RNAi生物農(nóng)藥在作物保護(hù)上的應(yīng)用

莫 芹,徐莉莉,呂貝貝*

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,上海 201106;2上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201106;3上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心,上海 201799)

為了應(yīng)對(duì)全球環(huán)境變化和病蟲侵害給農(nóng)作物生產(chǎn)和糧食安全帶來的挑戰(zhàn),現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)在保證農(nóng)作物產(chǎn)量、品質(zhì)等方面起了重要的作用。在這些技術(shù)中,RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)被認(rèn)為是農(nóng)業(yè)綠色防控中最具有應(yīng)用潛力的生物技術(shù)之一[1-3]。該技術(shù)具有高效性、特異性和可傳播性等特點(diǎn),通過特定的設(shè)計(jì),由植物表達(dá)或其他方式制備獲得的RNAi生物農(nóng)藥可以高特異性地抑制危害植物的真核微生物或無脊椎動(dòng)物關(guān)鍵基因表達(dá),從而達(dá)到控制病蟲害的效果[4]。

目前RNAi技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于植物發(fā)育、種質(zhì)改良和病蟲害防控等方面[5]?；赗NAi開發(fā)的生物農(nóng)藥可以預(yù)期以轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化產(chǎn)品形式進(jìn)入市場。轉(zhuǎn)化形式的第一個(gè)產(chǎn)品是美國孟山都公司研發(fā)的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米SmartStax?PRO品種,已經(jīng)于2017年在美國和加拿大相繼獲得了商業(yè)化種植的許可[6]。非轉(zhuǎn)化形式的產(chǎn)品可以通過噴灑、莖注射、蘸根、種子處理等形式進(jìn)行RNA制劑的局部施用。盡管目前沒有此類形式的產(chǎn)品上市,但隨著真核生物RNAi機(jī)制的逐步解析,生產(chǎn)成本及功效進(jìn)一步改善,此類新型生物農(nóng)藥也將在害蟲防治領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。與傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥相比,該技術(shù)是一種通用的、環(huán)境友好的農(nóng)業(yè)病蟲害防控策略。此外,該技術(shù)結(jié)合其他育種技術(shù)和生物農(nóng)藥技術(shù),能夠減少農(nóng)業(yè)對(duì)于化學(xué)合成農(nóng)藥的依賴,為未來農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展保駕護(hù)航[2]。

1 RNA干擾技術(shù)

1.1 RNAi簡介

RNAi是指通過雙鏈(dsRNA)或發(fā)夾RNA(hairpin RNA,hpRNA)誘導(dǎo)的真核生物同源mRNA降解,從而下調(diào)基因表達(dá)的生物學(xué)現(xiàn)象[7]。RNAi作為一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Post-transcriptional gene silencing,PTGS)機(jī)制,是一種真核生物中普遍存在的古老的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制,參與了宿主對(duì)病毒的防御,對(duì)染色體和基因組完整性的維護(hù)等重要的生物學(xué)過程[8]。該機(jī)制的觸發(fā)因子是由外源或者內(nèi)源產(chǎn)生的雙鏈RNA(dsRNA),通過dsRNA誘導(dǎo)使同源mRNA發(fā)生高效特異性的降解,從而達(dá)到序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默效果。這種觸發(fā)因子可能由基因組自身因?yàn)榉聪蚧パa(bǔ)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生,也可能是因外源微生物(如病毒)入侵導(dǎo)入的,因此RNAi也是生物體抵抗外界生物侵染,保護(hù)自身遺傳物質(zhì)穩(wěn)定的天然免疫模式[9-10]。

利用RNAi技術(shù)可以特異性地下調(diào)特定基因的表達(dá),該方法相對(duì)于基因編輯技術(shù)來說易于實(shí)現(xiàn)、操作簡便,特異性高,因此它是真核生物遺傳學(xué)、功能基因組學(xué)等研究的有效工具,目前已經(jīng)應(yīng)用于動(dòng)植物基因功能的探索、植物病蟲害防治、流行病和基因治療等研究領(lǐng)域[11-13]。

