基于多指標(biāo)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的龍葵果質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

趙雯雯，張錦超，孫秀蕊，張 哲，韓洪翠，王 雪，荊紫琪，李 楚，魏 鋒，張玉杰*

基于多指標(biāo)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的龍葵果質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

趙雯雯1，張錦超2，孫秀蕊1，張 哲1，韓洪翠1，王 雪1，荊紫琪1，李 楚1，魏 鋒3*，張玉杰1*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488 2.吉林創(chuàng)岐生態(tài)農(nóng)業(yè)技術(shù)開發(fā)有限公司，吉林 吉林 136000 3.中國食品藥品檢定研究院中藥民族藥檢定所，北京 100050

采用多指標(biāo)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法綜合分析龍葵果質(zhì)量及關(guān)鍵指標(biāo)，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。采用HPLC法建立龍葵果特征指紋圖譜及澳洲茄堿、澳洲茄邊堿含量測(cè)定方法，并測(cè)定浸出物含量，使用SAS 14.0、SIMCA14.1軟件對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行聚類分析（hierarchical clustering analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）及偏最小二乘判別分析（discriminant analysis of partial least squares analysis，PLS-DA），通過對(duì)吉林產(chǎn)地25批不同產(chǎn)區(qū)、不同采收期藥材的分析，綜合評(píng)價(jià)龍葵果質(zhì)量及標(biāo)志性成分。建立的特征指紋圖譜及澳洲茄堿、澳洲茄邊堿含量測(cè)定方法穩(wěn)定性較好。HCA分析可將25批樣品聚為2大類，分類主要與產(chǎn)區(qū)有關(guān)，I類藥材為鐵東區(qū)及梨樹縣的孤家子、榆樹臺(tái)產(chǎn)區(qū)；II類藥材為梨樹縣的杏山、北夏家、泉眼溝、獾子洞產(chǎn)區(qū)。用3個(gè)主成分對(duì)龍葵果藥材進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果表明I類藥材綜合得分及排名較高，質(zhì)量較優(yōu)。根據(jù)PLS-DA分析，造成兩類藥材質(zhì)量差異的指標(biāo)為醇溶性浸出物含量及指紋圖譜相似度。色譜峰2、3（澳洲茄堿）、4（澳洲茄邊堿）、14、15（薯蕷皂苷元）、16所代表的成分是2類龍葵果藥材質(zhì)量差異的標(biāo)志性物質(zhì)。建立的龍葵果質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、穩(wěn)定可靠，可為龍葵果質(zhì)量評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)。

龍葵果；指紋圖譜；澳洲茄堿；澳洲茄邊堿；薯蕷皂苷元；化學(xué)計(jì)量學(xué)；質(zhì)量評(píng)價(jià)

龍葵果為茄科植物龍葵L.的未成熟果實(shí)，藥用歷史悠久，始載于《藥性論》[1]，并被1999版《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)維吾爾藥分冊(cè)》[2]和2013年發(fā)布的《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[3]所收載。龍葵果能調(diào)血解毒、清熱止渴、收斂消腫、治療腫瘤[1]。在臨床上主要用于肝癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌等多種腫瘤的防治，療效顯著[4]。近年來，隨著對(duì)化學(xué)成分和藥理作用的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)[5-6]龍葵果抗腫瘤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為總甾體皂苷，包括生物堿型和非生物堿型2種，它們存在于70%甲醇或60%乙醇提取部位?？鼓[瘤活性較強(qiáng)的單體成分主要是澳洲茄堿[7]和澳洲茄邊堿[8]，此外還有澳洲茄胺、龍葵酸[9]等部分新分離得到的甾體成分。但現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)龍葵果的性狀、顯微鑒別、浸出物、灰分、薄層鑒別項(xiàng)進(jìn)行了較為詳盡的說明，缺少針對(duì)其藥效部位和指標(biāo)性成分的定性、定量檢查方法。目前因產(chǎn)地、采收時(shí)期、炮制方法不同所導(dǎo)致的龍葵果藥材質(zhì)量不穩(wěn)定及偽劣混雜等問題已嚴(yán)重影響到龍葵果藥材市場(chǎng)和臨床療效，因此有必要從整體上對(duì)龍葵果藥材質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為建立其更為完善的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法奠定基礎(chǔ)。

