基于花青素光保護(hù)理論對(duì)紫葉稠李進(jìn)行遮光處理,結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析,對(duì)花青素合成通路上的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因和MYB家族轉(zhuǎn)錄因子MYB6和MYB10進(jìn)行驗(yàn)證,以期為紫葉稠李花色素苷調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

北京農(nóng)學(xué)院實(shí)踐基地中陸地生長(zhǎng)的2年生紫葉稠李(Padus virginiana)扦插苗。

1.2 遮光處理

選取長(zhǎng)勢(shì)良好的紫葉稠李60棵,30棵進(jìn)行20%光照處理(采用80%遮陽(yáng)網(wǎng)),另外30棵在自然條件全光照下生長(zhǎng)。試驗(yàn)期間,進(jìn)行常規(guī)管理,保持植株長(zhǎng)勢(shì)良好。遮光處理前1 d采集1次葉片,采集部位為頂端倒3葉,命名為Day0,處理30 d后,再分別采集1次葉片,20%光照處理組命名為ST_Day30,自然條件全光照處理組命名為Day30。試驗(yàn)時(shí)間為2019年4月至5月。

1.3 葉色參數(shù)測(cè)定

采用柯尼卡美能達(dá)(中國(guó))投資公司的色彩色差計(jì)(CR-400/410)測(cè)定葉色參數(shù),L*表示照度,相當(dāng)于亮度,L*的值域由0到100,表示由黑色向白色轉(zhuǎn)變。a*和b*的值域都是-127至+128,a*表示由綠色向紅色轉(zhuǎn)變;b*表示由藍(lán)色向黃色轉(zhuǎn)變,所有顏色以這三個(gè)值交互變化表示。

1.4 花色素苷含量測(cè)定

采用鹽酸提取比色法測(cè)定花色素苷含量[5],稱(chēng)取植物樣品0.50 g,置于離心管中,加0.1 mol/L鹽酸溶液20 mL,使樣品完全浸于溶液中,置于32℃恒溫箱中浸提8 h,使用光徑1 cm的比色皿,以0.1 mol/L鹽酸為空白對(duì)照,測(cè)量波長(zhǎng)530 nm下的吸光值?；ㄉ剀蘸?mg/L)=A(530)/0.1×樣品質(zhì)量(g)

1.5 RNA的提取和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

使用北京艾德萊生物科技有限公司EASYspin Plus RNA快速提取試劑盒,提取紫葉稠李葉片總RNA。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。使用Nanodrop2000檢測(cè)RNA的濃度和純度。采用Illumina Hiseq 2500進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.6 基因功能注釋、轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)和差異基因分析

將拼接得到Unigene序列與Nr、Swiss-Prot、Pfam、KOG、GO和KEGG六大數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)獲得功能注釋,與PlantTFDB數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得到轉(zhuǎn)錄因子信息,利用DEGseq進(jìn)行組間差異表達(dá)分析,通過(guò)與GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),獲得差異基因的功能注釋及通路注釋。

1.7 關(guān)鍵基因的qRT-PCR

使用北京全式金生物技術(shù)有限公司試劑盒TransScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SupperMix將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,PCR程序設(shè)定為:55℃30 min,85℃5 s。使用北京全式金生物技術(shù)有限公司試劑盒TransScripTtop Green qPCR SupperMix配置熒光定量體系,qPCR程序設(shè)定為:94℃30 s,94℃5 s,60℃10 s,70℃10 s,45 cycles。所用引物見(jiàn)表1。根據(jù)富集結(jié)果篩選出花色素苷代謝通路PAL、CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR、ANS、UFGT八個(gè)關(guān)鍵功能基因及轉(zhuǎn)錄因子MYB6和MYB10并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析。

表1 引物序列Table 1 Primers and sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 遮光對(duì)紫葉稠李葉色參數(shù)的影響

光照是影響彩葉植物葉色變化的重要環(huán)境因子之一,在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中,植物通過(guò)改變形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化等方式應(yīng)對(duì)復(fù)雜的光環(huán)境[1]。由圖1和圖2可知,自然全光照的葉片由綠色變?yōu)樽霞t色,80%遮光處理30 d后的紫葉稠李葉片并未完全變色,與全光照30 d的葉片相比,a*值減小,b*值增加,葉片亮度L*值增強(qiáng),葉面與葉背顏色不同,葉面偏綠色,葉背偏紫紅色。

圖1 光照強(qiáng)度對(duì)紫葉稠李葉片顏色變化的影響Fig.1 Effects of light intensity on leaf color change of Padus virginiana

圖2 遮光對(duì)紫葉稠李葉色參數(shù)的影響Fig.2 Effects of shading on leaf color parameters of Padus virginiana