1.2 RNAi的放大效應(yīng)

大量的mRNA轉(zhuǎn)錄后降解是真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要手段,RNAi機(jī)制最終結(jié)果也是導(dǎo)致mRNA的降解,從而在轉(zhuǎn)錄后水平上沉默基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄后mRNA自然降解和RNAi的主要區(qū)別是RNAi過程中形成的初級(jí)小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)能夠造成下一輪的mRNA降解,從而形成逐級(jí)放大的循環(huán)效果[14]?；趯?duì)模式植物擬南芥的研究,科學(xué)家們總結(jié)了植物RNAi循環(huán)機(jī)制,示意圖如圖1所示[15-16]。植物中的ARGONAUTE(AGO)蛋白家族(擬南芥中主要為AGO1和AGO2)能夠以mRNA為靶標(biāo),在初級(jí)siRNA或microRNA的序列互補(bǔ)引導(dǎo)下進(jìn)行切割;接著RNA依賴型的RNA聚合酶6(RNA-dependent RNA polymerase 6,RDRP 6)識(shí)別切割后的mRNA并產(chǎn)生雙鏈RNA(dsRNA);產(chǎn)生的dsRNA被DICER-LIKE家族蛋白DCL2和DCL4切割成次級(jí)siRNA;最后,次級(jí)siRNA又可以進(jìn)入AGO1,并針對(duì)額外的mRNA進(jìn)行切割,導(dǎo)致其RNAi形成循環(huán)機(jī)制,從而放大轉(zhuǎn)錄后基因沉默的效果。在線蟲、真菌和植物中存在基于RDRP的信號(hào)放大途徑[17-18]。由Dicer剪切后的siRNA在RDRP的作用下能夠以siRNA反義鏈為引物,以靶mRNA作為模板合成新的dsRNA,再次加入到RNAi通路從而逐級(jí)放大基因沉默效果。因此在這些生物體內(nèi)只需要很少的siRNA即可以引發(fā)RNAi效應(yīng)。

圖1 植物RNAi機(jī)制示意圖Fig.1 Schematic diagram of RNAi machinery in plants

2 植物中RNA干擾的作用機(jī)制

植物中存在大量的小RNA分子,它們?cè)谥参锘虻恼{(diào)控、轉(zhuǎn)座子的防御,以及病毒活性的控制等方面具有重要作用。這些小RNA分子主要由4種途徑產(chǎn)生:微小RNA途徑、反式作用小干擾RNA途徑、RNA介導(dǎo)的DNA甲基化途徑,以及由外源核酸誘導(dǎo)的RNA沉默途徑,這4種途徑有部分重疊但功能分明[19]。前三種途徑的小RNA分子均來源于宿主本身,與宿主代謝調(diào)節(jié)和維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān),第四種外源核酸分子來源包括病毒和轉(zhuǎn)基因,與植物抗病毒免疫途徑相關(guān)。RNAi技術(shù)用于病蟲害防治的主要機(jī)理是基于第四種途徑進(jìn)行設(shè)計(jì)的,因此這里主要討論抗病毒RNAi和正義轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的RNAi兩方面的機(jī)制研究。RNAi的觸發(fā)因子是dsRNA,已有研究表明,病毒的RNA基因組或轉(zhuǎn)錄本復(fù)制導(dǎo)致了dsRNA的產(chǎn)生,這在RNAi機(jī)制中發(fā)揮了重要作用[20]。入侵的核酸分子還包括由含有表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)生的dsRNA。事實(shí)上大多數(shù)我們所了解的內(nèi)源siRNA途徑也是來自于以正義轉(zhuǎn)基因和病毒為模型的研究[19]。

2.1 抗病毒RNAi

RNAi已經(jīng)被認(rèn)為是植物的一種天然抗病毒防御機(jī)制。任何類型的病毒或亞病毒因子感染植物都與病毒小RNA分子的積累有關(guān),這些RNA是從病毒雙鏈RNA加工而來,并使用相同的宿主植物siRNA生物合成機(jī)制,利用AGO蛋白指導(dǎo)降解單鏈病毒RNA。因此病毒既是siRNA途徑的誘發(fā)劑又是靶標(biāo)。

