經(jīng)典名方枳實(shí)薤白桂枝湯物質(zhì)基準(zhǔn)的量值傳遞研究

徐瑞杰，薛 蓉，梅 茜，宮靜雯，張 倩，婁 悅，趙曉莉，許金國，嚴(yán)國俊，陸兔林，毛春芹

經(jīng)典名方枳實(shí)薤白桂枝湯物質(zhì)基準(zhǔn)的量值傳遞研究

徐瑞杰，薛 蓉，梅 茜，宮靜雯，張 倩，婁 悅，趙曉莉，許金國，嚴(yán)國俊，陸兔林*，毛春芹*

南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023

建立經(jīng)典名方枳實(shí)薤白桂枝湯（Zhishi Xiebai Guizhi Decoction，ZXGD）基準(zhǔn)樣品的HPLC特征圖譜并對(duì)其進(jìn)行多成分含量測定，研究ZXGD物質(zhì)基準(zhǔn)量值傳遞規(guī)律，為復(fù)方制劑研究奠定基礎(chǔ)。制備20批ZXGD基準(zhǔn)樣品，建立其特征圖譜，明確其特征峰并對(duì)其進(jìn)行特征峰的歸屬；對(duì)ZXGD基準(zhǔn)樣品進(jìn)行多成分含量測定，分析主要成分從飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)的傳遞規(guī)律。20批ZXGD基準(zhǔn)樣品的特征圖譜相似度均大于0.93，共匹配得到11個(gè)特征峰，分別來自于方中枳實(shí)（峰1、3～5、9）、厚樸（峰2、10、11）、桂枝（峰6～8）；各指標(biāo)性成分的含量范圍及飲片-基準(zhǔn)樣品的平均轉(zhuǎn)移率分別為辛弗林0.46%～0.85%和103.80%，橙皮苷0.58%～1.07%和42.36%，肉桂酸0.025%～0.047%和105.53%，桂皮醛0.09%～0.17%和5.40%，厚樸酚與和厚樸酚0.005 6%～0.010 3%和0.23%。采用HPLC特征圖譜和多成分含量測定對(duì)ZXGD物質(zhì)基準(zhǔn)的量值傳遞規(guī)律進(jìn)行研究，該方法科學(xué)合理，且明確了飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)的傳遞規(guī)律，實(shí)現(xiàn)了對(duì)經(jīng)典名方ZXGD開發(fā)研究的全過程質(zhì)量控制。

經(jīng)典名方；枳實(shí)薤白桂枝湯；基準(zhǔn)樣品；物質(zhì)基準(zhǔn)；特征圖譜；量值傳遞；枳實(shí)；厚樸；桂枝；辛弗林；橙皮苷；肉桂酸；桂皮醛；厚樸酚；和厚樸酚

枳實(shí)薤白桂枝湯（Zhishi Xiebai Guizhi Decotion，ZXGD）來源于東漢張仲景的《金匱要略》[1]，全方共由枳實(shí)、薤白、桂枝、瓜蔞、厚樸5味藥組成，主要治療胸痹等疾病?，F(xiàn)代臨床上主要應(yīng)用于心腦血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)以及呼吸系統(tǒng)等方面疾病，其對(duì)冠心病、心絞痛、高脂血癥、功能性消化不良、肺栓塞等都有一定的治療作用[2-7]。近年來，國家大力支持古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑的開發(fā)，對(duì)于經(jīng)典名方的申報(bào)可免臨床研究資料，雖然與其他復(fù)方制劑的開發(fā)過程相比減少了臨床研究，但對(duì)其質(zhì)量控制方面卻有著嚴(yán)格的要求。而特征圖譜和多成分含量測定是對(duì)經(jīng)典名方質(zhì)量控制研究的2個(gè)重要手段，特征圖譜結(jié)合多成分含量測定可較為全面地對(duì)經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)的量值傳遞過程進(jìn)行分析，從而對(duì)經(jīng)典名方的質(zhì)量控制提供參考價(jià)值[8-10]。