藥用龍葵果主要為人工栽培品，主產(chǎn)吉林、安徽等地，不同產(chǎn)地對(duì)龍葵果加工處理方法有所不同，吉林產(chǎn)龍葵果以保鮮處理為特點(diǎn)，其他地區(qū)則為干燥品。本研究以吉林產(chǎn)區(qū)25批不同產(chǎn)地、不同采收期鮮龍葵果作為研究對(duì)象，以澳洲茄堿、澳洲茄邊堿作為主要質(zhì)控成分建立定量分析方法，以60%乙醇提取部位作為質(zhì)控部位建立特征指紋圖譜，并對(duì)浸出物進(jìn)行測(cè)定，從而構(gòu)建起基于抗腫瘤活性的龍葵果質(zhì)量評(píng)價(jià)體系。以期為今后龍葵果藥材產(chǎn)地、采收、加工及質(zhì)量控制和資源開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

賽默飛Ultimate 3000型高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；101-3AB型電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；DK-98-II型水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）；FW-100型高速多功能粉碎機(jī)（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 試劑

澳洲茄堿（批號(hào)B20019）、澳洲茄胺（批號(hào)B20017）、澳洲茄邊堿（批號(hào)B20018）、薯蕷皂苷元（批號(hào)B21177）對(duì)照品均購自上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；甲醇、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）；娃哈哈飲用純凈水；其他試劑均為分析純。

1.3 試藥

25批龍葵果藥材由吉林創(chuàng)歧生態(tài)農(nóng)業(yè)技術(shù)開發(fā)有限公司提供。經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院鑒定教研室鑒定為茄科植物龍葵L.的未成熟果實(shí)，經(jīng)乙醇保鮮處理。于鼓風(fēng)干燥箱中55 ℃烘干，粉碎后過二號(hào)篩，置于干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆谩悠樊a(chǎn)地和采收時(shí)間信息見表1。

2 方法

2.1 HPLC法測(cè)定澳洲茄堿、澳洲茄邊堿含量

2.1.1 供試品溶液的制備 取龍葵果藥材粉末約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL、氨水2 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取澳洲茄堿、澳洲茄邊堿對(duì)照品適量，加70%甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為0.88和0.95 mg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.3 色譜條件 色譜柱為Welch Ultimate?XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。以乙腈（A）-2 mmol/L磷酸氫二鈉（B）梯度洗脫：0～5 min：5% A；5～10 min：5%～39% A；10～20 min：39% A；20～35 min：39%～65% A；35～40 min：65%～35% A；體積流量1 mL/min；檢測(cè)波長203 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。在此條件下澳洲茄堿、澳洲茄邊堿色譜峰分離良好，無雜質(zhì)峰干擾，見圖1。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的繪制 取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，用70%甲醇分別稀釋至5個(gè)不同的質(zhì)量濃度，得系列混合對(duì)照品溶液。按“2.1.3”項(xiàng)條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)（），質(zhì)量為橫坐標(biāo)（）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到澳洲茄堿標(biāo)準(zhǔn)曲線＝6.078 7?2.259 8，2=0.999 9，線性范圍為3.53～17.65 μg；澳洲茄邊堿標(biāo)準(zhǔn)曲線＝5.580 3?0.998 3，2＝0.999 9，線性范圍為3.83～19.15 μg。

表1 不同產(chǎn)地、不同采收期龍葵果樣品信息

Table 1 Information of S.nigrum fruit samples from different producing areas and harvest dates

