同源四倍體‘五月慢’的誘導(dǎo)鑒定

王紅堯,潘靜雯,周賀芳,徐園園,張蜀寧,侯喜林,劉同坤*

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,南京 210095;2淮南市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,淮南 232001)

可育多倍體的形成可促進(jìn)物種間的遺傳物質(zhì)交流,豐富物種多樣性,為多倍體育種的發(fā)展奠定基礎(chǔ)[1]?！熬扌托浴笔嵌啾扼w植物的特征之一,相較于二倍體植物,其品質(zhì)明顯提升,適應(yīng)性和抗逆性顯著增強(qiáng)[2]。約有75%的被子植物和95%的蕨類植物在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷過(guò)多倍化[3]。自然形成的多倍體大多是物種為適應(yīng)環(huán)境,在長(zhǎng)期的自然選擇中進(jìn)化而來(lái)[4]。但自然誘變環(huán)境難于模擬,人工合成多倍體便是明晰植物進(jìn)化歷史的極佳選擇[5]。

不結(jié)球白菜(Brassica campestrisssp.chinensisMakino)原產(chǎn)于中國(guó),已有六千年以上的栽培歷史[6]。我國(guó)南方地區(qū)常稱其為青菜,北方地區(qū)稱其為油菜。我國(guó)同源四倍體不結(jié)球白菜的研究開(kāi)始于1980年,劉惠吉等[7]誘導(dǎo)出同源四倍體‘矮腳黃’,發(fā)現(xiàn)其品質(zhì)明顯高于二倍體植株。李艷艷[8]誘導(dǎo)出優(yōu)質(zhì)同源四倍體‘黃心烏’。王夏等[9]誘導(dǎo)出優(yōu)質(zhì)同源四倍體‘華鳳’。彭丹[10]誘導(dǎo)出耐熱同源四倍體‘夏帝’、‘烤青’。二倍體‘五月慢’種植面積較大,抽薹晚,解決了部分長(zhǎng)江中下游地區(qū)“春淡季”市場(chǎng)不結(jié)球白菜緊缺問(wèn)題,但是二倍體‘五月慢’抗性弱、產(chǎn)量低,遠(yuǎn)不能滿足廣大消費(fèi)者對(duì)葉菜類的需要[11]。本試驗(yàn)用一定濃度的秋水仙素溶液誘導(dǎo)二倍體‘五月慢’,以期獲得高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、晚抽薹的同源四倍體‘五月慢’材料,為不結(jié)球白菜多倍體育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白菜系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供的二倍體‘五月慢’(2n=2x=20)為試驗(yàn)材料,試驗(yàn)地點(diǎn)為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白菜系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室以及南京農(nóng)業(yè)大學(xué)句容實(shí)驗(yàn)基地。

1.2 誘導(dǎo)方法

‘五月慢’幼苗子葉完全展開(kāi)時(shí),參考前人[12-14]的方法,用質(zhì)量濃度為0.2%的秋水仙素溶液點(diǎn)滴幼苗生長(zhǎng)點(diǎn),每天上午(9:00)和下午(17:00)各處理1次,每次滴50μL,共處理3 d。

1.3 鑒定方法

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察

觀察葉型、葉色、葉厚、花器官、種莢、種子等相關(guān)形態(tài)學(xué)性狀進(jìn)行初步篩選,再通過(guò)解剖學(xué)方法觀察氣孔、花粉的形態(tài)特征等。

1.3.2 細(xì)胞學(xué)鑒定

將種子置于有濕潤(rùn)試紙的培養(yǎng)皿中催芽,待其生根后取1—2 cm根尖,放入蒸餾水中,4℃條件下靜置24 h,卡諾固定液(無(wú)水酒精、冰醋酸體積比3∶1,現(xiàn)配)固定24 h,60℃條件下使用1 mol/L HCl解離4 min。采用壓片法制片,使用卡寶品紅染液(Solarbio)進(jìn)行染色,在Olympus倒置顯微鏡(型號(hào):IX73;生產(chǎn)商:奧林巴斯)100倍鏡下觀察染色體并拍照。

1.3.3 流式細(xì)胞儀倍性鑒定

利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)植株DNA相對(duì)含量并進(jìn)行分析鑒定。取0.1 g植株幼嫩葉片,在裝有1 mL提取液A(MgSO4緩沖液中加入1%PVP)的玻璃培養(yǎng)皿中快速切碎(冰上進(jìn)行);過(guò)40μm濾篩后取濾液,5 000 r/min、4℃條件下離心5 min,棄上清液;加入1 mL提取液A,震蕩并重復(fù)前一步驟;加入500μL提取液B(MgSO4緩沖液中加入熒光染料和核糖核酸酶,現(xiàn)配),充分混勻后避光染色15 min,使用流式細(xì)胞儀(型號(hào):cytoFLEX;生產(chǎn)商:貝克曼庫(kù)爾特)檢測(cè)。

1.4 二倍體和四倍體‘五月慢’營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)分析以及農(nóng)藝性狀調(diào)查

2018年10月播種,2019年3月8日進(jìn)行品質(zhì)及農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)。二倍體和四倍體‘五月慢’植株各選取10株,取各植株同一部位的葉片,測(cè)定其硝態(tài)氮含量、可溶性蛋白含量、氨基酸含量、可溶性糖含量、纖維素含量、葉綠素濃度及花青苷含量[15],并測(cè)量株高、葉數(shù)、葉寬、柄寬、葉長(zhǎng)、柄長(zhǎng)、單株質(zhì)量[16]等農(nóng)藝性狀。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,使用SPSSStatistics 20軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 二倍體和四倍體‘五月慢’植株的形態(tài)學(xué)分析