目前，針對(duì)ZXGD的報(bào)道主要集中于其藥理作用和臨床相關(guān)應(yīng)用，對(duì)于其質(zhì)量控制研究較少[11-14]，通過建立ZXGD特征圖譜且結(jié)合多成分含量測定的研究還未見報(bào)道。為了進(jìn)一步推進(jìn)經(jīng)典名方ZXGD中藥復(fù)方制劑的研究應(yīng)用，根據(jù)國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑物質(zhì)基準(zhǔn)的申報(bào)資料要求》[15]，開展有關(guān)ZXGD的特征圖譜、多成分含量測定及物質(zhì)基準(zhǔn)的量值傳遞研究[16-18]。通過對(duì)國家發(fā)布的古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息的考證[19]，并結(jié)合具體情況研制ZXGD基準(zhǔn)樣品，通過特征圖譜及指標(biāo)成分的含量測定對(duì)ZXGD飲片-基準(zhǔn)樣品研究全過程進(jìn)行質(zhì)量控制。為下一步進(jìn)行ZXGD中藥復(fù)方制劑的研究奠定基礎(chǔ)，也為古代經(jīng)典名方的開發(fā)與利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LC-20AD型高效液相色譜儀，日本Shimadzu公司，包括LC-20AD溶劑輸送泵，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20AC柱溫箱，SPD-M20A紫外-可見檢測器，CBM-20A色譜數(shù)據(jù)工作站；FA1104N型電子分析天平，上海菁海儀器有限公司；MS-105DU型電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；KQ-500B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；AE-1106A型多功能紅外爐，中山市愛米生活電器有限公司；FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)，上海利聞科學(xué)儀器有限公司。

1.2 材料

枳實(shí)、厚樸、薤白、桂枝、瓜蔞5味藥材購于雷允上藥業(yè)有限公司，均來源于道地產(chǎn)區(qū)或主產(chǎn)區(qū)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定，5味藥材的基原分別為蕓香科柑橘屬植物酸橙L.的干燥幼果、木蘭科木蘭屬植物厚樸Rehd.et Wils.的干燥干皮、百合科蔥屬植物小根蒜Bge.的干燥鱗莖、樟科樟屬植物肉桂Presl的干燥嫩枝、葫蘆科栝樓屬植物栝樓Maxim.的干燥成熟果實(shí)。每味藥材共采購5批，參照《中國藥典》2020年版進(jìn)行炮制，每批藥材炮制得3批飲片，因此得枳實(shí)、厚樸、薤白、桂枝、瓜蔞各15批飲片。

對(duì)照品辛弗林（批號(hào)110727-201809，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%）、和厚樸酚（批號(hào)110730-201614，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.3%）、厚樸酚（批號(hào)110729-201714，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100.0%）、桂皮醛（批號(hào)110710-201821，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%）、橙皮苷（批號(hào)110721-201818，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.2%）、肉桂酸（批號(hào)110786-201604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.8%），均購自中國食品藥品檢定研究院。

甲醇，分析純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司；甲醇，色譜純，江蘇漢邦科技有限公司；娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；乙腈，色譜純，德國Merck公司；磷酸，色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 20批ZXGD基準(zhǔn)樣品的制備

根據(jù)對(duì)《金匱要略》中記載的ZXGD的處方原文和國家發(fā)布的關(guān)鍵信息進(jìn)行考證，并通過對(duì)浸泡時(shí)間、加蓋與否、濾過方式等因素進(jìn)行考察，最終確定ZXGD基準(zhǔn)樣品的制備工藝。

取枳實(shí)9 g、厚樸12 g，置陶瓷鍋中，加水1000 mL，浸泡60 min，以武火煮沸后，轉(zhuǎn)文火繼續(xù)煎煮至400 mL，2層紗布趁熱濾過。取薤白24 g、桂枝3 g、瓜蔞15 g，置于上述濾液中，浸泡60 min，武火沸騰后，轉(zhuǎn)文火繼續(xù)煎煮至100 mL，2層紗布濾過，濾液放冷至室溫。取濾液至?80 ℃冰箱預(yù)凍12 h后，放入冷凍干燥機(jī)，于?54 ℃、0.74 Pa真空度冷凍干燥為凍干粉，即得。

同法制備單味飲片及缺單味藥陰性樣品。

將枳實(shí)、厚樸、薤白、桂枝、瓜蔞各15批次飲片隨機(jī)組合形成20批次基準(zhǔn)樣品，編號(hào)為ZXGD1～ZXGD20，具體批次組合信息見表1。