批次產(chǎn)地采收日期批次產(chǎn)地采收日期 S1吉林省鐵東區(qū)葉赫鎮(zhèn)2020-08-06S14吉林省梨樹縣榆樹臺(tái)鎮(zhèn)2020-08-18 S2吉林省鐵東區(qū)葉赫鎮(zhèn)2020-08-13S15吉林省梨樹縣榆樹臺(tái)鎮(zhèn)2020-08-27 S3吉林省鐵東區(qū)葉赫鎮(zhèn)2020-08-24S16吉林省梨樹縣杏山村2020-08-02 S4吉林省鐵東區(qū)下三臺(tái)村2020-08-10S17吉林省梨樹縣杏山村2020-08-11 S5吉林省鐵東區(qū)下三臺(tái)村2020-08-17S18吉林省梨樹縣杏山村2020-08-21 S6吉林省鐵東區(qū)下三臺(tái)村2020-08-26S19吉林省梨樹縣北夏家村2020-08-22 S7吉林省鐵東區(qū)山門鎮(zhèn)2020-08-07S20吉林省梨樹縣北夏家村2020-08-25 S8吉林省鐵東區(qū)山門鎮(zhèn)2020-08-13S21吉林省梨樹縣獾子洞村2020-08-02 S9吉林省鐵東區(qū)石嶺鎮(zhèn)2020-08-09S22吉林省梨樹縣獾子洞村2020-08-14 S10吉林省鐵東區(qū)石嶺鎮(zhèn)2020-08-18S23吉林省梨樹縣泉眼溝村2020-08-03 S11吉林省梨樹縣孤家子鎮(zhèn)2020-08-09S24吉林省梨樹縣泉眼溝村2020-08-15 S12吉林省梨樹縣孤家子鎮(zhèn)2020-08-16S25吉林省梨樹縣泉眼溝村2020-08-24 S13吉林省梨樹縣孤家子鎮(zhèn)2020-08-27

1-澳洲茄堿 2-澳洲茄邊堿

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，在“2.1.3”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算澳洲茄堿、澳洲茄邊堿百分含量的RSD值為0.01%、0.02%，表明該儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取龍葵果樣品（S5）約2 g，置錐形瓶中，按“2.1.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、10、12、24 h按“2.1.3”項(xiàng)條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算澳洲茄堿、澳洲茄邊堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值為1.45%、1.11%，表明供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取同一批次樣品（S5）6份，按“2.1.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)條件分別進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算各樣品中澳洲茄堿、澳洲茄邊堿百分含量及RSD值。測(cè)得澳洲茄堿、澳洲茄邊堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.55%、2.30%。RSD值分別為1.95%、2.27%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的龍葵果藥材6份（S5），約1 g，置錐形瓶中，精密加入一定體積的混合對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)條件分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率和RSD值。結(jié)果澳洲茄堿、澳洲茄邊堿的平均回收率分別為99.30%、98.14%，RSD值分別為2.30%、2.26%。

2.2 龍葵果藥材特征指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

2.2.1 供試品溶液的制備 取本品粉末約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取澳洲茄堿、澳洲茄邊堿、澳洲茄胺、薯蕷皂苷元對(duì)照品適量，加60%乙醇溶解，制備質(zhì)量濃度分別為0.49、0.50、0.56、0.58 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 色譜條件 色譜柱為Welch Ultimate?XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。以乙腈（A）-1%磷酸（B）梯度洗脫：0～5 min：10%～20% A；5～20 min：20%～33% A；20～25 min：33～84% A；25～40 min：84%～100% A；40～50 min：100% A；50～60 min：100%～10% A；體積流量1 mL/min；檢測(cè)波長203 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。在此色譜條件下，各色譜峰可以得到很好的分離，見圖2。由于4號(hào)澳洲茄邊堿色譜峰的保留時(shí)間適中，分離度良好，峰面積較大，以此作為參照峰進(jìn)行方法學(xué)考察。

