響應(yīng)曲面法優(yōu)化西藏黑青稞中多酚提取工藝

次仁德吉

（西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測研究所，西藏 拉薩 850032）

青稞是一種能夠適應(yīng)高原極端氣候的糧食作物，其生長史可追溯久遠(yuǎn)。作為一種具有強烈地域特色的高原麥類作物，青稞的營養(yǎng)價值相較于其他谷物較大，具有高蛋白、高纖維、低脂肪、低糖的特征，這符合當(dāng)代人們的健康飲食結(jié)構(gòu)。隨著人們對膳食中多酚含量的重視，富含多酚物質(zhì)的產(chǎn)品在市場上得到較多推廣。麥類作物因含豐富的多酚（也稱植物單寧），被認(rèn)為是具有促進健康的潛在功能谷物。植物多酚在植物體內(nèi)廣泛存在，比如植物的皮、葉、根、果中。多酚物質(zhì)是植物體內(nèi)復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物，屬于天然有機化合物，作為一類儲量豐富的可再生綠色資源，能夠提高果蔬類及其他可食用植物的感官品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)。目前，已發(fā)現(xiàn)的植物酚類化合物超過8 000 種，大多數(shù)分布于水果和藥用植物中，如茶葉、金銀花、葡萄等，此外還分布于青稞、燕麥、小米等谷類作物中。這些酚類物質(zhì)有多種不同的分類方法，在植物中多酚類化合物可分為簡單酚、黃酮類、木脂素類、酚酸類衍生物和香豆素類等。研究發(fā)現(xiàn)，多酚類物質(zhì)可以清除體內(nèi)自由基的酚羥基，這類物質(zhì)可阻止體內(nèi)細(xì)胞氧化損傷；營養(yǎng)學(xué)研究表明，多酚在抗癌、降血糖、降血脂、防止心血管疾病及抗菌等生物活性、藥理學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著巨大的藥理作用。

由于青藏高原地大面廣，不同地域因獨特的地理環(huán)境，所培育出的青稞品種也較不同，大致以白色青稞、紫色青稞、黑色青稞及藍(lán)色青稞4 個種類來區(qū)分，其中黑青稞較其他種類的青稞富含多酚、花青素等活性物質(zhì)，具備了較為獨特的食用功效。Gong 等研究發(fā)現(xiàn)，相較于白色青稞，有色青稞中的多酚含量相對較高。夏陳等在對不同品種青稞總多酚含量的比較中發(fā)現(xiàn)，除98029 黑青稞外，產(chǎn)于同一地域的青稞中深色青稞的多酚含量遠(yuǎn)高于淺色青稞，但對于黑青稞中多酚提取工藝的優(yōu)化等方面的研究較少。研究表明，多酚提取條件的不同，對于多酚含量多少存在影響。因此本研究在比較5 種藏區(qū)主推青稞品種籽粒中的多酚含量后，最終確定以含量相對較高的黑青稞為研究對象，采用響應(yīng)曲面法，探索最佳提取條件，旨在優(yōu)化青稞多酚提取工藝，為黑青稞實際應(yīng)用及產(chǎn)品開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

黑青稞與紫青稞，均購自西藏山南隆子縣；藏青25，取自西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院4 號實驗地；喜拉22，購自日喀則白朗縣；藏青2000，取自西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院4 號實驗地。

試劑（優(yōu)級純）：95%乙醇、沒食子酸、福林酚、無水碳酸鈉，均購自于成都科隆化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

TV-1901 紫外可見分光光度計，購自于上海美普達(dá)儀器有限公司；3-18KS 離心機，購自于德國SIGMA 公司；CFB 數(shù)顯恒溫水浴鍋，購自于鄭州長城科工貿(mào)有限公司；BS224S-CW 電子天平，購自于德國Sartorius 公司；THZ 電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱，購自于常州普天儀器制造廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。上機測定標(biāo)準(zhǔn)溶液，測得曲線在檢出范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，線性方程為＝0.098 35+0.016 17，式中：X 表示樣品吸光度；表示測得樣品質(zhì)量濃度；決定系數(shù)為0.999 4。結(jié)果見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制及相關(guān)內(nèi)容

1.3.2 多酚含量的測定。選取藏青2000、藏青25、紫青稞、喜拉22、黑青稞，篩選出顆粒較為飽滿的青稞籽粒，將樣品置于60 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，粉碎過50 目篩，干燥密封，保存待測。每個品種稱取1 g，測3 次平行。在一定的條件下，加入一定比例的粉末樣品和乙醇溶劑，水浴冷卻，將提取到的樣液于轉(zhuǎn)速7 000 r/min 下離心5 min，將分層的清液取出，置于棕色瓶內(nèi)，存至冰箱冷藏，以備待測。參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》，以蒸餾水作空白對照，上機在波長765 nm處測定樣品提取液中多酚的質(zhì)量濃度（μg/mL）。