來源于RNA病毒的siRNA主要被DCL4蛋白加工,也有部分被DCL2蛋白加工,最終生成的siRNA大小以21nt為主,也有部分為22 nt[21]。在正鏈和負(fù)鏈病毒基因組RNA之間形成的dsRNA,以及在單鏈病毒基因組RNA內(nèi)形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu),都被認(rèn)為是病毒siRNA的前體[22]。對(duì)于DNA病毒來說,基因組復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄發(fā)生在宿主植物細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi),因此細(xì)胞核的DCL3蛋白也參與處理DNA病毒產(chǎn)生siRNA(大小為24 nt)的過程。這些24 nt的病毒siRNA可以引導(dǎo)RdDM到DNA病毒基因組,導(dǎo)致病毒基因啟動(dòng)子的DNA甲基化以及病毒基因的轉(zhuǎn)錄基因沉默(Transcriptional gene silencing,TGS)[23]。因此包括RNAi的PTGS途徑和TGS途徑都參與到植物抵抗DNA病毒的過程。

2.2 正義轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的RNAi

正義轉(zhuǎn)基因的RNAi需要植物中RDRP6、DCL4、SGS3和AGO1等蛋白參與其傳遞性和系統(tǒng)性兩個(gè)方面,都涉及主要靶基因以外區(qū)域21 nt siRNA的產(chǎn)生,這說明次級(jí)siRNA是PTGS途徑的重要成分。來自于轉(zhuǎn)基因的異常RNA轉(zhuǎn)錄本是PTGS途徑的有效觸發(fā)因子,植物基因組上的多拷貝、含有倒置重復(fù)序列的基因片段在讀碼轉(zhuǎn)錄后可以產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA(hpRNA)。由這些初級(jí)dsRNA或hpRNA加工而成的siRNA要么本身就能誘導(dǎo)出完整的RNAi,要么更有可能觸發(fā)次級(jí)siRNA的產(chǎn)生,從而導(dǎo)致全面的RNAi[24]?？傊?dsRNA/hpRNA經(jīng)過植物的RNAi機(jī)制產(chǎn)生的小RNA分子(包括miRNA和siRNA),它們能夠在轉(zhuǎn)錄后水平和轉(zhuǎn)錄水平兩方面起調(diào)控基因表達(dá)的作用,但其中的詳細(xì)機(jī)制目前尚不能明確區(qū)分。

3 RNA干擾技術(shù)在作物保護(hù)上的應(yīng)用形式

根據(jù)dsRNA的來源不同,RNAi在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用主要有3種表現(xiàn)形式:第1種是以宿主表達(dá)的dsRNA誘導(dǎo)基因沉默(Host-induced gene silencing,HIGS)。病原微生物或害蟲在侵染作物時(shí),會(huì)攝入宿主表達(dá)的靶標(biāo)dsRNA分子,從而干擾了病原微生物或害蟲的關(guān)鍵靶標(biāo)基因的表達(dá),影響其生長發(fā)育,進(jìn)而達(dá)到防治效果。第2種是以病毒或者細(xì)菌等微生物載體表達(dá)的dsRNA誘導(dǎo)的基因沉默(Vector-mediated gene silencing,VMGS)。該方法通常選用中性病毒載體或者植物內(nèi)生菌作為dsRNA的表達(dá)和運(yùn)送載體。第3種是外源dsRNA誘導(dǎo)的基因沉默(Exogenous dsRNA-induced gene silencing,EdIGS)。EdIGS與傳統(tǒng)農(nóng)藥的使用方法最為相似,但dsRNA分子的穩(wěn)定性是該技術(shù)能否有效的關(guān)鍵。三種形式的dsRNA傳遞形式不同,其應(yīng)用效果也存在不同的優(yōu)缺點(diǎn)(表1)。

表1 3種RNAi表現(xiàn)形式優(yōu)缺點(diǎn)比較Table 1 Advantages and drawbacks of three RNAi performances

3.1 HIGS

傳統(tǒng)的病蟲害抗性品系的篩選需要花費(fèi)大量的人力和時(shí)間,而且篩選效率低。為了克服抗性品種的局限性,HIGS作為現(xiàn)代生物育種技術(shù)之一,被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)抗各種病蟲害的作物。迄今為止,已經(jīng)發(fā)表了170多項(xiàng)HIGS研究,相應(yīng)的產(chǎn)品也已經(jīng)推出[25],如抗病毒和病原真菌的香蕉品種、抗條銹病的轉(zhuǎn)基因小麥品種以及第三代具有根蟲抗性性狀的玉米品種MON 87411等[6,26-27]。