2.2 ZXGD基準(zhǔn)樣品特征圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～7 min，1%乙腈；7～8 min，1%～5%乙腈；8～12 min，5%～15%乙腈；12～30 min，15%～20%乙腈；30～40 min，20%乙腈；40～50 min，20%～25%乙腈；50～51 min，25%～26%乙腈；51～65 min，26%～27%乙腈；65～68 min，27%～30%乙腈；68～70 min，30%～45%乙腈；70～75 min，45%乙腈；75～79 min，45%～65%乙腈；79～96 min，65%～95%乙腈；體積流量為1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長為290 nm；進(jìn)樣量10 μL。

表1 20批ZXGD基準(zhǔn)樣品隨機(jī)組合信息

Table 1 Information table of random combination of 20 batches of ZXGD reference samples

編號(hào)枳實(shí)厚樸薤白桂枝瓜蔞 ZXGD1ZS-M1811004-3HP180612-2XB180321-3GZ-181014-2GL181016-3 ZXGD2ZS-M1811004-1HP180609-2XB180322-3GZ-181012-3GL181015-3 ZXGD3ZS-M1811004-1HP180610-1XB180322-3GZ-181014-3GL181016-3 ZXGD4ZS-M1811004-3HP180611-1XB180322-3GZ-181011-1GL181019-1 ZXGD5ZS-M1811002-3HP180612-3XB180323-2GZ-181015-1GL181018-2 ZXGD6ZS-M1811005-2HP180609-2XB180324-1GZ-181013-3GL181015-1 ZXGD7ZS-M1811001-3HP180609-2XB180323-2GZ-181011-2GL181018-1 ZXGD8ZS-M1811003-2HP180611-3XB180320-2GZ-181011-3GL181019-3 ZXGD9ZS-M1811005-1HP180610-1XB180323-3GZ-181014-1GL181016-1 ZXGD10ZS-M1811004-1HP180612-2XB180320-2GZ-181015-1GL181018-3 ZXGD11ZS-M1811001-3HP180612-3XB180320-3GZ-181013-1GL181016-2 ZXGD12ZS-M1811003-2HP180608-1XB180323-3GZ-181014-2GL181019-1 ZXGD13ZS-M1811004-3HP180610-1XB180322-2GZ-181013-3GL181017-3 ZXGD14ZS-M1811002-3HP180608-2XB180321-2GZ-181015-1GL181019-3 ZXGD15ZS-M1811002-2HP180608-3XB180321-1GZ-181013-2GL181019-3 ZXGD16ZS-M1811004-3HP180608-3XB180322-2GZ-181015-3GL181015-3 ZXGD17ZS-M1811004-3HP180608-3XB180322-2GZ-181015-3GL181015-3 ZXGD18ZS-M1811004-3HP180608-3XB180322-2GZ-181015-3GL181015-3 ZXGD19ZS-M1811004-3HP180608-3XB180322-2GZ-181015-3GL181015-3 ZXGD20ZS-M1811004-3HP180608-3XB180322-2GZ-181015-3GL181015-3

2.2.2 供試品溶液的制備 取10 mL煎煮液對(duì)應(yīng)的凍干粉，置50 mL量瓶中，加甲醇40 mL，加蒸餾水至刻度，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率500 W、頻率40 kHz）20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取編號(hào)為ZXGD1的基準(zhǔn)樣品1份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以橙皮苷為參照峰，計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.28%，相對(duì)峰面積RSD均小于4.88%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取編號(hào)為ZXGD1的基準(zhǔn)樣品一份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。以橙皮苷為參照峰，計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.31%，相對(duì)峰面積RSD均小于3.56%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取編號(hào)為ZXGD1的基準(zhǔn)樣品一份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以橙皮苷為參照峰，計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.29%，相對(duì)峰面積RSD均小于3.62%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 特征峰的指認(rèn) 按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備20批供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄20批色譜圖。將20批ZXGD基準(zhǔn)樣品特征圖譜以AIA格式導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，以S1為參照?qǐng)D譜，采用平均數(shù)法，時(shí)間窗設(shè)為0.5，并計(jì)算相似度。20批ZXGD（ZXGD1～ZXGD20）基準(zhǔn)樣品特征圖譜的相似度分別為0.961、0.959、0.960、0.966、0.941、0.969、0.955、0.972、0.936、0.942、0.957、0.955、0.950、0.959、0.976、0.935、0.941、0.962、0.961、0.968，特征圖譜相似度均大于0.93，表明ZXGD的質(zhì)量穩(wěn)定均一，各批次間物質(zhì)群較為穩(wěn)定，特征圖譜疊加圖見圖1。