式中：為樣品中多酚的含量，mg/g；為待測溶液質(zhì)量濃度，μg/mL；為提取液總體積，mL；為稀釋因子；為樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 提取工藝的優(yōu)化。以山南隆子黑青稞為試驗對象，準(zhǔn)確稱取1.00 g 青稞粉，以提取時間（30、70、110、150、190 min）、料液比（g∶mL）（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）、提取溫度（30、40、50、60、70℃）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%、80%）為自變量，驗證4 種變量值對黑青稞多酚提取量的影響，每個水平測3 次平行。

響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計。為獲得最佳的工藝條件，本次試驗以優(yōu)化黑青稞中多酚含量的提取工藝為目的，以Box-Behnken 試驗原理，設(shè)計提取時間、料液比、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量，多酚提取量作為因變量（響應(yīng)值），開展試驗，響應(yīng)面因素水平見表2。

表2 Box-Benhnken 設(shè)計試驗因素水平及編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取時間的選擇。根據(jù)提取時間引起多酚含量變化的趨勢圖（圖1）可知，在時間達(dá)到70 min 時多酚提取量達(dá)最大峰值，此后多酚的提取量逐漸降低，趨于平緩。隨著提取時間的推移，黑青稞中多酚的含量先增后減，原因可能是在提取過程中，黑青稞中的多酚物質(zhì)在空氣中分解，使其在達(dá)到一定的峰值后提取量呈緩慢下降趨勢。故設(shè)定提取時間為70 min 最佳。

圖1 提取時間對多酚提取量的影響

2.1.2 料液比的選擇。根據(jù)提取料液比引起多酚含量變化的趨勢圖（圖2）可知，黑青稞中的多酚提取量在料液比（g∶mL）1∶10 至1∶20 的區(qū)間內(nèi)有較為明顯的變化。隨著溶劑用量的逐步增大，料液比在1∶20 時提取量達(dá)到最高。溶劑用量的選擇對黑青稞多酚提取量存在影響，料液比（g∶mL）超過1∶20 時，黑青稞中多酚提取量呈緩慢下降趨勢。其原因在于黑青稞中多酚物質(zhì)在乙醇溶劑中的溶解度是一定的，料液比會影響溶液的黏度和濃度。當(dāng)料液比較小時，溶液黏度大，多酚物質(zhì)不易擴散，提取率小；當(dāng)其逐漸升高時，由于有濃度差，因此擴散快，提取率變高；當(dāng)溫度升高到一定時，因濃度差變小，提取率趨于平衡。故選擇1∶20 為最適宜的料液比（g∶mL），以為后期節(jié)約成本。

圖2 料液比對多酚提取量的影響

2.1.3 提取溫度的選擇。根據(jù)提取溫度引起多酚含量變化的趨勢圖（圖3）可知，隨著溫度的升高，黑青稞中多酚的提取量也隨之提高，當(dāng)提取溫度達(dá)50℃時，黑青稞多酚提取量高于其余4 個設(shè)定的溫度，這可能是溫度的變化導(dǎo)致黑青稞中多酚物質(zhì)分子間動能變大，使分子距離也變大，多酚物質(zhì)得到降解或揮發(fā)。為節(jié)約工藝成本，故選擇提取最佳溫度為50 ℃。

圖3 提取溫度對多酚提取量的影響

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇。根據(jù)乙醇體積分?jǐn)?shù)引起多酚含量變化的趨勢圖（圖4）可知，多酚的提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化，呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時，黑青稞中多酚的提取量達(dá)到最大，而后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，提取量反而呈現(xiàn)減少趨勢。這可能與高濃度溶質(zhì)的水解產(chǎn)物對多酚物質(zhì)進一步水解抑制的能力強于低濃度溶劑有關(guān)，故浸提的乙醇體積分?jǐn)?shù)應(yīng)選50%為宜。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取量的影響

2.2 響應(yīng)曲面法分析優(yōu)化黑青稞多酚提取工藝

2.2.1 Box-Benhnken 試驗設(shè)計。參考得到的單因素預(yù)試驗結(jié)果，設(shè)計響應(yīng)面時零水平因素分別為提取時間70 min、料液比（g∶mL）1∶20、提取溫度50 ℃和乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，以黑青稞多酚物質(zhì)的提取量為響應(yīng)值，設(shè)計BBD 四因素三水平試驗。