通過轉(zhuǎn)基因的途徑實(shí)現(xiàn)RNAi應(yīng)用的研究較早,該方法需要制備dsRNA/hpRNA結(jié)構(gòu),并生成穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株品系,能夠持續(xù)合成RNAi的誘發(fā)因子,因此能夠獲得持續(xù)的病蟲害抗性,種植生產(chǎn)時(shí)不需要額外的病蟲害管理。HIGS技術(shù)是植物病害防控中最有前景的轉(zhuǎn)基因技術(shù)之一,通常是針對(duì)效應(yīng)子基因或者關(guān)鍵管家基因的沉默,目前在病毒和谷物枯萎病防治方面已有大量研究報(bào)道[28-30]。然而,基于HIGS技術(shù)抗性轉(zhuǎn)基因植株的獲得高度依賴于目標(biāo)作物的可轉(zhuǎn)化性和遺傳穩(wěn)定性,通常需要很長的時(shí)間。此外,盡管科學(xué)證明長dsRNA不會(huì)導(dǎo)致飲食危險(xiǎn),消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因作物和產(chǎn)品的接受度仍然限制了該方法的發(fā)展[31]。目前在我國可以種植的RNAi作物只有轉(zhuǎn)基因木瓜,它是采用HIGS技術(shù)將木瓜環(huán)斑病毒的基因?qū)氲侥竟现?用來防控嚴(yán)重影響木瓜產(chǎn)量的環(huán)斑病毒,目前市面上90%的木瓜均是以這種技術(shù)保障其產(chǎn)量的[32]。

3.2 VMGS

鑒于跨系統(tǒng)RNAi(trans-kingdom RNAi)途徑能夠使RNAi在微生物組或者微生物個(gè)體和宿主之間轉(zhuǎn)移,利用病毒或者內(nèi)生菌載體的策略被認(rèn)為是一種折中可行的RNAi傳遞方式[33]。利用病毒載體在植物中表達(dá)異源基因是實(shí)驗(yàn)室中的常規(guī)操作,但這些載體通常只能用于短期實(shí)驗(yàn)或者生產(chǎn)一些特殊的產(chǎn)品。開發(fā)常年存在于植物中的病毒載體能夠在植物中持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)異源基因。結(jié)合構(gòu)建含有RNAi靶序列的病毒載體的方法,能夠幫助實(shí)現(xiàn)植物病害防治的田間應(yīng)用,例如對(duì)于柑橘毀滅性病害——黃龍病的治理。柑橘黃龍病是公認(rèn)的難治病害,由亞洲韌皮桿菌侵染所引起的,其傳播載體是亞洲柑橘木虱。研究學(xué)者通過在韌皮部接種含有亞洲柑橘木虱部分異常翼盤基因(Asd)的柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV),能夠有效控制病菌傳播載體(亞洲柑橘木虱)的數(shù)量,從而進(jìn)一步有效控制柑橘黃龍病的傳播[34]。

利用細(xì)菌載體傳遞dsRNA/hpRNA在模式昆蟲和哺乳動(dòng)物的基因功能研究中已有先例。RNAi的發(fā)現(xiàn)之初,Fire等[35]就發(fā)現(xiàn)表達(dá)dsRNA的大腸桿菌可以對(duì)以其為食的線蟲幼蟲產(chǎn)生特定的干擾作用。在線蟲的基因功能研究中相對(duì)于顯微注射、浸泡、轉(zhuǎn)基因植物等dsRNA傳遞方式,通過喂食表達(dá)dsRNA的大腸桿菌的方式具有簡便、成本低、可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),目前利用非病原細(xì)菌傳遞RNAi已經(jīng)成為取食性昆蟲基因功能研究的重要手段之一[36]。利用細(xì)菌工程菌/病毒載體的RNAi生物農(nóng)藥,也可以作為一種選擇性、環(huán)保型殺菌劑,用于植物病蟲害的防治。研究表明,通過飼喂表達(dá)特定靶標(biāo)基因dsRNA的大腸桿菌能夠防控多種害蟲的危害,例如給鱗翅目害蟲甜菜夜蛾和東方粘蟲飼喂表達(dá)幾丁質(zhì)合成酶基因(SeCHSA)dsRNA的大腸桿菌,會(huì)干擾其幼蟲的生長發(fā)育,導(dǎo)致其致死[37-38]。危害全球楊柳科植物的鞘翅目害蟲柳藍(lán)葉甲通過大腸桿菌介導(dǎo)的RNAi也能得到有效的防控[39]。