ZXGD基準(zhǔn)樣品特征圖譜共標(biāo)定了11個(gè)特征峰，通過與對(duì)照品色譜峰進(jìn)行比對(duì)，指認(rèn)到6個(gè)特征峰，其中1號(hào)峰為辛弗林、4號(hào)峰為橙皮苷、6號(hào)峰為肉桂酸、7號(hào)峰為桂皮醛、10號(hào)峰為和厚樸酚、11號(hào)峰為厚樸酚，混合對(duì)照品及ZXGD基準(zhǔn)樣品特征圖譜見圖2。ZXGD基準(zhǔn)樣品特征圖譜中有11個(gè)特征峰，其中6個(gè)峰（峰1、4、6、7、10、11）分別與相應(yīng)的參照物保留時(shí)間相同，以橙皮苷參照物峰相應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算其余特征峰的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5%之內(nèi)。規(guī)定值為0.52（峰2）、0.91（峰3）、1.51（峰5）、1.94（峰8）、2.08（峰9）。

2.2.7 飲片-基準(zhǔn)樣品特征峰的傳遞 對(duì)ZXGD基準(zhǔn)樣品中特征峰從飲片到基準(zhǔn)樣品的傳遞規(guī)律進(jìn)行分析。枳實(shí)、厚樸、桂枝單味飲片及缺單味飲片陰性樣品的特征圖譜分別見圖3。對(duì)ZXGD基準(zhǔn)樣品中特征峰進(jìn)行歸屬，其中1（辛弗林）、3、4（橙皮苷）、5、9號(hào)峰歸屬于枳實(shí)；2、10（和厚樸酚）、11（厚樸酚）號(hào)峰歸屬于厚樸；6（肉桂酸）、7（桂皮醛）、8號(hào)峰歸屬于桂枝。大部分色譜峰具有良好的傳遞性，且歸屬關(guān)系清晰，飲片中的物質(zhì)群能夠較為穩(wěn)定的向基準(zhǔn)樣品中傳遞。

2.3 ZXGD基準(zhǔn)樣品多成分含量測定

2.3.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.05%磷酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫：0～7 min，1%乙腈；7～8 min，1%～5%乙腈；8～12 min，5%～15%乙腈；12～30 min，15%～20%乙腈；30～40 min，20%乙腈；40～50 min，20%～25%乙腈；50～51 min，25%～26%乙腈；51～65 min，26%～27%乙腈；65～68 min，27%～30%乙腈；68～70 min，30%～45%乙腈；70～75 min，45%乙腈；75～79 min，45%～65%乙腈；79～96 min，65%～95%乙腈；體積流量為1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長為214 nm（辛弗林）、290 nm，進(jìn)樣量10 μL。