2.2 遮光對(duì)紫葉稠李葉片中花色素苷含量的影響

光照可通過(guò)促進(jìn)可溶性糖的積累來(lái)激活花色素苷合成的某些酶類(lèi),從而促進(jìn)花色素苷的合成。全光照30 d后葉片花色素苷含量顯著提高,而遮光處理30 d的葉片,花色素苷雖然也有積累,但伴隨著光照強(qiáng)度的減弱,積累量明顯小于全光照組(圖3)。

圖3 遮光對(duì)紫葉稠李葉片花色素苷含量的影響Fig.3 Effects of shading on the anthocyanin content of Padus virginiana

2.3 紫葉稠李轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量統(tǒng)計(jì)

對(duì)Day0、Day30、ST_Day30三個(gè)試驗(yàn)組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,設(shè)置兩次重復(fù),總共獲得145.87GB的Clean Data,具體結(jié)果見(jiàn)表2。Day0、Day30、ST_Day30分別獲得Clean reads 102 560 220、118 348 698、112 063 772,單次重復(fù)獲得的Clean reads大于46 931 024,N50值1 266 bp,Q20值超過(guò)98%,Q30值超過(guò)94%,GC含量處于46%—47.1%,無(wú)AT和GC分離,測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。圖4顯示,Unigene的長(zhǎng)度分布于1—400區(qū)間的最多,達(dá)到了40 000以上,隨著分布區(qū)間的變長(zhǎng),數(shù)量逐漸減少。

圖4 紫葉稠李Unigene長(zhǎng)度分布Fig.4 Length distribution of Unigenes of Padus virginiana

表2 質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Quality control data statistics

2.4 紫葉稠李轉(zhuǎn)錄組Unigene的功能注釋

本試驗(yàn)中紫葉稠李為無(wú)參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,將該次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的所有轉(zhuǎn)錄本與六大數(shù)據(jù)庫(kù)(NR,Swiss-Prot,Pfam,COG,GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù))進(jìn)行比對(duì),E-value值設(shè)為1e-3,Unigene所占比例分別為52.3 %、42.83%、34.8%、10.17%、20.62%、27.41%、58.62%,Unigene在NR和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)占比最高(表3)。

表3 Unigene與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果Table 3 Comparison of Unigene and six databases

NCBI_NR為綜合數(shù)據(jù)庫(kù),其中包含Swiss-Prot、PIR、PRF、PDB等蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中非冗余的數(shù)據(jù)以及從GenBank和RefSeq的CDS數(shù)據(jù)庫(kù)中翻譯所得的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)。通過(guò)與NR數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì),可以查看紫葉稠李轉(zhuǎn)錄本序列與相近物種的相似情況,以及同源序列的功能信息。NR注釋顯示紫葉稠李與歐李(Prunus avium,31%)、桃(Prunus persica,24.17%)、梅(Prunus mume,14.52%)3個(gè)物種同源關(guān)系最近(圖5)。

圖5 紫葉稠李NR庫(kù)比對(duì)物種分布占比Fig.5 Distribution of species distribution in Padus virginiana NR library

2.5 遮光對(duì)紫葉稠李基因表達(dá)的影響

設(shè)置Day30_vs_ST_Day30、Day0_vs_Day30、Day0_vs_ST_Day30三個(gè)組件對(duì)比分析。對(duì)不同樣品間的raw counts進(jìn)行基于TMM方法的標(biāo)準(zhǔn)化,默認(rèn)利用DEGseq軟件進(jìn)行組間差異表達(dá)分析,默認(rèn)閾值:padjust＜0.05&|log2FC|＞=1。以基因在兩個(gè)樣本間表達(dá)差異的倍數(shù)變化值為橫坐標(biāo),P值為縱坐標(biāo),繪制差異基因表達(dá)火山圖(圖6),從圖中可看出,Day30_vs_ST_Day30差異表達(dá)基因共2 432條,其中上調(diào)1 396條,下調(diào)1 036條;Day0_vs_Day30差異表達(dá)基因共2 811條,其中上調(diào)806條,下調(diào)2 005條;Day0_vs_ST_Day30差異表達(dá)基因共3 368條,上調(diào)1 376條,下調(diào)1 992條。

圖6 遮光處理下紫葉稠李差異基因表達(dá)分析Fig.6 The analysis of differential gene expression of Padus virginiana in shading