3-澳洲茄堿 4-澳洲茄邊堿 8-澳洲茄胺 15-薯蕷皂苷元

2.2.4 方法學(xué)考察 方法學(xué)考察內(nèi)容同“2.1”項(xiàng)。

2.2.5 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 A）”對(duì)25批龍葵果藥材HPLC圖譜進(jìn)行處理。以S1號(hào)樣品色譜圖為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.1 min，進(jìn)行多點(diǎn)校正和自動(dòng)譜峰匹配，中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜。以此作為龍葵果藥材的對(duì)照指紋圖譜，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。

2.3 龍葵果藥材醇（水）溶性浸出物測(cè)定

根據(jù)《中國藥典》采用冷浸法[10]測(cè)定浸出物含量。取供試品約4 g，精密稱定，置250 mL錐形瓶中，精密加水（稀乙醇）100 mL，密塞，冷浸，前6 h內(nèi)時(shí)時(shí)振搖，再靜置18 h，用干燥濾器迅速濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL置已干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻3 min，迅速精密稱定質(zhì)量。以干燥品計(jì)算供試品中水（醇）溶性浸出物的含量。

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 6.0進(jìn)行回歸分析，采用SAS 14.0、SIMCA14.1軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析（hierarchical clustering analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）及偏最小二乘判別分析（partial least squares analysis，PLS-DA）。

3 結(jié)果與分析

3.1 澳洲茄堿、澳洲茄邊堿含量測(cè)定結(jié)果

所建立的澳洲茄堿、澳洲茄邊堿HPLC含量測(cè)定方法，線性、精密度、重復(fù)性、和回收率試驗(yàn)結(jié)果均符合含量測(cè)定要求。25批龍葵果藥材中澳洲茄堿、澳洲茄邊堿含量差異較大，澳洲茄堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.61%～1.70%，澳洲茄邊堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.27%～2.59%，結(jié)果見表2。

表2 25批藥材醇(水) 溶性浸出物、澳洲茄堿、澳洲茄邊堿含量及指紋圖譜相似度測(cè)定結(jié)果

Table 2 Determination results of alcohol (water) soluble extract, content of solasonine and solamargine and fingerprint similarity of 25 batches of medicinal materials

批次質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%指紋圖譜相似度 水溶性浸出物醇溶性浸出物澳洲茄堿澳洲茄邊堿 S135.9426.781.382.050.968 0 S234.4326.481.372.100.983 0 S335.3226.521.702.580.989 0 S434.1826.371.542.360.995 0 S533.5127.411.552.300.991 0 S635.3426.751.161.830.990 0 S739.1826.211.362.120.992 0 S834.0326.191.071.680.992 0 S943.0727.641.342.090.989 0 S1042.6927.281.041.610.995 0 S1141.2326.141.321.950.978 0 S1243.5827.401.452.110.981 0 S1344.3227.211.692.590.934 0 S1441.4528.481.342.050.960 0 S1543.0525.851.292.020.944 0 S1644.2234.250.631.270.928 0 S1745.5532.820.611.290.958 0 S1843.0535.980.651.390.949 0 S1941.6135.390.811.710.946 0 S2040.7135.010.791.630.941 0 S2133.9136.570.841.790.928 0 S2234.5135.380.791.610.943 0 S2335.8430.020.881.830.9440 S2434.7732.060.611.310.937 0 S2539.2833.050.831.630.964 0

3.2 龍葵果藥材特征指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

所建立的HPLC指紋圖譜測(cè)定方法符合方法學(xué)考察要求。25批樣品共標(biāo)定16個(gè)共有峰，且16個(gè)共有峰的峰面積占總峰面積的85%以上。經(jīng)與對(duì)照品色譜圖比對(duì)后，確認(rèn)樣品圖譜中3號(hào)峰為澳洲茄堿，4號(hào)峰為澳洲茄邊堿，8號(hào)峰為澳洲茄胺，15號(hào)峰為薯蕷皂苷元，后續(xù)經(jīng)質(zhì)譜鑒定5號(hào)峰為Khasianine[11]。25批樣品的相似度計(jì)算結(jié)果在0.928～0.995，說明各產(chǎn)地的藥材有較好的一致性，可以用于綜合評(píng)價(jià)龍葵果藥材的整體質(zhì)量。結(jié)果見圖3和表2。