圖1 20批ZXGD基準(zhǔn)樣品HPLC特征圖譜疊加圖

1-辛弗林 4-橙皮苷 6-肉桂酸 7-桂皮醛 10-和厚樸酚 11-厚樸酚

圖3 ZXGD特征峰傳遞圖譜

2.3.2 供試品溶液的制備 與“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法一致。

2.3.3 對(duì)照品溶液的制備 取辛弗林、橙皮苷、肉桂酸、桂皮醛、和厚樸酚、厚樸酚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為600.96、506.00、10.10、24.78、2.14、4.00 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.3.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按照2、4、6、8、16的倍數(shù)進(jìn)行倍比稀釋，以甲醇為溶劑制成系列混合對(duì)照品溶液。按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄各指標(biāo)成分峰面積，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），進(jìn)行線性回歸分析。得到回歸方程及線性范圍分別為辛弗林＝2 493.47－46 034.63，＝0.999 7，線性范圍37.56～600.96 μg/mL；橙皮苷＝15 493.88－42 649.10，＝0.999 8，線性范圍31.63～506.00 μg/mL；肉桂酸＝66 637.13－ 10 059.70，＝0.999 8，線性范圍0.63～10.10 μg/mL；桂皮醛＝105 449.40＋49 387.90，＝0.999 1，線性范圍1.55～24.78 μg/mL；和厚樸酚＝17 489.30－154.06，＝0.999 8，線性范圍0.13～2.14 μg/mL；厚樸酚＝14 415.17－366.31，＝0.999 9，線性范圍0.25～4.00 μg/mL；結(jié)果表明，6種指標(biāo)成分在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系較好。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取編號(hào)為ZXGD1的基準(zhǔn)樣品一份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各成分峰面積。計(jì)算辛弗林、橙皮苷、肉桂酸、桂皮醛、和厚樸酚、厚樸酚含量的RSD值，分別為0.41%、0.54%、1.23%、0.26%、1.95%、3.72%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取編號(hào)為ZXGD1的基準(zhǔn)樣品一份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄各成分峰面積。計(jì)算辛弗林、橙皮苷、肉桂酸、桂皮醛、和厚樸酚、厚樸酚含量的RSD值，分別為0.58%、1.19%、2.48%、0.60%、1.60%、2.94%，表明供試品溶液24 h穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取編號(hào)為ZXGD1的基準(zhǔn)樣品一份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄各成分峰面積。計(jì)算辛弗林、橙皮苷、肉桂酸、桂皮醛、和厚樸酚、厚樸酚含量的RSD值，分別為2.35%、1.80%、1.74%、2.86%、3.57%、3.00%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取5 mL已知含量的ZXGD基準(zhǔn)樣品對(duì)應(yīng)的凍干粉，共取6份，分別加入與其各成分含量相等的對(duì)照品（辛弗林對(duì)照品3.08 mg、橙皮苷對(duì)照品3.8 mg、肉桂酸對(duì)照品0.05 mg、桂皮醛對(duì)照品0.25 mg、和厚樸酚對(duì)照品0.017 mg、厚樸酚對(duì)照品0.085 mg），按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄各指標(biāo)成分峰面積，并計(jì)算加樣回收率。辛弗林、橙皮苷、肉桂酸、桂皮醛、和厚樸酚、厚樸酚含量的RSD值分別為1.60%、0.39%、1.22%、1.68%、1.34%、2.52%，各成分的平均加樣回收率分別為102.60%、101.70%、103.29%、98.63%、100.53%、101.46%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.3.9 多成分含量測定 按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備20批ZXGD供試品溶液，并按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，對(duì)20批ZXGD基準(zhǔn)樣品進(jìn)行含量測定，混合對(duì)照品和基準(zhǔn)樣品的色譜圖見圖4，多成分含量測定結(jié)果見表2。20批ZXGD基準(zhǔn)樣品中各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為辛弗林0.35%～0.87%；橙皮苷0.62%～1.00%；肉桂酸0.029%～0.043%；桂皮醛0.10%～0.17%；厚樸酚與和厚樸酚0.003 3%～0.016 1%。根據(jù)《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑及其物質(zhì)基準(zhǔn)的申報(bào)資料要求》中含量測定的波動(dòng)范圍一般不超過均值的70%～130%，因此，暫定ZXGD基準(zhǔn)樣品中各成分的含量范圍為辛弗林0.46%～0.85%，橙皮苷0.58%～1.07%，肉桂酸0.025%～0.047%，桂皮醛0.09%～0.17%，厚樸酚與和厚樸酚0.005 6%～0.010 3%。

1-辛弗林 2-橙皮苷 3-肉桂酸 4-桂皮醛 5-和厚樸酚 6-厚樸酚

2.4 量值傳遞關(guān)系研究

20批ZXGD基準(zhǔn)樣品和對(duì)應(yīng)飲片中指標(biāo)成分含量測定結(jié)果及轉(zhuǎn)移率見表3。20批ZXGD基準(zhǔn)樣品中辛弗林質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.46%～0.85%，平均轉(zhuǎn)移率為103.80%；橙皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.58%～1.07%，平均轉(zhuǎn)移率為42.36%；肉桂酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.025%～0.047%，平均轉(zhuǎn)移率為105.53%；桂皮醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.09%～0.17%，平均轉(zhuǎn)移率為5.40%；厚樸酚與和厚樸酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)總量為0.005 6%～0.010 3%，平均轉(zhuǎn)移率為0.23%。