通過(guò)與GO數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),對(duì)紫葉稠李的差異基因按照其細(xì)胞組分(Cellular Component)、分子功能(Molecular Function)和參與的生物過(guò)程(Biological Process)進(jìn)行分類(lèi)注釋,篩選顯著富集在前20位的Go Term繪制折線圖(圖7),設(shè)置篩選參數(shù)P值(FDR)＜0.05,由圖7可知,Day30 vs ST_Day30有1 125條基因富集到177個(gè)GO term中,其中,主要富集在細(xì)胞大分子代謝過(guò)程(Cellular macromolecule metabolic process)、細(xì)胞過(guò)程(Cellular process)、細(xì)胞內(nèi)部分(Intracellular part)、氧化還原過(guò)程(Oxidation-reduction process)、氧化還原酶活性(Oxidoreductase activity)、氮化合物代謝過(guò)程(Nitrogen compound metabolic process);Day0 vs Day30有1 396條基因富集到211個(gè)GO term中,其中,主要富集在碳水化合物代謝過(guò)程(Carbohydrate metabolic process)、細(xì)胞碳水化合物代謝過(guò)程(Cellular carbohydrate metabolic process)、多糖代謝過(guò)程(Polysaccharide metabolic process)、細(xì)胞壁組織(Cell wall organization)、細(xì)胞多糖代謝過(guò)程(Cellular polysaccharide metabolic process)、細(xì)胞外區(qū)域(Extracellular region)、蛋白質(zhì)復(fù)合物(Protein complex)、外部封裝結(jié)構(gòu)(External encapsulating structure);Day0 vs ST_Day30有1 069條基因富集到215個(gè)GO term中,其中,主要富集在催化活性(Catalytic activity)、細(xì)胞內(nèi)部分(Intracellular part)、氧化還原過(guò)程(Oxidation-reduction process)。

圖7 遮光處理下紫葉稠李差異基因GO富集分析Fig.7 The analysis of differentially expressed genes in GO enrichment of Padus virginiana in shading

通過(guò)與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),獲得紫葉稠李的基因或轉(zhuǎn)錄本對(duì)應(yīng)的KO編號(hào),根據(jù)KO編號(hào)獲得Unigene可能參與的具體生物學(xué)通路情況。紫葉稠李KEGG注釋到遺傳信息處理(Genetic Information Processing),代謝(Metabolism),環(huán)境信息處理(Environmental Information Processing),細(xì)胞過(guò)程(Cellular Processes),生物體系統(tǒng)(Organismal Systems)等通路,篩選顯著富集在前10位的差異基因繪制KEGG代謝通路氣泡圖(圖8),設(shè)置篩選參數(shù)P值(FDR)＜0.05。在Day30 vs ST_Day30顯著富集在前10位的代謝通路中,苯丙氨酸代謝(Phenylalanine metabolism)、淀粉和蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism)、氰氨基酸代謝(Cyanoamino acid metabolism)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Plant hormone signal transduction)、脂肪酸生物合成(Fatty acid biosynthesis)5條代謝途徑富集的差異基因較多,分別為50、38、27、38和15個(gè)差異基因;Day0 vs Day30顯著富集在前10位的代謝通路中,苯丙烷類(lèi)生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)、氨基糖和核苷酸糖代謝(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Plant hormone signal transduction)、脂肪酸生物合成(Fatty acid biosynthesis)和氰氨基酸代謝(Cyanoamino acid metabolism)5條代謝途徑富集的差異基因較多,分別為40、32、32、24和24個(gè)差異基因;Day0 vs ST_Day30顯著性富集在前10位的代謝通路中,苯丙烷類(lèi)生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)、脂肪酸生物合成(Fatty acid biosynthesis)、淀粉和蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism)、氨基糖和核苷酸糖代謝(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)和類(lèi)黃酮生物合成(Flavonoid biosynthesis)5條代謝途徑富集的差異基因較多,分別為36、27、46、36和18個(gè)差異基因。

圖8 遮光處理下紫葉稠李差異基因KEGG富集分析Fig.8 The analysis of differential expression gene KEGG enrichment of Padus virginiana in shading

Day0 vs ST_Day30有279條差異基因顯著富集到14條代謝通路上,為苯丙烷類(lèi)生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)、脂肪酸生物合成(Fatty acid biosynthesis)、淀粉和蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism)、氨基糖和核苷酸糖代謝(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、類(lèi)黃酮生物合成(Flavonoid biosynthesis)代謝途徑。

2.6 紫葉稠李轉(zhuǎn)錄因子統(tǒng)計(jì)

轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)能與基因5’端上游特定序列專(zhuān)一性結(jié)合,調(diào)控目的基因以特定強(qiáng)度在特定時(shí)空表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。通過(guò)與PlantTFDB 4.0數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),得到紫葉稠李轉(zhuǎn)錄因子1 261條,其中MYB超級(jí)家族最多,共有213條,占總數(shù)的17%,數(shù)量是其他轉(zhuǎn)錄因子的兩倍以上,AP2/ERF家族96條,bHLH家族87條,NAC家族68條,bZIP家族59條(圖9)。