圖3 25批樣品HPLC指紋疊加圖譜

3.3 浸出物測(cè)定結(jié)果

25批龍葵果藥材水溶性浸出物含量在33.51%～45.55%，醇溶性浸出物含量在25.85%～36.57%，不同批次之間差異較大，結(jié)果見表2。

3.4 HCA分析

采用SAS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)25批龍葵果水溶性浸出物含量、醇溶性浸出物含量、澳洲茄堿含量、澳洲茄邊堿含量、指紋圖譜相似度5個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行HCA分析。將數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后采用Ward離差平方和聚類分析，結(jié)果見圖4。從中可以看出，25批龍葵果樣品聚為2大類，其中，S1～S15聚為第I類；S16～S25聚為第II類。在第I類藥材中，S1～S10均為鐵東區(qū)產(chǎn)地，S11～S13為梨樹縣孤家子鎮(zhèn)產(chǎn)區(qū)，S14、S15為梨樹縣榆樹臺(tái)鎮(zhèn)產(chǎn)區(qū)；第II類均為梨樹縣產(chǎn)區(qū)，分類主要與產(chǎn)地有關(guān)。

圖4 25批樣品聚類分析結(jié)果圖

3.5 PCA分析

采用SAS14.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)25批龍葵果水溶性浸出物含量、醇溶性浸出物含量、澳洲茄堿含量、澳洲茄邊堿含量、指紋圖譜相似度5個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Z標(biāo)準(zhǔn)化處理后，計(jì)算相關(guān)系數(shù)矩陣，主成分特征值、累積貢獻(xiàn)率及主成分綜合得分等。結(jié)果見表3。

由PCA結(jié)果可知，前3個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為95.95%，其中主成分1的占比為63.41%，由特征向量值可知主要反映2（醇溶性浸出物含量）、3（指紋圖譜相似性）、4（澳洲茄堿含量）、5（澳洲茄邊堿含量）信息，為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)；主成分2主要反映1（水溶性浸出物含量）信息，為極性成分評(píng)價(jià)指標(biāo)；主成分3主要反映4（澳洲茄邊堿含量）信息，為抗腫瘤藥效成分評(píng)價(jià)指標(biāo)。前3個(gè)主成分代表了龍葵果藥材中95.95%的信息量，具有很好的代表性，足以評(píng)價(jià)龍葵果藥材的品質(zhì)。

用3個(gè)主成分對(duì)龍葵果藥材進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，將得到的特征向量與標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)相乘，得到主成分表達(dá)式，再以每個(gè)主成分所對(duì)應(yīng)的特征值占提取主成分總的特征值之和的比例作為權(quán)重得到了主成分綜合模型，根據(jù)主成分綜合模型計(jì)算25批龍葵果藥材的主成分得分、綜合得分及排名，見表3，綜合得分越高，表明質(zhì)量越好。由分析結(jié)果可知，I類藥材（S1～S15）質(zhì)量較為穩(wěn)定，且質(zhì)量較優(yōu)；II類藥材（S16～S25）綜合得分較低。