根據(jù)相關(guān)規(guī)定，不同批次基準(zhǔn)樣品的轉(zhuǎn)移率也應(yīng)在其均值的70%～130%，在本研究中辛弗林、橙皮苷、肉桂酸和桂皮醛4個(gè)成分的轉(zhuǎn)移率基本都在其均值的70%～130%，說明前期枳實(shí)和桂枝的飲片及基準(zhǔn)樣品的制備工藝相對(duì)穩(wěn)定可行。但是部分批次中厚樸酚與和厚樸酚的轉(zhuǎn)移率超出了其均值的70%～130%，考慮到由于厚樸酚與和厚樸酚為木脂素類成分，難溶于水，而ZXGD基準(zhǔn)樣品的制備工藝是加水煎煮，因此在基準(zhǔn)樣品中該類成分含量較小，取其均值的70%～130%，存在的誤差相對(duì)較大，且厚樸各批次間含量差異也較大[20]。因此，在制備ZXGD基準(zhǔn)樣品時(shí)，要嚴(yán)格把控所用原料飲片的質(zhì)量，確定飲片中各成分的標(biāo)準(zhǔn)范圍，保證飲片質(zhì)量的均一和穩(wěn)定。

表2 20批ZXGD基準(zhǔn)樣品含量測定

Table 2 Content determination of 20 batches of ZXGD reference samples

編號(hào)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%編號(hào)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/% 辛弗林橙皮苷肉桂酸桂皮醛厚樸酚與和厚樸酚總量辛弗林橙皮苷肉桂酸桂皮醛厚樸酚與和厚樸酚總量 ZXGD10.800.650.0300.140.005 2ZXGD130.610.620.0340.150.005 0 ZXGD20.580.760.0330.130.004 2ZXGD140.860.890.0390.140.010 4 ZXGD30.680.920.0370.170.003 8ZXGD150.700.820.0290.130.010 4 ZXGD40.730.880.0350.140.011 2ZXGD160.710.850.0390.100.013 0 ZXGD50.680.930.0380.130.012 8ZXGD170.530.840.0420.120.007 8 ZXGD60.530.820.0300.120.005 4ZXGD180.590.990.0340.100.016 1 ZXGD70.691.000.0430.160.005 1ZXGD190.550.780.0400.100.009 8 ZXGD80.690.850.0400.140.003 3ZXGD200.650.770.0360.120.009 0 ZXGD90.540.820.0360.120.006 2均值0.650.820.0360.130.008 0 ZXGD100.350.660.0330.140.004 7均值70%～0.46～0.58～0.025～0.09～0.005 6～ ZXGD110.870.870.0380.120.008 5130%0.851.070.0470.170.010 3 ZXGD120.700.770.0390.120.007 2