圖9 遮光處理下紫葉稠李轉(zhuǎn)錄因子統(tǒng)計(jì)Fig.9 Transcription factor statistics of Padus virginiana in shading

2.7 紫葉稠李花青素合成途徑關(guān)鍵基因的qRT-PCR驗(yàn)證

對(duì)比Day30自然全光照條件,紫葉稠李在經(jīng)過(guò)30 d的遮光處理后,花青素合成通路上的關(guān)鍵酶PAL、CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR、ANS、UFGT均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì),花青素合成在遮光下受到了抑制,MYB6與MYB10呈表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)(圖10),說(shuō)明其對(duì)花色素苷合成途徑相關(guān)基因起到負(fù)調(diào)控的作用。

圖10 紫葉稠李花青素合成途徑關(guān)鍵基因的熒光定量分析Fig.10 The qRT-PCR verification of key genes in the anthocyanin synthesis pathway of Padus virginiana

3 結(jié)論與討論

孟祥春等[9]研究發(fā)現(xiàn),非洲菊遮光后花色素的積聚減少,無(wú)法進(jìn)行正常上色。PAL苯丙氨酸解氨酶是連接初生代謝與次生代謝途經(jīng)的紐帶,是多酚類(lèi)代謝的起始酶[10-11]。顧辰辰等[12]對(duì)茶樹(shù)短期遮光的影響研究表明,短期遮光處理對(duì)茶樹(shù)花色素苷代謝通路關(guān)鍵酶基因的表達(dá)影響很大,PAL、F3’H、DFR、UFGT出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象。周波等[13]研究發(fā)現(xiàn),草莓果實(shí)花色素苷的合成量受到光敏感度的影響,光不敏感草莓果實(shí)的花色素苷合成相關(guān)基因CHS、DFR、ANS遮光與不遮光表達(dá)沒(méi)有明顯差異,而光敏感草莓果實(shí)表達(dá)量受光部分要高于遮光部分。F3’H基因的上調(diào)會(huì)導(dǎo)致Penstemon barbatus花從藍(lán)色到紅色的變化[14],說(shuō)明紫葉稠李葉片的花色素苷含量與其有密切關(guān)系,UFGT是花色素苷合成過(guò)程中最后一個(gè)酶,主要是在花色素苷合成后,對(duì)碳骨架起到糖基化修飾的作用[15],它能將不穩(wěn)定的花色素苷進(jìn)行糖基化,使其轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的花色素苷。UFGT基因的表達(dá)與花色素苷含量變化趨勢(shì)相同,這一結(jié)果與蘋(píng)果、梨、葡萄中的報(bào)道一致[16-17]。

調(diào)節(jié)植物花色素苷代謝途徑的轉(zhuǎn)錄因子主要有MYB、bHLH和WD40,能與結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子結(jié)合,并影響花色素苷生物合成途徑中一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá),從而改變花色素苷的代謝[18-19]。Yao等[20]研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子PyMYBll4和PyMYB10存在相互作用及功能疊加的效應(yīng),使花色素苷的生物合成得到加強(qiáng)。

本研究發(fā)現(xiàn),遮光對(duì)紫葉稠李葉片淀粉和蔗糖代謝、苯丙烷類(lèi)生物合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響不大,可能是植物適應(yīng)環(huán)境并進(jìn)行正常生長(zhǎng)發(fā)育的必要生命代謝活動(dòng),氰氨基酸代謝途徑的富集說(shuō)明植物啟動(dòng)了自身的防御機(jī)制以抵抗病蟲(chóng)害,另外,遮光也較顯著影響了類(lèi)胡蘿卜素生物合成過(guò)程、α-亞麻酸的代謝過(guò)程,半萜類(lèi)三萜類(lèi)生物合成過(guò)程及玉米素合成過(guò)程。遮光對(duì)植物體內(nèi)類(lèi)黃酮生物合成有顯著影響,類(lèi)黃酮是植物重要的一類(lèi)次生代謝產(chǎn)物,花色素苷是類(lèi)黃酮合成途徑的一個(gè)分支。本研究發(fā)現(xiàn),遮光對(duì)紫葉稠李葉片的著色有顯著影響,并減少了葉片中的花色素苷合成,通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),遮光與全日照條件下的差異基因主要富集在類(lèi)黃酮生物合成代謝通路,進(jìn)一步說(shuō)明光照是紫葉稠李葉片著色和花色素苷代謝的關(guān)鍵因素之一,熒光定量分析顯示,遮光使花色素苷合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶基因PAL、CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR、ANS、UFGT表達(dá)下調(diào),關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子MYB6、MYB10表達(dá)上調(diào)。