3.6 PLS-DA分析

為了進(jìn)一步比較2類龍葵果質(zhì)量，尋找類間差異性指標(biāo)，在進(jìn)行了無監(jiān)督的主成分分析基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用有監(jiān)督的PLS-DA分析，結(jié)果如圖5、6所示。建立的PLS-DA分析模型中累計(jì)解釋能力參數(shù)2和2分別為0.975、0.912，預(yù)測(cè)能力參數(shù)2為0.879，提示所建立的模型穩(wěn)定性及預(yù)測(cè)能力較好。根據(jù)模型中各變量權(quán)重重要性排序（variable importance in projection，VIP）預(yù)測(cè)值來篩選類間差異性指標(biāo)。一般認(rèn)為在95%的置信區(qū)間內(nèi)VIP＞1.0的指標(biāo)在分類中發(fā)揮著重要作用，小于0.5表示不重要變量，1～0.5的間隔是一個(gè)灰色區(qū)域，其重要性級(jí)別取決于數(shù)據(jù)集的大小。由圖6可知，醇溶性浸出物含量、指紋圖譜相似度為2組分類的主要差異性指標(biāo)。

表3 各主成分得分、綜合得分及排名

Table 3 Principal component score, comprehensive score and ranking

批次主成分1得分主成分2得分主成分3得分綜合得分排名 S11.186 32?0.459 370.289 533.505 6510 S21.603 67?0.873 09?0.067 284.193 018 S32.811 66?0.410 520.664 288.952 141 S41.071 71?0.910 57?1.013 571.848 4013 S51.616 070.197 04?0.509 664.979 706 S60.769 20?1.253 65?1.127 790.481 5014 S72.392 98?0.823 890.166 056.896 433 S82.215 76?1.026 120.183 546.149 924 S91.174 431.047 13?0.575 634.360 827 S100.250 620.662 11?1.696 850.321 8410 S111.027 800.680 32?0.473 553.607 249 S121.236 541.274 55?0.249 034.992 965 S131.392 231.957 462.042 327.654 582 S140.549 920.790 220.386 542.763 9712 S150.434 791.304 460.560 513.012 0811 S16?3.006 670.866 25?0.046 61?8.722 4625 S17?2.332 141.054 74?1.110 75?7.100 3722 S18?2.624 350.465 56?0.346 36?8.096 0423 S19?1.877 600.331 810.354 89?5.397 5518 S20?2.020 120.130 610.391 47?6.020 5019 S21?1.915 76?1.361 791.448 67?6.442 6520 S22?1.826 76?1.339 210.583 47?6.707 1021 S23?0.720 11?0.754 640.534 93?2.663 4916 S24?2.176 99?1.305 29?0.032 36?8.189 1824 S25?1.233 20?0.244 13?0.356 75?4.380 8817

圖5 25批樣品基于5個(gè)測(cè)定指標(biāo)的PCA分析得分圖

圖6 5個(gè)測(cè)定指標(biāo)的PLS-DA分析VIP圖

3.7 龍葵果質(zhì)量差異成分的篩選

為了分析龍葵果質(zhì)量的差異性規(guī)律，篩選引起兩組分類龍葵果質(zhì)量差異的潛在化學(xué)成分，利用SIMCA14.1軟件對(duì)25批不同產(chǎn)地、不同采收期龍葵果藥材指紋圖譜共有峰峰面積的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析及PLS-DA分析，結(jié)果見圖7、8。建立的PLS-DA分析模型中，累計(jì)解釋能力參數(shù)2和2分別為0.874、0.936，預(yù)測(cè)能力參數(shù)2為0.914，提示所建立的模型穩(wěn)定性及預(yù)測(cè)能力較好。提取PLS-DA模型中16個(gè)共有峰的VIP值，色譜峰2、3、4、14、15、16的VIP值均大于1，說明這些峰所代表的成分是造成2組分類質(zhì)量差異的主要標(biāo)志性物質(zhì)，色譜峰5、6、7、12、13的VIP值在0.5～1.0，說明這些成分對(duì)分類結(jié)果也有一定影響，其中3號(hào)峰為澳洲茄堿、4號(hào)峰為澳洲茄邊堿、5號(hào)峰為Khasianine，15號(hào)峰為薯蕷皂苷元，而澳洲茄胺（8號(hào)峰）在各產(chǎn)地間分布較為均勻，其他色譜峰還有待進(jìn)一步鑒別。