表3 ZXGD基準(zhǔn)樣品指標(biāo)成分含量測定及轉(zhuǎn)移率

Table 3 Content and transfer rate of indicator components in ZXGD

編號(hào)辛弗林/%橙皮苷/%肉桂酸/%桂皮醛/%厚樸酚與和厚樸酚/% 飲片基準(zhǔn)樣品轉(zhuǎn)移率飲片基準(zhǔn)樣品轉(zhuǎn)移率飲片基準(zhǔn)樣品轉(zhuǎn)移率飲片基準(zhǔn)樣品轉(zhuǎn)移率飲片基準(zhǔn)樣品轉(zhuǎn)移率 ZXGD10.700.80114.292.010.6532.340.0310.03096.772.430.145.764.070.005 20.13 ZXGD20.720.5880.561.940.7639.180.0280.033117.862.380.135.463.080.004 20.14 ZXGD30.720.6894.441.940.9247.420.0290.037127.592.210.177.692.080.003 80.18 ZXGD40.700.73104.292.010.8843.780.0310.035112.902.430.145.763.170.011 20.35 ZXGD50.540.68125.931.860.9350.000.0420.03890.482.610.134.984.010.012 80.32 ZXGD60.550.5396.361.730.8247.400.0290.030103.452.410.124.983.080.005 40.18 ZXGD70.620.69111.291.981.0050.510.0300.043143.332.510.166.373.080.005 10.17 ZXGD80.540.69127.782.050.8541.460.0380.040105.262.300.146.093.130.003 30.11 ZXGD90.550.5498.181.770.8246.330.0390.03692.312.470.124.862.080.006 20.30 ZXGD100.720.3548.611.940.6634.020.0420.03378.572.610.145.364.070.004 70.12 ZXGD110.620.87140.321.980.8743.940.0330.038115.152.260.125.314.010.008 50.21 ZXGD120.540.70129.632.050.7737.560.0310.039125.812.430.124.943.010.007 20.24 ZXGD130.700.6187.142.010.6230.850.0290.034117.242.410.156.222.080.005 00.24 ZXGD140.540.86159.261.860.8947.850.0420.03992.862.610.145.365.600.010 40.19 ZXGD150.560.70125.001.860.8244.090.0480.02960.422.330.135.583.740.010 40.28 ZXGD160.700.71101.432.010.8542.290.0360.039108.332.320.104.313.740.013 00.35 ZXGD170.700.5375.712.010.8441.790.0360.042116.672.320.125.173.740.007 80.21 ZXGD180.700.5984.292.010.9949.250.0360.03494.442.320.104.313.740.016 10.43 ZXGD190.700.5578.572.010.7838.810.0360.040111.112.320.104.313.740.009 80.26 ZXGD200.700.6592.862.010.7738.310.0360.036100.002.320.125.173.740.009 00.24 平均值0.640.65103.801.950.8242.360.0350.036105.532.400.135.403.450.008 00.23

3 討論

ZXGD由枳實(shí)、厚樸、薤白、桂枝、瓜蔞5味藥組成，主要用于治療胸痹等癥。為促進(jìn)ZXGD中藥復(fù)方制劑的開發(fā)利用，本實(shí)驗(yàn)從ZXGD基準(zhǔn)樣品特征圖譜及多成分含量測定2個(gè)方面的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，全面分析了ZXGD物質(zhì)基準(zhǔn)的量值傳遞規(guī)律。

本研究在對(duì)特征圖譜及多成分含量測定方法建立過程中，分別考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水溶液等不同體系、不同比例的流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果表明乙腈-0.05%磷酸水溶液為流動(dòng)相，基線平穩(wěn)、色譜峰分離良好；分別考察不同波長，全波長掃描結(jié)果表明在290 nm時(shí)各成分色譜行為良好，在214 nm時(shí)辛弗林色譜峰響應(yīng)較好，雜質(zhì)干擾?。环謩e考察不同柱溫，結(jié)果表明，30 ℃時(shí)辛弗林、肉桂酸色譜峰分離較好。因此，明確流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水溶液，特征圖譜波長為290 nm，含量測定波長為290 nm（橙皮苷、肉桂酸、桂皮醛、厚樸酚與和厚樸酚）、214 nm（辛弗林），柱溫為30 ℃。

特征圖譜及多成分含量測定色譜峰均來自于枳實(shí)、厚樸、桂枝3味藥，薤白和瓜蔞的藥味信息未能很好的體現(xiàn)，可能是由于在本研究中的實(shí)驗(yàn)條件下，薤白和瓜蔞的成分含量較低達(dá)不到定量限或洗脫程序不適合等因素導(dǎo)致。因此目前對(duì)薤白和瓜蔞2味藥的定量分析還存在困難，后期將采用適宜的方法如LC-MS、GC-MS等對(duì)該2味藥進(jìn)一步分析，以較多地體現(xiàn)藥味信息[21-22]，對(duì)ZXGD進(jìn)行全方位的質(zhì)量控制研究。