3.3 EdIGS

由這種形式開發(fā)的生物農(nóng)藥與傳統(tǒng)農(nóng)藥類似,主要以非轉(zhuǎn)化形式(噴施、莖注射、蘸根、種子包衣劑等)的產(chǎn)品上市。該方法以非轉(zhuǎn)基因方式激發(fā)植物的RNAi機(jī)制,能夠獲得政府監(jiān)管和消費(fèi)者的認(rèn)可。目前為止,dsRNA的外源性應(yīng)用已經(jīng)有效地觸發(fā)了植物基因、病毒、真菌、昆蟲和螨蟲的RNAi,在植物保護(hù)和生物育種等方面具有廣泛的應(yīng)用范圍和開發(fā)潛力[40]。植物中SIGS的影響因素主要包括4種:dsRNA的質(zhì)量(包括長度和濃度)、施用方法、傳遞方法和植物器官的敏感度[41]。實(shí)驗(yàn)證明,外源應(yīng)用22 nt siRNA是植物中局部和全身性RNAi最有效的誘導(dǎo)劑。將RNA分子結(jié)合到納米粒子和載體肽中,極大地提高了它們對(duì)核酸酶的抗性和傳遞效率[42]。高壓噴霧可使外源RNA共質(zhì)體傳遞,而葉柄吸收和/或主干注射則導(dǎo)致外源RNA外質(zhì)體傳遞[43-44]。以上施用和傳遞技術(shù)已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室中取得成功,但也應(yīng)該注意到高新技術(shù)的成本問題。綜合來看SIGS方式在農(nóng)業(yè)大田應(yīng)用中的主要挑戰(zhàn)是dsRNA的合成成本和dsRNA的穩(wěn)定性問題。通過工程微生物表達(dá)dsRNA的方式能夠一定程度上降低dsRNA合成成本[45-47]。隨著市場對(duì)dsRNA的興趣不斷增長,推動(dòng)了更好的生產(chǎn)系統(tǒng)、高效配方的發(fā)展,并將其成本從2008年的每克12 500美元降至2017年9月的每克近2美元。雖然還缺乏實(shí)地試驗(yàn),但dsRNA的需求量預(yù)計(jì)為2—10 g/hm2[48]。

4 總結(jié)與展望

為了應(yīng)對(duì)全球環(huán)境變化和人口增長的壓力,糧食安全問題迫切需要新的可持續(xù)的技術(shù)保駕護(hù)航。在農(nóng)業(yè)綠色防控領(lǐng)域,RNAi技術(shù)被認(rèn)為是一項(xiàng)公認(rèn)的具有前景的作物病蟲害防治工具。該技術(shù)主要以HIGS、VMGS和EdIGS三種形式應(yīng)用,目前在病毒、真菌、昆蟲、線蟲等多種病蟲害防治中均有應(yīng)用研究。其中以HIGS策略開發(fā)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品被認(rèn)為是繼Bt技術(shù)后的第三代抗蟲生物農(nóng)藥,它能夠緩解昆蟲抗藥性壓力,延長以基于Bt蛋白技術(shù)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的使用壽命。

以HIGS形式的RNAi目前已有產(chǎn)品應(yīng)用,但該產(chǎn)品通過轉(zhuǎn)基因植物的方式上市,因此政府監(jiān)管部門和社會(huì)對(duì)其施加了一定的壓力,建立配套推廣的安全性評(píng)價(jià)體系刻不容緩[49-50]。而以VMGS和EdIGS形式開發(fā)的產(chǎn)品目前仍然在基礎(chǔ)研究階段,這兩種應(yīng)用形式的基礎(chǔ)機(jī)制仍然有很多未得到清晰的解析,比如涉及靶標(biāo)和宿主之前的跨界RNAi(cross-kindom RNAi)機(jī)制,這也是限制其應(yīng)用的主要因素之一[51]。同時(shí),為了實(shí)現(xiàn)基于RNAi生物農(nóng)藥在農(nóng)作物保護(hù)上的推廣與田間應(yīng)用,我們也需要進(jìn)一步了解RNAi的分子機(jī)制(包括宿主和靶標(biāo)RNAi機(jī)制的貢獻(xiàn)和特異性,以及RNAi觸發(fā)分子的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)等),從而合理評(píng)估該技術(shù)未來田間應(yīng)用的穩(wěn)定性、特異性、持久性以及相應(yīng)的可能性風(fēng)險(xiǎn)。