圖7 25批樣品基于16個(gè)共有色譜峰的PCA分析得分圖

圖8 16個(gè)共有色譜峰的PLS-DA分析VIP得分圖

4 討論

HPLC含量測(cè)定中為最大限度提取出2個(gè)生物堿，本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)法對(duì)提取方法、提取時(shí)間、甲醇百分比、料液比、氨水用量等提取條件進(jìn)行了考察。結(jié)果表明回流提取法提取率高于超聲提取法，加入氨水使提取溶劑呈堿性可更多的提取出2個(gè)生物堿。浸出物測(cè)定是指用水或其他適宜的溶劑對(duì)藥材和飲片中可溶性物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，以藥材浸出物的含量作為其質(zhì)量控制指標(biāo)的測(cè)定方法[9]。由于中藥成分復(fù)雜，有效成分難以完全闡明，故以浸出物作為質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一，對(duì)于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)具有重要意義。龍葵果藥材中含有的酚酸類、多糖類等極性較大成分可被水浸出；含有的黃酮苷、花色苷等成分可被稀乙醇浸出。因此，本研究選擇澳洲茄堿、澳洲茄邊堿含量、浸出物含量、指紋圖譜相似度作為質(zhì)量控制指標(biāo)，可較為全面的反映龍葵果質(zhì)量信息，從而實(shí)現(xiàn)整體上的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

采用化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法對(duì)5個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，25批龍葵果樣品聚為2大類，S1～S15為I類；S16～S25聚為II類。分類主要與產(chǎn)地有關(guān)，在I類藥材中，S1～S10均為鐵東區(qū)產(chǎn)地，S11～S13為梨樹縣孤家子鎮(zhèn)產(chǎn)區(qū)，S14、S15為梨樹縣榆樹臺(tái)鎮(zhèn)產(chǎn)區(qū)；第II類均為梨樹縣產(chǎn)區(qū)。主成分分析用3個(gè)主成分對(duì)龍葵果藥材進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，由分析結(jié)果可知，I類藥材綜合得分及排名較高，整體質(zhì)量較為穩(wěn)定，且質(zhì)量較優(yōu)；II類藥材綜合得分較低。根據(jù)偏最小二乘判別分析，造成2類藥材質(zhì)量差異的指標(biāo)為醇溶性浸出物含量及指紋圖譜相似度。色譜峰2、3、4、14、15、16所代表的成分是造成2組分類龍葵果質(zhì)量差異的主要標(biāo)志性物質(zhì)。而色譜峰5、6、7、12、13成分對(duì)分類結(jié)果也有一定影響，其中3號(hào)峰為澳洲茄堿、4號(hào)峰為澳洲茄邊堿、5號(hào)峰為Khasianine，15號(hào)峰為薯蕷皂苷元，而澳洲茄胺(8號(hào)峰)在各產(chǎn)地間分布較為均勻。研究表明，澳洲茄堿、澳洲茄邊堿、Khasianine、澳洲茄胺、薯蕷皂苷元均與抗腫瘤作用密切相關(guān)。綜上所述，建立的澳洲茄堿、澳洲茄邊堿含量測(cè)定、浸出物含量測(cè)定、指紋圖譜相似度結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法可以在整體上的對(duì)龍葵果進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 梅全喜, 張錦超.鮮龍葵果抗腫瘤作用研究與應(yīng)用 [M].北京: 中國中醫(yī)藥出版社, 2017: 26.

[2] 中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)?維吾爾藥分冊(cè)[M].烏魯木齊: 新疆科技衛(wèi)生出版社, 1999: 27.

[3] 廣東省食品藥品監(jiān)督管理局.廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（第二冊(cè)） [M].廣州: 廣東科技出版社, 2011: 53.