在對(duì)20批ZXGD基準(zhǔn)樣品的含量測定和轉(zhuǎn)移率分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)辛弗林、橙皮苷、肉桂酸和桂皮醛基本都在其均值的70%～130%，但是厚樸酚與和厚樸酚的含量卻出現(xiàn)了離散數(shù)據(jù)。在對(duì)厚樸飲片進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，同一批厚樸藥材含量有高有低，因此，炮制出的同一批飲片含量也存在差異，而在制備ZXGD基準(zhǔn)樣品時(shí)，每一批基準(zhǔn)樣品僅投料厚樸飲片12 g，投料量較小，也有可能會(huì)導(dǎo)致厚樸飲片取樣不均，從而使得厚樸酚與和厚樸酚的含量出現(xiàn)離散數(shù)據(jù)。其次，厚樸酚與和厚樸酚為木脂素類成分，難溶于水，在基準(zhǔn)樣品中含量較低，計(jì)算其均值的70%～130%就會(huì)出現(xiàn)相對(duì)更大的誤差[23]，因此是否可考慮對(duì)含量高低不同的成分進(jìn)行具體分析，而不是都把范圍限定在其均值的70%～130%，以減少誤差。在后期實(shí)驗(yàn)中可進(jìn)一步嚴(yán)格把控厚樸飲片質(zhì)量，并增加基準(zhǔn)樣品批次的制備，從而降低離散數(shù)據(jù)的影響。

對(duì)于ZXGD基準(zhǔn)樣品的研究是其中藥復(fù)方制劑研究中的關(guān)鍵，同時(shí)也是經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑“遵古”的體現(xiàn)，而物質(zhì)基準(zhǔn)是包含了基準(zhǔn)樣品中飲片質(zhì)量、制備工藝穩(wěn)定性等信息的標(biāo)準(zhǔn)[24]。本研究通過對(duì)ZXGD物質(zhì)基準(zhǔn)的量值傳遞規(guī)律進(jìn)行分析，明晰了飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)的傳遞規(guī)律，能更好地指導(dǎo)原料飲片的質(zhì)量控制，為確保ZXGD基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量穩(wěn)定提供有效手段，同時(shí)也為后續(xù)ZXGD復(fù)方制劑的研究，實(shí)現(xiàn)全過程的質(zhì)量控制奠定有力基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research on quantitative transmitting of classical prescription Zhishi Xiebai Guizhi Decoction substance benchmarks

XU Rui-jie, XUE Rong, MEI Xi,GONG Jing-wen, ZHANG Qian, LOU Yue, ZHAO Xiao-li, XU Jin-guo, YAN Guo-jun, LU Tu-lin, MAO Chun-qin

School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

To establish the HPLC characteristic map of the reference samples of the classical prescription Zhishi Xiebai Guizhi Decoction (ZXGD, 枳實(shí)薤白桂枝湯) and to determine the content of its multi-components, to study the transfer rule of the substance benchmark value of ZXGD, for the follow-up study of Chinese medicine compound preparations lay the foundation.Twenty batches of ZXGD reference samples were prepared, and their characteristic map was established, its characteristic peaks was clarified and assigned to the characteristic peaks; Multi-component content determination on the reference samples of ZXGD was carried out, and the transfer law of main components were analyzed from the decoction pieces to the substance benchmark.The similarities of the characteristic maps of the 20 batches of ZXGD reference samples were all greater than 0.93, and a total of 11 characteristic peaks were matched, which were from Zhishi (, peaks 1, 3—5, 9), Houpo (, peaks 2, 10, 11), Guizhi (, peaks 6—8); The content range of each index component and the average transfer rate of decoction pieces-reference samples were 0.46%—0.85% and 103.80% for synephrine, respectively, hesperidin 0.58%—1.07% and 42.36%, cinnamic acid 0.025%—0.047% and 105.53%, cinnamaldehyde 0.09%—0.17% and 5.40%, magnolol and honokiol 0.005 6%—0.010 3% and 0.23%.The HPLC characteristic map and multi-component content determination are used to study the quantity value transfer law of ZXGD.The whole process quality control of the development and research of classical prescription ZXGD.

classic prescriptions; Zhishi Xiebai Guizhi Decoction; reference samples; substance benchmark; characteristic chromatogram; quantitative transmitting;;;; synephrine; hesperidin;cinnamon acid;cinnamaldehyde; magnolol; honokiol

R283.6

A

0253 - 2670(2022)09 - 2650 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.09.007

2021-11-22

2018國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFC1707000）

徐瑞杰，碩士研究生，主要從事中藥炮制及中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail: xuruijier@126.com

通信作者：毛春芹，正高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事新藥研發(fā)及中藥質(zhì)量研究。E-mail:300555@njucm.edu.cn

陸兔林，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥炮制及中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail: ltl2021@njucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]