2.2.2 試驗?zāi)Ｐ偷慕?。運用Design-Expert 8.06 對所得試驗結(jié)果進行多元回歸擬合，獲得黑青稞多酚物質(zhì)得率（）與4 個因素的多元回歸方程：=-11.732 76+0.043 782A+0.732 9B+0.180 88C+0.043833D- 2.5×10AB- 4.125×10AC- 1.5×10AD+2.05×10BC - 1.15×10BD + 1.075×10CD -8.921 87 A- 0.017 9B- 2.527 5×10C- 6.025×10D。試驗分析結(jié)果見表3。

表3 Box-Benhnken 設(shè)計表及試驗結(jié)果

2.2.3 數(shù)據(jù)模型方差分析。根據(jù)表4 的方差分析結(jié)果，模型中響應(yīng)變量與回歸變量得到的方程分析結(jié)果顯著（＜0.000 1）。模型（＜0.05）失擬不顯著，說明本次試驗的二次模型擬合程度良好；決定系數(shù)（）為0.965 4，變異系數(shù)（）為1.56%，信噪比為19.162，說明該方程擬合程度很高，數(shù)據(jù)合乎真實的試驗結(jié)果，可將其用于本次試驗工藝優(yōu)化條件的預(yù)測分析。結(jié)合表4 檢驗各個回歸系數(shù)顯著性，比較值可得到影響因素的程度大小，依次為料液比＞時間＞溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（B＞A＞C＞D）。由圖5—7 可知，AC（提取時間和溫度）、BC（料液比和提取溫度）、CD（提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)）兩兩不同條件間交互作用顯著。

圖5 提取溫度和時間對多酚提取量的影響

表4 方差分析表

2.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化三維圖分析。分析各提取條件交互作用下黑青稞多酚提取量的響應(yīng)面及等高線圖可知，分別有3 組提取條件（AC、BC、CD）兩兩交互作用顯著，響應(yīng)曲面陡峭且等高線趨于橢圓狀；比較分析圖8—10，發(fā)現(xiàn)交互作用不明顯。以黑青稞中多酚提取量較大為目標(biāo)，擬合方程求解得到的4 個因素最佳提取條件為：提取時間70 min，料液比（g∶mL）1∶21.15，提取溫度49.66 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)51.79%。在此條件下，青稞多酚提取量最高可達(dá)到3.098 mg/g。為方便試驗操作，將預(yù)測值修正至提取時間70 min，料液比（g∶mL）1∶20，提取溫度50℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。平行試驗3 次，得到提取量的平均值為3.03 mg/g，與模型預(yù)測出的值較為接近，說明該模型擬合程度基本符合預(yù)估值，采用響應(yīng)曲面法分析得到的4 個最佳條件準(zhǔn)確可靠。

圖8 提取時間和料液比對多酚提取量的影響

圖6 提取溫度和料液比對多酚提取量的影響

圖7 提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取量的影響

圖9 提取時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取量的影響

圖10 料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取量的影響

2.2.5 5 個青稞品種中多酚含量的差異。由表5 可知，5 個品種青稞的多酚含量變異幅度在1.65～2.96 mg/g，黑青稞及紫青稞中多酚含量較高，這可能與籽粒麩皮的顏色有關(guān)，這一推測與張帥等的研究結(jié)論一致；青稞中總多酚的含量存在差異，也可能與青稞的栽種地域環(huán)境的不同有關(guān)。

表5 5 個品種青稞多酚含量差異

3 討論與結(jié)論

比較藏區(qū)主推品種青稞中多酚含量的差異，可以發(fā)現(xiàn)，黑青稞中多酚的含量高于紫青稞、藏青25、喜拉22、藏青200。該結(jié)論可為優(yōu)化黑青稞中多酚物質(zhì)功能成分的研究提供依據(jù)。

以西藏隆子黑青稞為試驗原料，優(yōu)化黑青稞多酚物質(zhì)的提取工藝，分析得出的最優(yōu)提取條件為：提取時間70 min，料液比（g∶mL）1∶20，提取溫度50 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，得到提取量的均值為3.03 mg/g。

確定單因素試驗對優(yōu)化結(jié)果影響的大小順序：料液比（B）＞時間（A）＞溫度（C）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（D），料液比對于優(yōu)化結(jié)果影響最大，乙醇體積分?jǐn)?shù)對于優(yōu)化結(jié)果影響最小，該結(jié)論與李京城等對隆子黑青稞花色素提取研究中單因素（乙醇體積分?jǐn)?shù)）對于優(yōu)化結(jié)果影響最小的結(jié)論一致，其余因素或因提取物質(zhì)的不同，影響程度不一致，該原因需后期進一步深入研究。