[4] 梅全喜, 董鵬鵬, 李紅念, 等.鮮龍葵果治療腫瘤的藥理學(xué)基礎(chǔ)與臨床應(yīng)用研究進(jìn)展 [J].時(shí)珍國醫(yī)國藥, 2016, 27(7): 1713-1716.

[5] Xiang L M, Wang Y H, Yi X M,.Steroidal alkaloid glycosides and phenolics from the immature fruits of[J]., 2019, 137: 104268.

[6] Xiang L M, Wang Y H, Yi X M,.Anti-inflammatory steroidal glycosides from the berries ofL.(European black nightshade) [J]., 2018, 148: 87-96.

[7] Gu X Y, Shen X F, Wang L,.Bioactive steroidal alkaloids from the fruits of[J]., 2018, 147: 125-131.

[8] 王立業(yè).龍葵 (L.) 細(xì)胞毒活性成分的繼續(xù)研究和藥材的質(zhì)量控制研究 [D].沈陽: 沈陽藥科大學(xué), 2007.

[9] Shi F Q, Wang C F, Wang L X,.Preparative isolation and purification of steroidal glycoalkaloid from the ripe berries ofL.by preparative HPLC-MS and UHPLC-TOF-MS/MS and its anti-non-small cell lung tumors effectsand[J]., 2019, 42(15): 2471-2481.

[10] 中國藥典[S].四部.2015: 202.

[11] 袁海建, 陳宜剛, 蔡寶昌, 等.反相高效液相色譜法同時(shí)分析龍葵中3種甾體生物堿 [J].中國中藥雜志, 2011, 36(12): 1630-1632.

Quality evaluation of fruits ofon multiple index and chemometrics

ZHAO Wen-wen1, ZHANG Jin-chao2, SUN Xiu-rui1, ZHANG Zhe1, HAN Hong-cui1, WANG Xue1, JING Zi-qi1, LI Chu1, WEI Feng3, ZHANG Yu-jie1

1.School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China Jilin Chuang Qi Ecological Agricultural Technology Development Co., Ltd., Jilin 136000, China Institute of Traditional Chinese Medicine and Ethnic Medicine Control, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China

To establish a method for the comprehensive evaluation of the quality of fruits ofby multiple index and chemometrics, so as to provide the scientific basis for its quality evaluation.HPLC was used to establish the fingerprint and the content of solasonine and solamargine.The determination of extract was carried out.According to the above method, the quality and index components of 25 batches of medicinal materials from different producing areas and different harvest time in Jilin Province were determined and analyzed by hierarchical clustering analysis (HCA), principal component analysis (PCA) and discriminant analysis of partial least squares analysis (PLS-DA) by SAS 14.0 and SIMCA14.1 software.The fingerprint and the determination method of solasonine and solamargine were stable.The results showed that 25 samples were classified into two categories by HCA analysis, and the classification was mainly related to the origin.In class I, S1—S10 was from Tiedong District, S11—S13 from Gujiazi Town, Lishu County, and S14—S15 from Yushutai Town, Lishu County; The class II all came from Lishu County.The results showed that the comprehensive score and ranking of the class I were higher and the quality was better.According to PLS-DA analysis, the indexes of quality difference between the two kinds were alcohol soluble extract content and fingerprint similarity.The components represented by peaks 2, 3 (solanine), 4 (solamargine), 14, 15 (diosgenin) and 16 were the main markers of the quality differences between the two groups.Conclusion the method is simple, repeatable and reliable, and can be used to evaluate the quality of fruits of.

fruits ofL.; fingerprint; solasonine; solamargine; diosgenin; chemometrics; quality evaluation

R286.2

A

0253 - 2670(2022)09 - 2803 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.09.024

2021-09-09

趙雯雯，碩士研究生，從事中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。E-mail: zhaoww0430@163.com

通信作者：張玉杰，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。E-mail:zhyj227@126.com

魏 鋒，博士，研究員，從事中藥質(zhì)量控制研究。E-mail: weifeng@nifdc.org.cn

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]