由圖1可知,與二倍體‘五月慢’植株相比,四倍體‘五月慢’植株束腰明顯,葉片緊湊、開(kāi)展度較小,葉色較深、葉面較褶皺;四倍體‘五月慢’花序花簇變大、花朵緊湊;花朵變大,單花花瓣更圓,顏色更加明艷,花器官個(gè)體較大;種莢變粗,種子直徑變大;花粉呈明顯棒狀,且可見(jiàn)少量梯形、圓形等不規(guī)則花粉;葉片下表皮氣孔密度變小、形態(tài)變大。

圖1 二倍體、四倍體‘五月慢’植株各器官Fig.1 Organs of diploid and autotetraploid‘Wuyueman’

2.2 二倍體和四倍體‘五月慢’植株細(xì)胞學(xué)分析

由圖2可知,根尖染色體鑒定結(jié)果顯示二倍體‘五月慢’的染色體數(shù)目為20,四倍體‘五月慢’根尖染色體數(shù)目為40。

圖2 二倍體、四倍體‘五月慢’細(xì)胞學(xué)鑒定Fig.2 The cytological identification of diploid and autotetraploid‘Wuyueman’

2.3 流式細(xì)胞儀倍性分析

由圖3可知,二倍體‘五月慢’的DNA相對(duì)含量在70左右。四倍體‘五月慢’的DNA相對(duì)含量在140左右,約為二倍體的2倍。

圖3 二倍體、四倍體‘五月慢’DNA相對(duì)含量Fig.3 DNA relative content of diploid and autotetraploid‘Wuyueman’

2.4 二倍體和四倍體‘五月慢’營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)分析

由表1可知,四倍體‘五月慢’植株中硝態(tài)氮含量、纖維素含量分別比二倍體降低了24.03%、31.84%,差異極顯著;可溶性蛋白含量、花青苷含量分別比二倍體增加了43.94%、37.08%,差異極顯著。相較于二倍體,四倍體植株葉綠素含量上升13.89%,可溶性糖含量上升9.76%,呈顯著差異;氨基酸含量上升14.33%,無(wú)顯著差異。

表1 二倍體、四倍體‘五月慢’營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)比較Table 1 Comparison of nutritional quality between diploid and autotetraploid‘Wuyueman’

2.5 二倍體和四倍體‘五月慢’農(nóng)藝性狀分析

由表2可知,四倍體‘五月慢’植株株高、葉數(shù)、葉長(zhǎng)、葉柄長(zhǎng)分別比二倍體植株下降了4.78%、21.05%、4.14%、3.71%,且株高、葉柄長(zhǎng)差異達(dá)極顯著水平;相較于二倍體植株,四倍體植株單株質(zhì)量、十葉厚、葉寬、葉柄寬分別上升了22.63%、39.39%、2.85%、16.88%。

表2 二倍體、四倍體‘五月慢’主要農(nóng)藝學(xué)性狀比較Table 2 Comparison of main agronomic traits between diploid and autotetraploid‘Wuyueman’

3 討論

染色體的同源倍數(shù)越多,細(xì)胞、細(xì)胞核的體積越大,葉片大小、厚度,氣孔和花粉粒大小,花和種子大小以及莖的粗度也隨之遞增,這種特征稱為多倍體的巨大性[17]。形態(tài)學(xué)鑒定方法直觀且操作簡(jiǎn)便,可用于多倍體的初步鑒定。但形態(tài)學(xué)鑒定誤差大,結(jié)合細(xì)胞學(xué)及流式細(xì)胞儀鑒定可提高準(zhǔn)確率。

與二倍體植物相比,多倍體植物通常表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì),如生長(zhǎng)迅速、適應(yīng)性更強(qiáng)、組織器官更大等[18]。本研究顯示,相較于二倍體‘五月慢’,同源四倍體植株花簇、花朵、花器官、果莢、種子等均體現(xiàn)出巨大性,與張宇等[19]、王夏等[9]的研究結(jié)論一致,但株高等未明顯體現(xiàn)出此特性。

葉綠素是植物葉片中主要的光合色素,是植物進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ),葉綠素含量是決定作物光合效率和生物量的重要因素[20]。本試驗(yàn)中,四倍體‘五月慢’葉色深于二倍體,葉綠素總含量比二倍體植株高13.89%,可溶性糖含量增加9.76%。

葉類蔬菜中極易富集硝酸鹽,且人體內(nèi)攝入的硝酸鹽80%以上來(lái)自蔬菜[21],雖然硝酸鹽對(duì)人體無(wú)直接危害,但是其在人體內(nèi)可被還原成亞硝酸鹽,其與人體血紅蛋白結(jié)合會(huì)引發(fā)亞硝酸鹽中毒,還可能與次級(jí)胺反應(yīng)生成致癌性亞硝酸胺[22-24]。本試驗(yàn)中,四倍體‘五月慢’植株的硝酸鹽含量比二倍體‘五月慢’低。同源四倍體減數(shù)分裂行為異常是其育性降低的原因[25],本試驗(yàn)中,同源四倍體‘五月慢’結(jié)種率下降,但種質(zhì)仍然具有較好育性。

4 結(jié)論

本研究成功誘導(dǎo)出四倍體‘五月慢’,發(fā)現(xiàn)該四倍體具有束腰性強(qiáng)、植株矮化、葉色鮮亮、抽薹晚、產(chǎn)量高等優(yōu)勢(shì)。且可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、游離氨基酸含量、葉綠素含量、花青苷含量較高,纖維素含量、硝酸鹽含量較低。